Nghiên cứu loại bỏ phytate bằng enzyme phytase nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng khoáng và protein trong sữa đậu nành thanh trùng Pasteur

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này nhằm chứng minh việc sử dụng enzyme phytase trong chế biến sữa đậu nành đã làm giảm hàm lượng chất kháng dinh dưỡng phytate, đồng thời làm tăng giá trị dinh dưỡng khoáng và protein trong sữa đậu nành thanh trùng Pasteur.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu loại bỏ phytate bằng enzyme phytase nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng khoáng và protein trong sữa đậu nành thanh trùng Pasteur

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.00094 NGHIÊN CỨU LOẠI BỎ PHYTATE BẰNG ENZYME PHYTASE NHẰM NÂNG CAO GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG KHOÁNG VÀ PROTEIN TRONG SỮA ĐẬU NÀNH THANH TRÙNG PASTEUR Trần Thị Thúy*, Lê Thị Hồng Tóm tắt: Sữa đậu nành là đồ uống dinh dưỡng quen thuộc với người Việt Nam. Thành phần dinh dưỡng của sữa đậu nành có thể sánh ngang cùng với các sản phẩm sữa có nguồn gốc động vật nhưng lại ít được sử dụng hơn sữa bò, sữa dê,… do hàm lượng các chất ức chế dinh dưỡng như phytate, chất kháng tripsin trong sữa đậu nành còn cao. Nghiên cứu này nhằm chứng minh việc sử dụng enzyme phytase trong chế biến sữa đậu nành đã làm giảm hàm lượng chất kháng dinh dưỡng phytate, đồng thời làm tăng giá trị dinh dưỡng khoáng và protein trong sữa đậu nành thanh trùng Pasteur. Xử lí sữa đậu nành thanh trùng Pasteur bằng enzyme phytase (nồng độ 43,9IU/L) trong khi bảo quản sữa ở 10 oC đã giúp giải phóng 31,5% hàm lượng phosphat vô cơ từ phytate trong sữa, đặc biệt làm tăng hàm lượng protein hòa tan và các khoáng dễ tiêu trong sữa (Ca2+, Fe2+, Zn2+ và Mg2+) từ 21,94% đến 79,13% so với sữa không được xử lí phytase. Từ khóa: Phytase, phytate, sữa đậu nành. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong số các sản phẩm từ hạt đậu tương như sữa đậu nành, đậu phụ, tào phớ, xì dầu… thì sữa đậu nành là đồ uống rất quen thuộc với người Việt Nam. Sữa đậu nành là sản phẩm thu được từ quá trình nấu dịch chiết từ hạt đậu nành. Quy trình này được chế biến tại mỗi gia đình hoặc sản xuất trên quy mô công nghiệp. Phân tích và so sánh thành phần dinh dưỡng của sữa đậu nành và sữa bò, Taguchi et al., (2006) đã đi đến kết luận hết sức thú vị: Dinh dưỡng của sữa đậu nành có thể sánh ngang cùng với các sản phẩm sữa có nguồn gốc động vật. Hàm lượng protein trong sữa đậu nành cao hơn cả sữa bò, trong khi đó, hàm lượng lipid thấp sẽ giúp người sử dụng giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch (Anno et al., 1985). Hàm lượng các khoáng chất trong sữa đậu nành cao, là nguồn cung cấp các khoáng vi lượng phục vụ cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cơ thể. Tuy nhiên, sữa đậu nành vẫn không được sử dụng nhiều như các loại sữa từ động vật như sữa bò, sữa dê,… vì hàm lượng các chất kháng dinh dưỡng (phytate, chất kháng tripsin) trong sữa đậu nành khá cao (Hídvégi & Lásztity, 2002; Hwang et al., 1997). Phytase là enzyme được ứng dụng phổ biến trong chế biến thức ăn chăn nuôi và thực phẩm để loại bỏ chất kháng dinh dưỡng phytate, tăng hàm lượng phosphat cũng như các khoáng chất dễ tiêu trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Năm 1985, Anno et al. đã thực Trường Đại học Sư phạm Hà Nội *Email: thuy_tt@hnue.edu.vn
