Nghiên cứu khoa học " NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA KEO LÁ TRÀM (ACACIA AURICULIFORMIS) Ở ĐÔNG NAM BỘ BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ SSR "

Chia sẻ: Nguye Nhi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

88
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu đa dạng di truyền giữa 100 cá thể vô tính Keo lá tràm trồng ở Đông Nam bộ đã được tiến hành bằng 33 cặp mồi SSR và 12 mồi RAPD. Kết quả cho thấy biến động di truyền giữa các cá thể là thấp. Kết quả phân tích bằng các mồi RAPD và SSR bằng phần mềm POPGENE cho thấy các cá thể nghiên cứu có thể được chia thành 2 nhóm. Nhóm 1 gồm cá thể số 70 và 71 (QLD). Nhóm 2 gồm 98 cá thể còn lại. Trong nhóm 2 lại được chia...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu khoa học " NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA KEO LÁ TRÀM (ACACIA AURICULIFORMIS) Ở ĐÔNG NAM BỘ BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ SSR "

NGHIÊN CỨU MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA KEO LÁ TRÀM (ACACIA AURICULIFORMIS) Ở ĐÔNG NAM BỘ BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ SSR Vương Đình Tuấn Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ TÓM T ẮT Nghiên cứu đa dạng di truyền giữa 100 cá thể vô tính Keo lá tràm trồng ở Đông Nam bộ đã được tiến hành bằng 33 cặp mồi SSR v à 12 mồi RAPD. Kết quả cho thấy biến động di truyền giữa các cá thể là thấp. Kết quả phân tích bằng các mồi RAPD và SSR bằng phần mềm POPGENE cho thấy các cá thể nghiên cứu có thể được chia thành 2 nhóm. Nhóm 1 gồm cá thể số 70 v à 71 (QLD). Nhóm 2 gồm 98 cá thể còn lại. Trong nhóm 2 lại được chia thành 2 nhóm phụ. Các cá thể có nguồn gốc từ Queensland nằm trong nhóm 1 và nhóm phụ 2b, trong khi các cá thể có nguồn gốc từ Thái Lan nằm trong nhóm phụ 2a. Các cá thể 43, 44, 57 và 58 có chỉ số tương đồng thấp lại được ghi nhận tăng trưởng tốt có thể được chọn làm vật liệu lai tạo. T ừ khóa: Chỉ thị phân tử RAPD, SSR, đa dạng di truyền, Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) I. ĐẶT VẤN ĐỀ Keo lá tràm (Acacia auriculiformis Cunn. Ex. Benth) còn được gọi là Tràm bông vàng, là loài cây mọc nhanh có xuất xứ từ Australia, Papua, New Guinea v à Indonesia. Keo lá tràm được du nhập v ào Việt Nam từ những năm 60 của thế kỉ XX, với mục đích chủ yếu là cung cấp nguồn nguyên liệu cho sản xuất giấy, làm đồ trang trí nội thất, làm than củi,.... Hiện nay, Keo lá tràm được trồng trên hầu hết các tỉnh ở nước ta, nhưng phổ biến là ở các tỉnh miền Trung v à vùng Đông Nam Bộ. Keo lá tràm đóng góp một cách có ý nghĩa trong ngành công nghiệp sản xuất giấy, nghề sản xuất hàng thủ công mỹ nghệ v à góp phần cải thiện thu nhập của nông dân trồng rừng ở nước ta. Vì v ậy việc chọn giống Keo lá tràm có năng suất, chất lượng cao, chống chịu sâu bệnh là một đòi hỏi hết sức cấp thiết đặt ra cho ngành Lâm nghiệp. Hiện nay nghiên cứu chọn giống Keo lá tràm ở Việt Nam chủ yếu được tiến hành theo kỹ thuật chọn tạo truyền thống. Vật liệu chọn làm bố mẹ thường được dựa trên những đánh giá về kiểu hình hay về một số đặc điểm sinh học. Chọn lọc cặp lai theo