760 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM hiện thí nghiệm loại bỏ phytate trong sữa đậu nành bằng cách bổ sung phytase từ lúa mì vào sữa. Năm 1989, Simell et al., đã sử dụng Finase S, một phytase thương phẩm, để tạo ra loại protein đậu nành không chứa phytate. Năm 2006, Greiner & Konietzny đã đề xuất việc sử dụng phytase hoặc các vi sinh vật sinh phytase (nấm men, vi khuẩn lactic) trong quá trình lên men làm bánh mì để làm giảm hàm lượng phytate trong thực phẩm, tăng giải phóng canxi từ phức chất IP6 - Ca cần cho hoạt động của α - amylase, qua đó gián tiếp giúp cải thiện chất lượng bánh mỳ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá khả năng sử dụng enzyme phytase BacP từ Bacillus subtilis để loại bỏ tính kháng dinh dưỡng phytate trong sữa đậu nành thanh trùng Pasteur đối với việc tăng cường giải phóng phosphat vô cơ (Pvc), các protein và các cation kim loại dễ tiêu trong sữa, góp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng khoáng và protein cho sữa đậu nành. Ngoài tính đặc hiệu xúc tác với cơ chất phytate giải phóng Pvc, enzyme phytase từ Bacillus subtilis đã được chứng minh chỉ xúc tác giải phóng 3 đến 4/6 gốc Pvc trong phytate (IP6), tạo ra các dẫn xuất inositol bậc thấp (IP2, IP3, IP4) có lợi cho sức khỏe (Kerovuo, 2000; Siren, 1995). 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Enzyme phytase BacP, được sản xuất từ chủng Bacillus sp. MD2, do Bộ môn Công nghệ sinh học - Vi sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội cung cấp. Giống đậu tương DT84, do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ - Viện Lương thực, Thực phẩm Việt Nam cung cấp, được sử dụng để sản xuất sữa đậu nành trong phòng thí nghiệm. Các hóa chất phân tích: Natri-phytate (Sigma, P3168), ammonium molypdate (Merck), tricloroaxetic axit (TCA - Trung Quốc); dung dịch chuẩn 1.000 ppm Fe2+, Mg2+, Zn2+ và Ca2+ (Scharlau, Tây Ban Nha); và các hóa chất thông dụng khác được mua của Trung Quốc và Việt Nam: CH3COOH, FeSO4.7H2O, CH3COONa, NaOH, HCl, Na2CO3, C2H5OH, NH4OH đều đạt độ tinh sạch ở mức phân tích. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Chế biến sữa đậu nành Hạt đậu nành (60 g) được ngâm trong nước RO ở nhiệt độ phòng trong 8 giờ. Sau đó, sửa sạch nhớt và bổ sung nước RO, nghiền bằng máy nghiền đồng thể, lọc qua vải bông loại bỏ cặn thu được 600 mL sữa đậu nành thô (Tsumura et al., 2004). Sữa thô được thanh trùng Pasteur ở 90 - 95 ºC trong 10 phút, sau đó được làm nguội đến nhiệt độ phòng và bảo quản ở 10 ºC trong 7 - 10 ngày. Xác định hàm lượng phytate trong sữa đậu nành Căn cứ vào đặc tính kết tủa mạnh của phytate với ion Fe3+, người ta cho một lượng dư Fe vào sữa đậu nành để kết tủa toàn bộ phytate trong sữa. Sau đó, rửa sạch Fe3+ dư 3+ trong kết tủa Fe-phytate và xác định hàm lượng sắt có trong kết tủa. Từ hàm lượng sắt có
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 761 trong kết tủa với phytate, ta có thể tính được hàm lượng của phytate trong sữa theo nguyên tắc: Một phân tử phytate liên kết với 4 phân tử sắt và khối lượng của phytate gấp 2,98 lần khối lượng của sắt (Tsumura et al, 2004). mphytate trong sữa = 2,98 x mFe trong kết tủa Fe-phytate Hàm lượng Fe3+đã kết tủa với phytate được xác định bằng máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử NOVAA 350 (AnalytikJena - Đức), dựa trên đồ thị chuẩn tương quan giữa giá trị phổ hấp thụ nguyên tử ở bước sóng 248,33 nm (A248,33) và nồng độ Fe3+ trong dung dịch chuẩn (nồng độ: 0; 0,5; 1; 2; 3; 4 và 4,5 ppm pha bằng dung dịch đệm 1% HNO3). Xác định hàm lượng protein tổng số trong sữa đậu nành Pha loãng sữa đậu nành đến nồng độ thích hợp và tiến hành phản ứng màu với dung dịch Coomasie blue theo phương pháp Bradford (1976) và đo quang phổ hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm. Tính toán hàm lượng protein theo phương trình đường chuẩn tương quan giữa hàm lượng BSA (Bovin Serum Albumin- Albumin huyết thanh bò) có nồng độ chuẩn 0; 2,5; 5; 10; 15; 20; 25 và 30 μg/mL với độ hấp phụ quang ở bước sóng 595 nm (A595) trên máy đo quang phổ (UV-VIS - 1240 Shimadzu, Nhật). Xác định hoạt tính enzyme phytase Enzyme phytase BacP được pha trong dung dịch đệm 0,1 M Tris- HCl, pH = 7 có bổ sung 5 mM CaCl2. Enzyme được pha loãng đến nồng độ thích hợp và được phản ứng với dung dịch cơ chất (1,67 mM Natri-phytate) theo tỉ lệ 1: 9 về thể tích. Phản ứng enzyme được diễn ra trong 10 phút ở nhiệt độ và 70 ºC và dừng phản ứng bằng cách bổ sung 1 thể tích tương ứng dung dịch TCA 15% (Tri-chloroacetic axit). Sau đó dịch phản ứng được li tâm, thu dịch nổi và bổ sung dung dịch màu (chứa 4 lần thể tích dung dịch A (1,5% amoniummolypdate (NH4)6Mo7O24) trong 5,5% H2SO4) và 1 lần thể tích dung dịch B (2,7% FeSO4.7H2O)) theo tỉ lệ 1 : 1 về thể tích và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 700nm. Phản ứng đối chứng (Enzyme blank) được tiến hành tương tự nhưng dung dịch TCA 15% được bổ sung trước khi bổ sung dung dịch cơ chất. Hàm lượng phosphat vô cơ (Pvc) được giải phóng từ phản ứng enzyme được tính toán dựa vào đồ thị tương quan giữa nồng độ Pvc chuẩn 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,5 và 0,6 mM của dung dịch NaH2PO4 với độ hấp thụ quang ở bước sóng 700 nm (A700) trên máy đo quang phổ (UV- VIS - 1240 Shimadzu, Nhật). Một đơn vị hoạt tính (IU) được quy định là lượng enzyme để giải phóng 1 µmol Pvc trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm (Shimizu, 1992). Xác định động thái hoạt động của enzyme phytase trên cơ chất natri-phytate Bổ sung 0,15 mL enzyme BacP vào 30 ml dung dịch cơ chất (2,25 mM natri- phytate) trong dung dịch đệm 0,1 M Tris- HCl, pH = 7 có bổ sung 5 mM CaCl2. Thí nghiệm được tiến hành trong bể ổn nhiệt ở 70 oC, có khuấy từ nhẹ. Mẫu được lấy ra từ phản ứng tại các thời điểm xác định, được bổ sung một thể tích tương ứng dung dịch 15% TCA để dừng phản ứng, xử lí mẫu và tiến hành phản ứng màu như thí nghiệm xác định hoạt tính phytase. Lượng Pvc tạo ra được xác định dựa trên đồ thị chuẩn Pvc (nêu trên).
762 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Xác định động thái hoạt động của enzyme phytase trên cơ chất sữa đậu nành Tiến hành tương tự như phương pháp xác định động thái enzyme trên cơ chất phytate chuẩn nhưng dung dịch cơ chất chuẩn được thay bằng sữa đậu nành thanh trùng Pasteur. Xác định hàm lượng kim loại hòa tan được giải phóng trong quá trình xử lí sữa đậu nành bằng enzyme phytase Mẫu sữa dùng để xác định hàm lượng Fe3+, Mg2+, Ca2+ được xử lí bằng dung dịch 2% HNO3, còn mẫu dùng để xác định Zn2+ được xử lí bằng dung dịch 1% HCl theo tỉ lệ thể tích 1:1 để nồng độ HNO3 hoặc HCl của dung dịch sau cùng trước khi đi phân tích lần lượt là 1% và 0,5%. Tiếp tục li tâm dịch sữa 1.0000 vòng/phút trong 5 phút để thu dịch nổi, các mẫu dịch nổi được lọc lại một lần nữa bằng giấy lọc trước khi bảo quản trong điều kiện - 20 oC. Xác định hàm lượng các kim loại có trong dung dịch bằng máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử NOVAA 350 (AnalytikJena - Đức) ở bước sóng tương ứng với từng kim loại: đo Zn2+ ở bước sóng 213,86 nm, đo Mg2+ ở