cách này có nhược điểm là chưa phản ánh đúng bản chất di truyền của cá thể. Vì thế, khó có thể đạt mục tiêu tạo giống. Kỹ thuật đánh giá mối quan hệ di truyền của cây trồng nói chung và một số loài keo nói riêng bằng các chỉ thị phân tử đã được nghiên cứu từ v ài thập niên trở lại đây và đã chỉ ra rằng một số chỉ thị có thể được sử dụng một cách hữu hiệu trong xác định quan hệ di truyền của các cá thể nghiên cứu. Nanda và cộng sự (2004) đã dùng 40 mồi RAPD để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 6 loài keo và ghi nhận có sự biến động cao (70%) về mặt di truyền giữa các loài. Sự tương đồng giữa A. auriculiformis v à A. concinna là 28%. Các tác giả cũng ghi nhận có mối quan hệ rất gần gũi về mặt di truyền giữa các cá thể trong cùng quần thể. W idyatomoko và Shiraishi (2001) đã chọn được 8 chỉ thị trong số 24 chỉ thị RAPD sử dụng để phân biệt Acacia auriculiformis và A. Mangium. Josiah và cộng sự (2008) đã nghiên cứu biến động di truyền của quần thể Acacia senegal bằng 10 mồi RAPD và 5 mồi ISSR. Các tác giả đã ghi nhận 55 phân đoạn đa hình. Số phân đoạn trung bình là 3,6 trên cặp RAPD + ISSR và ghi nhận khoảng 86% biến động di truyền hiện diện bên trong quần thể và điều kiện địa lý cũng góp phần vào những biến động này. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các cá thể Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) trồng ở vùng Đông Nam Bộ. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu nghiên cứu 13
Một trăm cá thể vô tính Keo lá tràm do Trung tâm Sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ trồng khảo nghiệm tại Trạm Thực nghiệm Lâm nghiệp Bầu Bàng, tỉnh Bình Dương được dùng để tách ADN. Các cá thể nghiên cứu gồm 32 cá thể (23; 71b; 131; 132; 133; 135; 136; 137; 138; 140; 142; 144; 145; 147; 148; 150; 151; 152; 158; 159; 162; 163; 166; 167; 168; 169; 170; 172; 175; 176; 177; 178 thuộc v ườn giống ở Sakaerat, Thái Lan (viết tắt là ThL); số 68 cá thể còn lại có nguồn gốc từ Queensland (viết tắt là QLD,Úc). Các cá thể này (1; 1b; 1c; 1f; 1k; 2; 3; 4; 5; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 13; 14; 16; 18; 19; 25; 26; 29; 30; 31; 32; 33; 34; 36; 38; 41; 43; 44; 47; 50; 51; 56; 57; 58; 60; 61; 64; 65; 67; 70; 71; 72; 73; 76; 78; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 91; 92; 94; 97; 99; 100; 103; 104) được trồng năm 2001. Bảng 1. Danh sách mồi microsatellites (SSR) T ên mồi T rình tự nucleotide (5' - 3') Đoạn lặp lại TT Những mồi có đoạn lặp lại là 2 nucleotides CCACCCGTTACCCATTTATG 1 Am008 (TG)14 CCGTGATTGACTCTCAGCG TGAGTCGATCGCTTAGCTTG 2 Am012 (TC)15(AC)7-(AC)10AG TCCCGTTATTATGCCAAAGTG GTACTAACGTTGCTATATGAGAAAGG (ATAC)3(AC)26(AT)3,(GTAT)2 3 Am014 CTGGTTGTTCGCTTATATGG (AT)3AC CACGGCTGTTATTTCCTTCG 4 Am018 (AC)14 GGAAAGAGGTGTGACAGAGGAC GAGGTAATATTTTGAATTCCTTGAAC 5 Am030 (AT)9(GT)15 GGTGTATACCTCTTTCCTGTGG GGACCAAACTTATGCAACACC 6 Am326 (CA)20 GCATCAATGTACTAAACCATTTCC CCATTCGAGCATCCTAAGAG 7 Am341 (CA)12(TA)2 CGTATGGCTGAGCTACTTAATCA CCTCATGTCCTTGAATGTCAC 8 Am352 (TTC)2TA(AC)14 GACTAACCCACAAGGAAGAGTTAC CGCAACTCCATCTGATTTACTG 9 Am367 (A)7G(A)6GG(A)14,(CA)14 TTATGTTGGGTTAATACGCTAACTG