bước sóng 285,51 nm, đo Ca2+ ở bước sóng 422,7 nm, đo Fe2+ ở bước sóng 248,33 nm (Phạm Luận, 2009). Hàm lượng kim loại trong các mẫu sữa đậu nành được xác định dựa vào đồ thị tương quan giữa nồng độ chuẩn các ion kim loại (0 - 10 ppm) với độ hấp thu quang ở bước sóng tương ứng với từng kim loại. Xác định hàm lượng protein dễ hòa tan trong sữa đậu nành Sữa đậu nành (5 ml) đã được xử lí với enzyme phytase với hàm lượng 43,9 IU/L, được bổ sung vào 5 ml dung dịch 0,1 M CaCl2 trong ống falcon 15 mL, votex đều tạo thành thể đồng nhất, giữ trong 16 giờ ở điều kiện 7 ºC. So sánh độ lắng của sữa đậu nành được xử lí và không được xử lí bằng enzyme phytase, đồng thời xác định hàm lượng protein trong pha dịch trong của các ống thí nghiệm bằng phương pháp Bradford (1976). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hoạt động của enzyme phytase trên cơ chất chuẩn Natri-phytate và trên cơ chất sữa đậu nành Enzyme phytase BacP là loại phytase kiềm, hoạt động tốt ở 70ºC trong điều kiện trung tính, hơi kiềm (pH 7), xúc tác phân giải cơ chất natri-phytate giải phóng tối đa 4 gốc Pvc trong tổng số 6 gốc phosphat của phân tử phytate (Tran et al., 2011; Kim et al., 1998). Thí nghiệm ở hình 1 cho thấy phytase BacP phân giải cơ chất chuẩn Natri-phytate trong dung dịch đệm 0,1M Tris-HCl pH 7 chậm hơn và kém hơn hẳn (chỉ giải phóng được 43,58% lượng Pvc sẵn có trong 2,25 mM natri-phytate sau 6 giờ phản ứng) so với phân giải cơ chất phytate trong sữa đậu nành. Sữa đậu nành làm từ hạt đậu tương giống DT84 có pH 6,8 và chứa 1,489 g phytate trong 1 L sữa (Trần Thị Thúy và cs, 2019a) tương đương 2,26 mM. Hoạt động của phytase BacP đã xúc tác giải phóng tới 64,68% lượng Pvc sẵn có trong sữa đậu nành sau 6 giờ phản ứng, cao hơn hẳn so với hoạt động của enzyme này trong dung dịch cơ chất chuẩn natri-phytate. Điều này chứng tỏ là môi trường sữa đậu nành giầu protein rất thích hợp cho
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 763 hoạt động của phytase BacP. Một số nghiên cứu của nhiều tác giả khác nhau cũng cho thấy enzyme thường hoạt động tốt hơn trong môi trường có bổ sung các protein bảo vệ (Piszkiewicz et al., 2019; Piszkiewicz & Pielak, 2019) do các protein này nâng đỡ và ổn định cấu trúc enzyme, chống lại các tác nhân gây bất hoạt enzyme từ môi trường. Hoạt động xúc tác thủy phân phytate trong dung dịch cơ chất chuẩn và trong sữa đậu nành đều diễn ra rất nhanh (ngay trong 5 phút đầu tiên), sau đó chậm lại trong khoảng thời gian từ 5 đến 90 phút (đối với sữa đậu nành) và 5 đến 150 phút (đối với dung dịch cơ chất chuẩn). Sau đó, hoạt động của enzyme tăng không đáng kể, chứng tỏ nồng độ cơ chất thấp đã bắt đầu hạn chế tốc độ phản ứng của enzyme. Việc tăng nồng độ của enzyme cũng chỉ làm tăng tốc độ phản ứng trong 5 phút đầu tiên, làm phản ứng kết thúc sớm hơn, không làm tăng được tốc độ phản ứng enzyme ở giai đoạn sau. 80 70 Sữa đậu nành 60 Pvc giải phóng (%) 50 40 Natri-phytate 30 20 10 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 Thời gian (phút) Hình 1. Hoạt động của phytase BacP trên cơ chất chuẩn natri phytate và trên sữa đậu nành 3.2. Lựa chọn nồng độ enzyme phytase để xử lí phytate trong sữa đậu nành thanh trùng Pasteur ở điều kiện bảo quản Quy trình sản xuất sữa đậu nành thanh trùng thường bao gồm các công đoạn sau: (1) Ngâm hạt, (2) Xay nghiền đồng thời lọc bỏ bã, (3) Đồng hóa dịch sữa, (4) Đun thanh trùng sữa, (5) Đóng chai và bảo quản sữa. Các thí nghiệm xác định thời gian bảo quản sữa của chúng tôi (kết