CACAAGGAACTGAGCAATGG 10 Am368 (A)9(CA)13 TCTTGCCTAGGTAGATTTTGACC AGACTTCATAAATAAGATGGAAGAGG (TG)11-(TG)6T(TG)5-(TG)6(AG)8- 11 Am384 ATGCCAAATTTTCTTATTGGAG (TG)4 (GAA)3 TGATACAAGGGAAGACAGAGTGG 12 Am387 (AT)2(GT)2(AT)2(GT)17-(TA)8 CCAACTCAAAACCTGACAACG AATCCTTCCGAAAGTTATACATGG 13 Am389 (AT)3(GT)9GC(GT)2 GCACTTGTAAGTCGGAACTGC ATGGACAGTTAATTAGTGATCTGATG 14 Am391 (AT)2(TG)13 GGACTAACCCAGATTCCACC CGGATGAGAAGTGGCATTAGG 15 Am396 (AC)16(AT)6 GCCATCCAGAGTTGAAATTAGC AAGCACTTCTAGATTGGCAGC 16 Am400 (GCA)2(GT)11 CAATAATCTAGAAACTACGGGACTTG AATACATGGAAGAGGATGAGATG 17 Am424 (GT)2(TG)2,A(GT)4,GA,(GT)9 ATTGCATTTCATTTGTTGCC CCTTCTTCTCTCATCTACCAAACC 18 Am429 (GT)16 CCCACATCATCACTCACAACT ACCCTTTATTTCTCACACGGA 19 Am435 (CT)5,CC(CT)2(CA)9,(CACT)3 ACAGAAGAAGATGCAAAGAAGG 14
ATGGATCTTGTCCTTATCTTGA 20 Am436 (TG)14,T GGGCCAATTTGAGTTTGGAA CACTAATTGCTCACACATTCCA 21 Am460 (AT)4,(GT)12,(GGAAT)2,(GT)2 ATTCATAGCCTCTCCCTTCAG AACATCCCTGCCAATAAACA 22 Am463 (CA)11 TCAACTCCGTAGGACCAAAG TGGGTATCACTTCCACCATT 23 Am465 (AC)23 AGGCTGCTTCTTTGTGCAGG GGTCATGGAAGAGGAGAATG 25 Am477 (GT)13 TCTTATACTAGGCTCACAACACTC ACATTATTTCCCTTCAGTCTATATG 25 Am484 (TA)2,TG,(TC)6,(TG)10 GATTTGCTTTATCGTTCTTCTG GTATGAGTTCCAGTCCTACCATCA 26 Am503 (TG)13,(TG)8 CAGTCCGGTTTTTGCTGTCA TAGGCTAATGGTCATATTCCTAG 27 Am041 (GT)36 AGAGATAGGGGTACACACTAAAAAAC CCCATTGCCGTTTCTTTG 28 Am136 (CT)20 GCATTTCCCTTGGAACAGTC ACCCGGACGTATAGAAATAAATACA 29 Am164 (TG)93 CGTGGAGGCAAGCAATATC TTGGATGTCAAGATTTTACGG 30 Am173 (AC)18 CATTAGGCCACGTTTTGATAG Những mồi có đoạn lặp với 3 nucleotides CAAATGGCCAAGTTACGACTG 31 Am502 (TTC)3-(GGA)8, AGA(GGA)2 TTCTGGTAATCCAAACTTATGTGG ATGAGTTTGACCCGACTTGA 32 Am522 (AAT)3-(AGT)2(GGT)7 TGCGTAACACGATTATCCCT CAGAGGTGGCAGATGATGTC 33 Am770 CTC(CAC)5CGC, (CAC)3 AAGCCTTTAGTTGGGCGTTC Bảng 2. Danh sách các mồi RAPD . T ên mồi T rình tự TT Khoảng kích thước (Kbp) 1 OPA 01 5’-CAGGCCCTTC-3’ 0.8–2.9 2 OPA 02 5’-TGCCGAGCTG-3’ 0.2–2.4 3 OPA 09 5’-GGGTAACGCC-3’ 0.3-1.8 4 OPA 20 5’-GTTGCGATCC-3’ 0.6-2.0 5 OPB 17 5’-AGGGAACGAG-3’ 0.5–1.1 6 OPB 20 5’-GGACCCTTAC-3’ 0,2-2,5 7 OPN 05 5’-ACTGAACGCC-3’ 0,3-2,2 8 OPN 07 5’-TGCCGGCTTG-3’ 0.2-2.0 9 OPN 09 5’-TGCCGGCTTG-3’ 0,3-2,2 10 OPN 13 5’-AGCGTCACTC-3’ 0,2-2,2 11 OPN 15 5’-CAGCGACTGT-3’ 0,4-2,6 12 OPN 16 5’-AAGCGACCTG-3’ 0,1-2,1 15
* Hoá chất & Mồi (Primer): gồm 33 mồi microsatellites (dựa theo Butcher et al. 2000) v à 12 mồi RAPD được đặt mua từ hãng Fermentas (Korea). Các hoá chất, phương tiện sử dụng trong nghiên cứu có xuất xứ từ các nước phát triển như Mỹ, Đức, Nhật, Hàn Quốc và Singapore. 2. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết và tinh sạch ADN: Việc tách và tinh sạch ADN từ các lá keo non sử dụng N-Cetyl-N, N, N- TrimethylAmmonium Bromide (CTAB) trong quy trình của Doyle và Doyle (1990) có cải tiến. Chất lượng ADN được xác định trên máy đo quang phổ và điện di trên 1,5% agarose gel và quan sát dưới đèn UV. Dung dịch 0,5X TAE được dùng để pha loãng ADN tới nồng độ sử dụng (5ng/µL). Thanh lọc các cặp mồi RAPD và SSR: Ba mươi ba cặp mồi SSR và 12 mồi RAPD được dùng để thanh lọc 100 mẫu ADN của các cá thể keo nghiên cứu. Những mồi/cặp mồi thể hiện đa hình và băng vạch