quả không công bố trong bài báo này) đã xác định được thời gian bảo quản sữa ở nhiệt độ mát (10 ºC) là 7-10 ngày (Trần Thị Thúy, 2019b). Tận dụng thời gian bảo quản sữa (từ khi xuất xưởng đến khi đến tay người sử dụng) ở 4-10 ºC cho hoạt động của enzyme phytase phân giải phytate trong sữa đậu nành thanh trùng là cách thức tiết kiệm thời gian và chi phí cho quy trình sản xuất sữa đậu nành thanh trùng Pasteur, hoạt động của enzyme ở nhiệt độ thấp tuy diễn ra chậm chạp nhưng enzyme hoạt động bền hơn, ít bị bất hoạt bởi nhiệt độ và các điều kiện khác. Do vậy các thí nghiệm xử lí sữa đậu nành bằng enzyme phytase được tiến hành ở 10 ºC trong 7 ngày. Hình 2 trình bày kết quả xác định nồng độ enzyme phytase phù hợp để xử lí phytate trong sữa đậu nành thanh trùng ở điều kiện bảo quản (10 ºC trong 7 ngày). Kết quả cho thấy: Có thể lựa chọn được các nồng độ enzyme phytase từ 43,9 đến 175,7 IU/L để bổ sung vào sữa đậu nành nhằm thủy phân phytate ở điều kiện bảo quản (10 oC), giải phóng từ 20-50% lượng Pvc vốn có trong phytate của sữa đậu nành, đảm bảo các dẫn xuất có ích
764 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM của IP6 như IP2, IP3 và IP4 tạo ra nhiều nhất trong thời gian bảo quản sữa (3-7 ngày sau khi thanh trùng Pasteur). Nhằm tiết kiệm lượng enzyme sử dụng, tiết kiệm chi phí cho quy trình xử lí phytate trong sữa đậu nành, chúng tôi đã lựa chọn bổ sung 43,9 IU enzyme phytase cho 1 lít sữa đậu nành thanh trùng Pasteur trước khi đem bảo quản ở 10 ºC trong 7-10 ngày. Hình 2. Hoạt động của phytase (ở các nồng độ khác nhau) trong sữa đậu nành thanh trùng, bảo quản ở nhiệt độ 10 oC 3.3. Khả năng giải phóng các kim loại tự do trong sữa đậu nành được xử lí bằng enzyme phytase Do có ái lực cao đối với nhiều cation kim loại thiết yếu trong các loại hạt ngũ cốc, phytate là nguyên nhân dẫn đến hiện tượng giảm khả năng hấp thụ khoáng chất trong đường tiêu hóa của người và động vật nuôi. Theo kết quả nghiên cứu trước đây của chúng tôi (Trần Thị Thúy và nnk., 2019a) cũng như báo cáo của Vohra et al., (1965) thì trong số các kim loại được nghiên cứu thì phytate có ái lực mạnh nhất đối với các kim loại theo trình tự sau: Fe3+ > Zn2+ > Cu2+ > Mn2+ > Ni2+ > Ca2+ > Mg2+. Sử dụng enzyme phytase để loại bỏ phytate trong sữa đậu nành có thể làm giải phóng các ion kim loại thiết yếu này ra khỏi phức chất với phytate, làm tăng hàm lượng các ion này hòa tan trong dịch sữa. Hình 3 chứng minh sự giải phóng các cation kim loại Fe2+, Zn2+, Mg2+ và Ca2+ từ dạng liên kết với phytate sang dạng cation tự do trong dung dịch sữa đậu nành được xử lí với enzyme phytase. Trong dịch sữa đậu nành đã được xử lí bằng enzyme BacP, hàm lượng Fe2+ tăng đồng hành (tỉ lệ thuận) với hàm lượng Pvc. Điều đó có nghĩa là lượng Fe2+ tự do trong dịch sữa thay đổi tỉ lệ nghịch với hàm lượng phytate dưới tác dụng của enzyme phytase. Hàm lượng Fe2+ tăng rõ rệt tới ngày thứ 3, sau đó, có xu hướng ổn định trong thời gian bảo quản sữa (Hình 3A). Cụ thể là hàm lượng Fe2+ trong dịch sữa tăng từ 3,69 lên 6,61 mg/L (tăng 79,13%) so với sữa chưa được xử lí bằng enzyme phytase. So với hàm lượng sắt trong sản phẩm sữa đậu nành chưa được xử lí trong báo cáo của Hirokata (2006) là 5 mg/L và trong “Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam” của Hà Thị Anh Đào và Nguyễn Công Khẩn (2007) có hàm lượng sắt là 1,2 mg/L thì hàm lượng sắt trong sản phẩm sữa đậu nành của chúng tôi cao gấp 5 lần so với sữa đậu nành bình thường trên thị trường Việt Nam hiện nay.
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 765 Theo kết quả biểu diễn trên Hình 3B thì hàm lượng Zn2+ trong dịch sữa đậu nành trước khi xử lí bằng enzyme phytase là 2,35. Sau khi được xử lí làm giảm hàm lượng phytate dưới tác dụng của enzyme phytase, hàm lượng Zn2+ tự do tăng đồng thời với lượng Pvc được giải phóng. Hàm lượng kẽm tự do tăng nhanh từ 2,35 mg/L lên 3,18 mg/L ở ngày thứ 1 và đạt mức 3,23 mg/L sau 7 ngày bảo quản ở 10 oC. Như vậy, sự giảm hàm lượng phytate trong dịch sữa đậu nành thanh trùng đã làm tăng sự giải phóng Zn2+ trong dịch sữa, qua đó tăng hàm lượng kẽm dễ tiêu đến ruột non. Kết quả này tương đồng với các báo cáo của Larsson et al., (1996), báo cáo này đã chứng minh rằng sự giảm phytate làm tăng khả năng hấp thu kẽm ở người và động vật có chế độ ăn là các sản phẩm có nguồn gốc từ đậu nành và yến mạch. Hình 3. Hàm lượng các cation kim loại hòa tan trong sữa đậu nành thanh trùng trước khi xử lí bằng phytase, sau khi xử lí 1 ngày và trong thời gian bảo quản sữa: (A) Hàm lượng Fe2+; (B) Hàm lượng Zn2+; (C) Hàm lượng Mg2+ và (D) Hàm lượng Ca2+ Tiến hành phân tích hàm lượng Mg2+ trong sữa đậu nành trước và sau khi xử lí bằng enzyme phytase chúng tôi thu được kết quả thể hiện trong Hình 3C. Theo đó, hàm lượng Mg2+ trong sữa đậu nành trước khi xử lí enzyme là 171,69 mg/L. Hàm lượng Mg2+ cả trong dịch sữa đậu nành có xu hướng tăng nhanh ngay sau khi được xử lí với enzyme phytase. Cụ thể, hàm lượng Mg2+ trong sữa đậu nành tăng từ 171,69 mg lên 266,04 mg sau 1 ngày và đạt mức ổn định 251, 62 mg/L ở ngày thứ 5 và 7. Như vậy, sự giảm hàm lượng phytate trong dịch sữa (do xử lí bằng phytase) đã có ảnh hưởng tích cực tới sự giải
766 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM phóng Mg2+ trong dịch sữa đậu nành thanh trùng, từ đó làm tăng hàm lượng magie dễ tiêu đến ruột non. Phytate cũng ảnh hưởng đến hàm lượng canxi dễ tiêu trong dịch sữa đậu nành thanh trùng. Đồ thị hình 3D cho thấy: hàm lượng Ca2+ trong sữa đậu nành trước khi được xử lí bằng enzyme phytase là 27,62 mg/L tăng lên 33,68 mg/L ở ngày thứ 3 trong điều kiện bảo quản, sau khi bổ sung phytase. So sánh hàm lượng canxi trong sữa sau khi được xử lí với hàm lượng canxi trong sữa đậu nành trong bảng thành phần dinh dưỡng các thực phẩm Việt Nam do Hà Thị Anh Đào và Nguyễn Công Khẩn công bố năm 2007 thì hàm lượng canxi trong sản phẩm sữa đã được xử lí với enzyme BacP của chúng tôi đạt mức cao hơn. Các sản phẩm sữa được xử lí bằng enzyme phytase cho hàm lượng ion canxi tự do cao sẽ là cơ sở để tăng khả năng hấp thụ canxi của cơ thể, góp phần ngăn ngừa một số bệnh lí về xương, răng cho những người sử dụng các sản phẩm sữa này. 3.4. Khả năng tăng cường các protein hòa tan trong sữa đậu nành được xử lí bằng enzyme phytase Sữa đậu nành là loại đồ uống có hàm lượng protein cao ngang bằng, thậm chí còn hơn cả sữa bò. Hàm lượng protein trong các loại sữa đậu nành thương phẩm hiện này thường nằm trong khoảng 1,8-3,5% tùy hãng sản xuất, tùy định hướng sử dụng sản phẩm cho các đối tượng khác nhau. Ở pH axit, phytate có thể liên kết trực tiếp với các protein đậu nành tạo thành phức chất khó tan, ở TN ĐC pH kiềm, protein liên kết với phytate qua các cầu nối với các cation kim loại đã liên kết với phytate, tạo thành phức chất rất dễ kết tủa (Trần Thị Thúy và nnk., 2019a). Việc các hãng sản xuất quảng cáo việc