ADN rõ ràng trên bản gel sẽ được sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền giữa các cá thể. Thực hiện phản ứng nhân gene: Phản ứng nhân gene các mẫu ADN được thực hiện trên máy nhân gene MJ Research 200. Tổng thể tích của mỗi phản ứng là 25µL, trong đó chứa 25ng ADN, 0,2mM mỗi loại dNTP, 0,2 µmol/µl mỗi loại mồi SSR (0,2 µmol/µl mồi RAPD); 1,5mM MgCl2; 1X Taq buffer; và 1U/µl taq polymerase; phần còn lại là nước cất vô trùng. Chương trình thực hiện phản ứng nhân gene được bắt đầu bằng nhiệt độ biến tính ADN ở 940C trong 2 phút, sau đó là 30 chu kỳ với 940C trong 30 giây, nhiệt độ hàn gắn mồi vào sợi ADN là 55-600C trong 30 giây; giai đoạn kéo dài ở 720C trong 1 phút. Bước kéo dài cuối ở 0 72 C là 5 phút. Các phân đoạn ADN được phân giải trên 1,5% agarose gel cùng 1kb thang ADN. Phân tích số liệu: Kết quả thanh lọc với các mồi SSR được phân tích bằng phần mềm POPGENE 32. ver.1.31 (Yeh và cộng sự. 1999) Trong đó các phân đoạn ADN được mã hóa là A hay B v.v.. tùy thuộc v ào vị trí phân đoạn ADN trên gel. Những vị trí không có phân đoạn ADN hay vạch ADN không rõ được ghi là 11 (Yeh và cộng sự. 1999). Chỉ số khác hình mong đợi được tính dựa trên công thức của Nei (1973). Khoảng cách di truyền v à hệ số tương đồng được tính theo công thức của Nei (1978). Biểu đồ hình cây (dendrogram) được tính dựa theo số liệu khoảng cách di truyền của Ne sử dụng phương pháp UPGMA. Chỉ số Shannon I (Shannon’s Information Index) thể hiện sự đa dạng di truyền được tính theo công thức của Lewontin (1972). Đối với các mồi RAPD: Sản phẩm PCR của mồi RAPD được chạy điện di trên 1,5% agarose. Các phân đoạn ADN được phân tích bằng phần mềm NTSYS ver. 2.1 (Rohlf 1992). Các phân đoạn ADN ghi nhận được mã hóa là 1, phân đoạn không ghi nhận được mã hóa là 0. Ma trận phản ánh sự tương đồng được tính theo công thức của Nei & Li (1979). III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Kết quả thanh lọc các mồi RAPD cho thấy trong 12 mồi thử nghiệm, chỉ có 3 mồi: OPA 02, OPA 09 và OPA 20 cho các phân đoạn ADN rõ nét và được sử dụng cho nghiên cứu v à phân tích. Kết quả ghi nhận rằng kích thước các phân đoạn biến thiên từ 600 đến 3700bp trên mồi OPA 02; từ 915-3100bp trên mồi OPA 09 và từ 450-4200bp trên mồi OPA 20. Tổng số phân đoạn ADN khuyếch đại được cũng khác nhau trên các mồi RAPD. Số phân đoạn được khuyếch đại cao nhất trên mồi OPA 02 là 823, ở OPA 09 là 647 và thấp nhất là ở OPA 20 là 577 (bảng 3). Số phân đoạn đa hình tương đối thấp. Ở mồi OPA 02 có 8 phân đoạn đa hình, chiếm tỷ lệ 1,2%. Tỷ lệ đa hình ở mồi OPA 09 và OPA 20 lần lượt là 0,8 và 1,2%. Bảng 3. Kết quả thể hiện đa hình của các mồi RAPD nghiên cứu. T ên mồi Số phân đoạn ADN Số phân đoạn T ỷ lệ đa hình Kích thước TT khuyếch đại đa hình (%) (bp) 1 OPA 02 823 8 1,0 600-3700 2 OPA 09 647 5 0,8 915-3100 3 OPA 20 577 7 1,2 450-4200 Kết quả phân tích quan hệ di truyền bằng chương trình NTSYS: Kết quả phân tích ma trận dựa trên phương pháp của Nei và Li (1979) về hệ số tương đồng cho thấy các cá thể có hệ số tương đồng từ 39 đến 100%. Kết quả ma trận tương đồng cho thấy cá thể số 44 (QLD) có 16