bổ sung thêm canxi vào sữa đậu nành để tăng hấp thu canxi và kích thích tăng chiều cao cho người sử dụng sữa, giảm loãng xương,… lại góp phần làm tăng thêm phức chất khó tan giữa các ion kim loại, protein sữa và phytate nếu sữa không được loại bỏ phytate trước khi bổ sung canxi. Sữa đậu nành thanh trùng được sản xuất từ hạt Hình 4. Chiều cao cột lắng đậu nành giống DT84 có hàm lượng protein tổng số protein của mẫu sữa đậu là 3,56 g/100 mL. Các nghiên cứu sơ bộ của chúng nành đã được xử lí với tôi cho thấy việc bổ sung 100 mM Ca Cl2 cho kết tủa enzyme phytase (TN) và mẫu protein trong sữa đậu nành là cao nhất (cột lắng sữa đậu nành không được xử protein có chiều cao 2,27 cm. Chúng tôi quyết định lí enzyme (ĐC) bổ sung canxi vào sữa đậu nành thanh trùng (được xử lí và không được xử lí enzyme phytase) cho đạt nồng độ 100 mM để đánh giá hàm lượng protein hòa tan, dễ tiêu trong hai thí nghiệm này. Kết quả thể hiện ở Hình 4 cho thấy: chiều cao cột lắng của 2 dung dịch sữa này có sự khác biệt không lớn, chỉ là 0,2 cm (sữa được xử lí bằng phytase có chiều cao cột lắng
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 767 cao hơn). Tuy nhiên, khi tiến hành xác định hàm lượng protein ở phần dịch trong của các ống thí nghiệm chúng tôi thu được kết quả như sau: ở ống đối chứng, hàm lượng protein là 0,43 g/100 mL, ở ống thí nghiệm hàm lượng này là 0,57 g/100 mL. Kết quả này cho thấy, sự giảm phytate đã làm tăng hàm lượng protein dễ tan trong sữa đậu nành. 4. KẾT LUẬN Việc xử lí sữa đậu nành thanh trùng Pasteur bằng enzyme phytase (nồng độ 43,9 IU/l) trước khi bảo quản sữa ở 10 ºC đã giúp giải phóng 31,5% hàm lượng phosphat vô cơ từ phytate trong sữa, đặc biệt làm tăng hàm lượng protein hòa tan và các khoáng dễ tiêu trong sữa (Ca2+ tăng 21,94%; Fe2+ tăng 79,13%; Zn2+ tăng 37,45% và Mg2+ tăng 46,55%). Như vậy, bên cạnh việc làm giảm hàm lượng chất kháng dinh dưỡng phytate, việc sử dụng phytase để xử lí sữa cũng góp phần làm tăng giá trị dinh dưỡng khoáng và protein trong sữa đậu nành. Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin trân trọng cảm ơn Đề án Phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 của Bộ Công Thương (Đề tài mã số ĐT.03.15/CNSHCB) đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Anno T., Nakanishi K., Matsuno R. and Kamikubo T., 1985. Enzymatic elimination of phytate in soybean milk. J. Japan Soc. Food Sci. Technol. 32: 174-180. Bradford M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. Greiner R., Konietzny U., 2006. Phytase for food application, Food Technol. Biotechnol. 44: 125-140. Hà Thị Anh Đào, Nguyễn Công Khẩn, 2007. Thành phần thực phẩm Việt Nam. Nxb. Đại học Y, tr. 82, 93. Hídvégi M., Lásztity R., 2002. Phytic axit content of cereals and legumes interaction with proteins. Periodica Polytechnica Ser. Chem. Eng. 46(1-2): 59-64. Hwang D. L., Foard D. E. and Wei C. H., 1997. A soybean tripssin inhibitor. The Journal of Biological Chemistry 252(3):1099-1101. Kerovuo J., Rouvinen J., Hatzack F., 2000. Analysis of myo-inositol hexakisphosphate hydrolysis by Bacillus phytase: indication of a novel reaction mechanism. Biochem. J 352 (3): 623 - 8. Kim Y. O., Lee J. K., Kim H. K., Yu J. H., Oh T. K., 1998. Cloning of the thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp. DS11 and its overexpression in Escherichia coli, FEMS Microbiol Lett 162: 185-191. Larsson M., Rossander-Hulthén L., Sandström B. & Sandberg A.S., 1996. Improved zinc and iron absorption from breakfast meals containing malted oats with reduced phytate content. Br. J Nu tr. 76: 677-688. Phạm Luận, 2009. Phương pháp phân tích phổ nguyên tử, Nxb. Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 38-49. Piszkiewicz S., Gunn K. H., Warmuth O., Propst A., Mehta A., Nguyen K. H., Pielak G. J., 2019. Protecting activity of desiccated enzymes. Protein Sci. DOI:10.1002/pro.3604. Piszkiewicz S. and Pielak, G. J., 2019. Protecting Enzymes from Stress-Induced Inactivation. Biochem 58: 3825-3833. Shimizu M., 1992. Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56(8): 1266-1269.
768 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Simell M., Elovainio M., Vaara M., Vaara T., 1990. Novel method for production of phytate-free or low-phytate soy protein isolate and concentrate. Patent WO 90/08476. Siren M., 1995. Method of treating pain using inositol triphosphate, U. S. Patent 5407924, pp. 23- 28, 732 - 739. Taguchi H., Chen H., Yano R., 2006. Comparative effects of milk and soymilk on bone loss in adult ovariectomized osteoprosis rat. Okajimas folia Anat Jpn, 83: 53-60. Tran T. T., Hashim S. O., Gaber Y., Mamo G., Mattiasson B. and Hatti-Kaul R., 2011. Thermostable alkaline phytase from Bacillus sp. MD2: effect of divalent metals on activity and stability. J. Inorg. Biochem 105: 1.000-1007. Trần Thị Thúy, Trương Thị Liên và Lê Thị Hồng, 2019a. Tính kháng dinh dưỡng của phytate và xử lí phytate trong sữa đậu nành bằng phytase. Tạp chí Công nghệ sinh học 17 (1): 1-11. Trần Thị Thúy, 2019b. Nghiên cứu ứng dụng enzyme phytase trong chế biến đậu nành và ngũ cốc tạo sản phẩm thực phẩm. Báo cáo nghiệm thu Đề tài mã số: ĐT.03.15/CNSHCB thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020, trang 67-69. Tsumura K., Saito T., Kugimiya W., 2004. Influence of phytase treatment on the gelation property of soymilk. Food Sci. Technol Res 10 (4): 442-446. Vohra P., Gray G. A., Kratzer F. H., 1965. Phytic axit-metal complexes. Proc. Soci. Exp. Biol Med. 120: 447-449. STUDY ON ELIMINATING PHYTATE BY PHYTASE ENZYME TO IMPROVE NUTRITIONAL VALUE OF PROTEIN AND ESSENTIAL MINERAL IN PASTEURIZED SOYBEAN MILK Tran Thi Thuy*, Le Thi Hong Abstract: Soybean milk is a common, nutritional drink of Vietnamese. The nutritional value of soybean milk is almost equal to other milk from animals; however, soybean milk takes much smaller consumption compared to cow milk, or goat milk,… due to the high content of antinutritional factors such as phytate and tripsin inhibitor in soybean milk. This study aims to prove the use of phytase enzymes in soybean milk processing to reduce phytate content and increase the content of digestible protein and minerals in pasteurized soybean milk. Adding 43.9 IU/L of phytase to pasteurized soybean milk before storing at 10 oC for 7 days, catalyzed the hydrolysis of phytate and releases 31.5% of the phosphate originating from phytate in soybean milk. Especially, this helps to improve the content of dissolved protein and essential minerals (Ca2+, Fe2+, Zn2+ và Mg2+) in soybean milk from 21.94 to 79.13% compared to non-treated soybean milk. Keywords: Phytase, phytate, soybean milk. Hanoi National University of Education *Email: thuy_tt@hnue.edu.vn