mức độ tương đồng thấp nhất với các cá thể số 12, 13, 11, 7, 18, 14, 19 và 16 (QLD) với hệ số tương đồng từ 39 đến 52%. Trong khi cá thể 152 (ThL) có hệ số tương đồng là 100% với cá thể 132 và 135 (ThL). Kết quả phân tích trên biểu đồ cây cũng cho thấy các cá thể 36, 132, 135, 152, 159, 1b v à 169 có chung cơ sở di truyền. Tương tự, các cá thể số 3 giống với số 5; cá thể số 71 giống với số 72; cá thể số 150, 177 v à 178; cá thể 136 v à 137 có chung nguồn gốc di truyền (từ vườn giống ở Sakaerat, Thái Lan) v à gần gũi với cá thể số 175 ..v.v..Khoảng cách di truyền ngắn nhất là 0% giữa cá thể số 3 và 5; cá thể số 136 và 137; cá thể 150 với 175 và 178; giữa 132 và 136 v.v.. Cá thể số 172 có cùng chung cấu trúc di truyền với cá thể số 162 và có 87% tương đồng với cá thể số 142. Kết quả trên biểu đồ hình cây cho thấy các cá thể keo nghiên cứu được chia thành 2 nhóm chính: nhóm 1 gồm 4 cá thể: 43, 44, 57 và 58 (QLD). Nhóm 2 được chia thành 4 nhóm nhỏ khác. Nhóm 2a gồm 23 cá thể, nhóm 2b gồm 11 cá thể. Nhóm 2c gồm 43 cá thể và nhóm cuối 2d gồm 19 cá thể. Kết quả phân tích ma trận về hệ số tương đồng cho thấy đại đa số các cá thể nghiên cứu đều có hệ số tương đồng >60%, ngoại trừ cá thể 44 có hệ số tương đồng thấp nhất so với các cá thể khác. Theo quan sát hiện trường và những số liệu đo đếm, các cá thể 43, 44, 57 và 58 đều là những cá thể có tỷ lệ tăng trưởng nhanh v à có chỉ số thể tích 3 từ 24 đến 30cm trong cùng điều kiện chăm sóc. Kết quả phân tích ma trận có thể gợi ý việc chọn dòng 43, 44 hay 57, 58 làm v ật liệu lai tạo để có thế hệ con lai mang tính trạng mong muốn. Kết quả sử dụng mồi RAPD trong nghiên cứu này bước đầu cho thấy chỉ thị RAPD đã chỉ ra được quan hệ di truyền của các cá thể nghiên cứu. Chỉ thị RAPD cũng đã được Josiah và cộng sự (2008) sử dụng để đánh giá quan hệ di truyền của bốn quần thể Acacia senegal (L.) Willd. Các tác giả đó chọn được 10 trong số 27 chỉ chị RAPD thanh lọc v à đã ghi nhận sự khác nhau giữa các quần thể là do phân bố địa lý. Vài năm trước đó, Nanda và cộng sự (2004) đã sử dụng 17 chỉ thị RAPD để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 6 loài keo., trong đó Acacia auriculiformis đã được ghi nhận có 28% tương đồng với A. farnesiana v à A. catechu. Gần đây, Nguyễn Trần Nguyên và cộng sự (2004) đã sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá khả năng chịu mặn của 3 xuất xứ Keo lá tràm (A. auriculiformis) và 3 xuất xứ keo tai tượng (A. mangium) và đã ghi nhận mức độ tương đồng của các xuất xứ Keo lá tràm (Sakaerat-Thái lan; đảo Melville v à sông Wenlock ở Queensland, Úc) liên quan đến tính chịu mặn là 65%. Trên cơ sở đó đã gợi ý cho việc chọn vật liệu lai tạo và bảo tồn nguồn gene tốt hơn. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dựa trên kết quả phân tích POPGENE 1.31 Trong số ba mươi ba cặp mồi SSR sử dụng, chỉ có 18 cặp mồi thể hiện rõ các băng, vạch hay phân đoạn ADN nên được sử dụng trong nghiên cứu tiếp theo. Hình 1 và 2 minh họa kết quả phản ứng nhân gene của các cá thể với các cặp mồi Am 389 và Am 384. H.1: Kết quả nhân gene của mồi Am 389. H. 2: Kết quả nhân gene của mồi Am 384 Kết quả phân tích bằng phần mềm POPGENE sản phẩm PCR của 18 cặp mồi SSR với các cá thể keo nghiên cứu cho thấy có 3 loại alen được ghi nhận. Đó là alen A, B và C; trong đó các alen A xuất hiện với tần số cao nhất 93% trên mồi Am 770. Các alen C có tần số xuất hiện thấp nhất là 0,5% trên mồi Am 12. Trong số các alen chủ yếu (A v à B), tần số xuất hiện trung bình của alen A cao hơn tần số xuất hiện của alen B (0,62 so với 0,38%). Các alen C có tần số xuất hiện thấp nhất. Kết quả phân tích thống kê về biến động di truyền của các cặp mồi trên 100 cá thể trên bảng 5. cho thấy trung bình số alen mong đợi là 1,78. Tuy nhiên số alen ghi nhận được là 2,22. Chỉ số đa dạng Shannon là 62%. Một số cặp mồi có 3 alen là Am 341, Am 389, Am 12 và Am 8. Số còn lại là 2 alen. Tương ứng với chỉ số đa dạng Shannon là 73, 75, 69 và 63%, cao hơn trung bình số alen 62% (bảng 5). Như v ậy, trong tổng số 33 cặp mồi SSR nghiên cứu, có 18 cặp mồi thể hiện đa hình; tỷ lệ đa hình đạt 54,5% so với số mồi thanh lọc và 100% so với số mồi thực sự sử dụng trong nghiên cứu. Bảng 4. Tần số xuất hiện của các alen. 17
Mồi Loại alen TT A B C 1 Am008 0.765 0.225 0.01 2 Am012 0.37 0.625 0.005 3 Am326 0.515 0.485 4 Am341 0.575 0.415 0.01 5 Am367 0.725 0.275 6 Am368 0.395 0.605 7 Am384 0.695 0.305 8 Am387 0.5 0.5 9 Am389 0.635 0.34 0.025 10 Am396 0.385 0.615 11 Am400 0.47 0.53 12 Am429 0.63 0.37 13 Am460 0.545 0.455 13 Am460 0.545 0.455 14 Am465 0.745 0.255 15 Am484 0.9 0.1 16 Am502 0.68 0.32 17 Am522 0.67 0.33 18 Am770 0.93 0.07 Số liệu thống kê v ề tỷ lệ đồng hình và khác hình trên bảng 6 cho thấy tỷ lệ khác hình theo Nei và khác hình mong đợi tương tự nhau (42-43%). Tuy nhiên tỷ lệ khác hình quan sát trung bình thấp hơn tỷ lệ khác hình mong đợi là 29%. Khác với trường hợp khác hình, tỷ lệ đồng hình quan sát cao hơn tỷ lệ đồng hình mong đợi trung bình là 29% (bảng 3.4). Tỷ lệ đồng hình cao nhất ghi nhận được trên cặp mồi Am A484 (100%); kế đến là Am 770 và Am 522 (98%). Tỷ lệ khác hình ghi nhận cao nhất trên Am 387 là 48%; trong khi tỷ lệ khác hình được ghi nhận thấp nhất là trên cặp mồi Am 484 (0%). Kết quả trên bảng cũng cho thấy các cá thể nghiên cứu có sự tương đồng cao hay có mối quan hệ di truyền gần gũi. Các cá thể nghiên cứu được phân thành 2 nhóm chính. Nhóm 1 gồm 2 cá thể. Cá thể số 70 v à 71 (QLD). Nhóm 2 lại được chia thành 2 nhóm phụ. Nhóm phụ 2a gồm 43 cá thể. Nhóm phụ 2b gồm 55 cá thể. Trong mỗi nhóm phụ lại được chia thành nhiều nhóm nhỏ. Nhóm phụ 2a được chia thành 4 nhóm nhỏ, trong khi nhóm phụ 2b được chia thành 6 nhóm nhỏ. Số liệu ma trận cho thấy các cá thể số 1B, 1C, 1E, 1F và 1K có chỉ số tương đồng rất cao (>0,90). Điều này được thể hiện trên biểu đồ hình cây (H.3.3). Các cá thể này nằm chung một nhóm v à nằm cạnh nhau. Tương tự, các cá thể số 131 với cá thể số 135, 136 có chỉ số tương đồng rất cao (1,0 v à 1,01). Bảng 5. Tổng hợp số liệu thống kê về biến động di truyền cho tất cả các cặp mồi. Mồi Kích thước Số alen Số alen Chỉ số TT mẫu mong đợi . quan sát Shannon (I) * 1 Am008 200 3 1.57 0.59 2 Am012 200 3 1.90 0.69 3 Am326 200 2 2.00 0.69 4 Am341 200 3 1.99 0.73 5 Am367 200 2 1.66 0.59 6 Am368 200 2 1.92 0.67 7 Am384 200 2 1.74 0.62 8 Am387 200 2 2.00 0.69 9 Am389 200 3 1.93 0.75 10 Am396 200 2 1.90 0.67 11 Am400 200 2 1.99 0.69 18
12 Am429 200 2 1.87 0.66 13 Am460 200 2 1.98 0.69 14 Am465 200 2 1.61 0.57 15 Am484 200 2 1.22 0.33 16 Am502 200 2 1.77 0.63 17 Am522 200 2 1.79 0.63 18 Am770 200 2 1.15 0.25 Trung bình 200 2.22 1.78 0.62 Độ lệch 0.43 0.25 0.13 chuẩn (*): Shannon information index. P
2 Am012 200 0.93 0.07 0.53 0.47 0.47 0.04 3 Am326 200 0.77 0.23 0.50 0.50 0.50 0.12 4 Am341 200 0.87 0.13 0.50 0.50 0.50 0.07 5 Am367 200 0.91 0.09 0.60 0.40 0.40 0.05 6 Am368 200 0.79 0.21 0.52 0.48 0.48 0.11 7 Am384 200 0.77 0.23 0.57 0.43 0.42 0.12 8 Am387 200 0.52 0.48 0.50 0.50 0.50 0.24 9 Am389 200 0.63 0.37 0.52 0.48 0.48 0.19 10 Am396 200 0.97 0.03 0.52 0.48 0.47 0.02 11 Am400 200 0.88 0.12 0.50 0.50 0.50 0.06 12 Am429 200 0.94 0.06 0.53 0.47 0.47 0.03 13 Am460 200 0.91 0.09 0.50 0.50 0.50 0.05 14 Am465 200 0.95 0.05 0.62 0.38 0.38 0.03 15 Am484 200 1 0 0.82 0.18 0.18 0.00 16 Am502 200 0.78 0.22 0.56 0.44 0.44 0.11 17 Am522 200 0.98 0.02 0.56 0.44 0.44 0.01 18 Am770 200 0.98 0.02 0.87 0.13 0.13 0.01 Trung 200 0.86 0.14 0.57 0.43 0.42 0.07 bình Độ lệch 0.13 0.13 0.11 0.11 0.11 0.06 chuẩn (*)Đồng hình và khác hình mong đợi tính theo công thức của Levene (1949) (**)Nei's (1973) : Khác hình mong đợi. IV. KẾT LUẬN. Các chỉ thị RAPD và SSR có thể được dùng để đánh giá mối quan hệ di truyền của 100 cá thể Keo lá tràm nghiên cứu. Trong số 12 mồi RAPD, chỉ có 3 mồi thể hiện rõ các băng v ạch, phân đoạn ADN nên đã được dùng cho phân tích đa dạng di truyền của các cá thể keo lá tràm. Tương tự, chỉ có 18 cặp mồi SSR trong tổng số 33 cặp mồi được dùng để nghiên cứu. Kết quả phân tích bằng hai loại chỉ thị cho thấy mức độ biến động di truyền của các cá thể nghiên cứu là không cao. Tỷ lệ đa hình thu được biến động từ 0,8-1,0% bằng chỉ thị RAPD; trong khi phân tích bằng chỉ thị SSR đã ghi nhận tỷ lệ đồng hình (86%) cao hơn tỷ lệ khác hình (14%). Trung bình số alen thu được bằng phản ứng nhân gene của 18 cặp mồi SSR là 2,22. Hai nhóm chính được ghi nhận khi chỉ thị SSR được nghiên cứu. Nhóm 1 gồm 3 cá thể của Queensland (70, 71 và 76). Trong nhóm 2 gồm 97 cá thể được chia thành 2 nhóm phụ. Nhóm phụ 2a gồm 43 cá thể, nhóm phụ 2b gồm 55 cá thể. Trong mỗi nhóm phụ lại được chia thành nhiều nhóm nhỏ. Nhóm phụ 2a được chia thành 4 nhóm nhỏ, trong khi nhóm phụ 2b đựơc chia thành 6 nhóm nhỏ. Các cá thể có nguồn gốc từ Thái Lan nằm trong nhóm phụ 2a. Các cá thể có nguồn gốc từ Queensland còn lại nằm trong nhóm 1 và nhóm 2b. Bốn cặp mồi Am 341, Am 8, Am 12 v à Am 389 thể hiện 3 loại allen. Các cá thể 43,44, 57 v à 58 có chỉ số tương đồng thấp và được quan sát là tăng trưởng tốt, có thể được chọn làm vật liệu lai tạo để tạo được quần thể con lai mang tính trạng tăng trưởng nhanh. T ÀI LIỆU THAM KHẢO. Assoumane A. A., A. Vaillant; A. Z. Mayaki and D. Verhaegen, 2009. I solation and characterization of microsatellite markers for Acacia senegal (L.) Willd., a multipurpose arid and semi-arid tree . Molecular Ecology Resources: 1-4. Butcher. PA , G F Moran and H D Perkins, 1998.RFLP diversity in the nuclear genome of Acacia mangium. Heredity : 81: 205–213. 20
Butcher, PA; Glaubitz, JC & Moral GF, 1999: Applications for microsatellite markers in the domestication and conservation of forest trees, Forest Genetic Resources Information 27: 34-42. Butcher, P.A. , S. Decroocq ã Y. Gray & G.F. Moran, 2000. Development, inheritance and cross-species amplification of microsatellite markers from Acacia mangium. Theor Appl Genet. 101:1282–1290. Casiva PV., Saiman BO., Vilard JC. And Cialdella AM, 2002. First comparative phenetic studies of Argentinean species of Acacia (Fabaceae), using morphometric, isozymal, and RAPD approaches. American Journal of Botany 89(5): 843–853. Doyle, J. J. & Doyle, J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12: 13–15. Josiah C.C., George D.O, Eleazar O.M and Nyamu W.F, 2008. Genetic diversity in Kenyan populations of Acacia senegal (L.) willd revealed by combined RAPD and ISSR markers. African Journal of Biotechnology Vol. 7. 2333-2340. Nanda RM; Nayak S & Rout GR, 2004: Studies on genetic relatedness of Acacia tree species using RAPD markers. Biologia Bratislava. 59: 115-120. NEI, M. & LI, W. H. 1979. Mathematical modes for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76: 5269–5273. Nei M, 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Genet. 70: 3321-3323. Nguyen Tran Nguyen; Maghaieb REA; Saneoka H & Fujita K, 2004: RAPD markers associated with salt tolerance in Acacia auriculiformis and A. mangium. Plant Science. 167: 797-805. Playford J, Bell JC, Moran GF, 1993. A major disjunction in genetic diversity over the geographic range of Acacia melanoxylon R. Br. Austr. J. Bot. 41: 355-368. W idyatomoko A & Shiraishi. S, 2001. Identification of Acacia auriculiformis & A. magium using RAPD markers-Kyushu. J.fores.Rese. 56:66-68. Rohlf FJ., 1992. NTSYS-pc: Numerical taxonomy and multivariate analysis system. New York: Exeter Software. Yeh FC, Yang RC, Boyle T., 1999. POPGENE. Microsoft Windows-based freeware for population genetic analysis. Release 1.31. Edmonton : University of Alberta. STUDY ON GENETIC DIVERSITY OF ACACIA AURICULIFORMIS USING RAPD AND SSR MARKERS Vuong Dinh Tuan South Forest Science Sub-Institute SUMMARY Genetic relationships among 100 individuals of Acacia auriculiformis has been studied using 12 RAPD and 33 SSR markers. Results showed that there was a low genetic variation among studied individuals. Analysis using POPGENE 32 ver. 1.31 indicated that studied propulation can be grouped into two. Group 1 consisted of 2 trees (70&71), while the remaining individuals belongs to group 2. Two big subgroups were also divided from group 2.They were subgroup 2a and subgroup 2b. Individuals which originated from Queensland belongs were allocated in group 1 and 2b, whereas individuals originated from Thai land were observed in the subgroup 2b. Trees namely 43, 44, 57 and 58 showed lowest homozygosity index and fast growth can be selected for breeding materials. Keywords: Acacia auriculiformis, genetic diversity analysis, SSR and RAPD markers 21