TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br />
<br />
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG CỦA QUY TRÌNH<br />
NHUỘM RỬA VÀ CỐ ĐỊNH MẪU BỆNH PHẨM ĐẾN VIỆC<br />
HOÀN THIỆN XÉT NGHIỆM XẾP LOẠI MIỄN DỊCH<br />
BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY<br />
Lê Xuân Hải*; Nguyễn Triệu Vân*<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: tối ưu hóa quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp<br />
loại miễn dịch bằng kỹ thu t phân tích tế bào (TB) dòng chảy. Phương pháp: thử nghiệm các<br />
quy trình xếp loại theo kiểu hình miễn dịch của các labo khác nhau, phát hiện các yếu tố ảnh<br />
hưởng đến quá trình xử lý mẫu bệnh phẩm, cải tiến bước xử lý phù hợp. Sau đó hoàn thiện và<br />
thử nghiệm quy trình hoàn chỉnh. Kết quả: đã tìm ra các bước cần cải tiến quy trình xử lý mẫu<br />
bệnh phẩm để cải thiện chất lượng xét nghiệm như: phá hồng cầu trước khi ủ kháng thể; rửa<br />
bỏ kháng thể thừa trước khi phân tích; sử d ng dung dịch cố định và bảo quản TB. Kết luận: để<br />
tăng cường chất lượng xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng phương pháp TB dòng chảy cần áp<br />
d ng một số thay đổi trong quy trình nhuộm rửa, cố định và bảo quản mẫu.<br />
* Từ khóa: Bệnh bạch cầu; Xếp loại kiểu hình miễn dịch; Đếm tế bào dòng chảy.<br />
<br />
Study on Affecting Factors of Staining, Washing and Fixing of Blood<br />
Samples to Complete Immmunophenotyping by Flow Cytometry Technic<br />
Summary<br />
Objectives: To optimize the process of staining, washing and fixing of samples that are used in<br />
immunophenotyping by flow cytometry. Methods: To perform the procedure of immunophenotyping<br />
in various samples to identify factors affecting the procedure of handling samples and the<br />
completed procedure is developed and tested afterward. Results: some improvements in the<br />
procedure help enhance the test quality including lysing erythrocytes before incubating, washing<br />
off excess antibodies before testing, fixing and preserving procedure. Conclusion: It is needed<br />
to apply some improvement in staining, washing, fixing and preserving sample procedure for<br />
ensuring a good sample quality of immunophenotyping.<br />
* Key words: Leukemia; Immunophenotyping; Flow cytometry.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Bệnh bạch cầu cấp (BCC) (Lơ-xê-mi<br />
cấp) là một bệnh ung thư máu thường<br />
<br />
gặp trong chuyên khoa huyết học. TB ung<br />
thư có thể phát triển từ các TB gốc tạo<br />
máu chưa biệt hóa hoặc các TB đã biệt<br />
hóa thành dòng tủy hoặc dòng lympho.<br />
<br />
* Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương<br />
Người phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hai (hailexuan@yahoo.com)<br />
Ngày nhận bài: 20/12/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2016<br />
Ngày bài báo được đăng: 23/03/2016<br />
<br />
84<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br />
<br />
Việc xác định chính xác dòng TB, giai<br />
đoạn phát triển của TB có giá trị trong chẩn<br />
đoán, theo dõi, tiên lượng, xếp loại và lựa<br />
chọn phác đồ đi u trị phù hợp. Trước năm<br />
1976, việc chẩn đoán và xếp loại bệnh<br />
BCC hoàn toàn dựa vào hình thái học và<br />
hóa học TB theo tiêu chuẩn của FAB. Cuối<br />
th p kỷ 1990, WHO đã công nh n dấu ấn<br />
miễn dịch TB là một tiêu chuẩn chẩn đoán<br />
bắt buộc, h trợ xếp loại chính xác các<br />
bệnh lý tăng sinh ác tính có liên quan đến<br />
TB tạo máu. Ngày nay, trên thế giới, việc<br />
nh n biết các dấu ấn miễn dịch TB bằng kỹ<br />
thu t TB dòng chảy đã trở thành xét<br />
nghiệm thường quy nhằm h trợ xác định<br />
chính xác dòng TB ác tính và xếp loại dưới<br />
nhóm của bệnh, góp phần định hướng đi u<br />
trị và tiên lượng bệnh trước đi u trị. Việc áp<br />
d ng kỹ thu t này ở Việt Nam đã được tiến<br />
hành một vài năm, tuy nhiên đây là một kỹ<br />
thu t xét nghiệm có độ đặc hiệu và đòi hỏi<br />
độ chính xác cao, dễ dẫn tới dương tính giả<br />
hoặc âm tính giả nếu các thao tác không<br />
phù hợp. Vì v y, một khía cạnh quan trọng<br />
của kỹ thu t TB dòng chảy là tìm ra một<br />
quy trình xét nghiệm ổn định nhất, phù hợp<br />
nhất đối với đi u kiện c thể của m i phòng<br />
xét nghiệm. Chúng tôi thực hiện nghiên<br />
cứu này với m c tiêu: Phát hiện một số yếu<br />
tố ảnh hưởng của quy tr nh nhuộm, r a và<br />
cố định mẫu bệnh phẩm nhằm cải tiến và<br />
hoàn thiện xét nghiệm xếp loại theo kiểu<br />
h nh miễn dịch BCC bằng phương pháp<br />
phân tích TB dòng chảy.<br />
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
1. Đối tƣ ng nghiên cứu.<br />
Các quy trình xử lý bệnh phẩm làm xét<br />
nghiệm xếp loại miễn dịch đã công bố trên<br />
thế giới.<br />
<br />
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
* Thiết lập quy tr nh xếp loại miễn dịch<br />
sơ bộ cho bệnh BCC:<br />
Dựa trên tài liệu của các nhóm nghiên<br />
cứu khác nhau v xếp loại miễn dịch trong<br />
bệnh BCC và dựa trên các panel xếp loại<br />
BCC tham khảo từ các Hội nghị Quốc tế,<br />
đồng nghiệp trong và ngoài nước, chúng tôi<br />
tiến hành xây dựng quy trình xét nghiệm<br />
xếp loại miễn dịch sơ bộ.<br />
* Áp dụng sơ bộ quy tr nh xếp loại miễn<br />
dịch trên xét nghiệm thực tế:<br />
Dựa trên quy trình xét nghiệm đã thiết<br />
l p, tiến hành áp d ng trên thực tế. Tổng<br />
kết các mặt ưu điểm và hạn chế của kết<br />
quả thu được.<br />
* Hoàn thiện quy tr nh xét nghiệm xếp<br />
loại miễn dịch:<br />
Dựa trên kết quả thu được sau khi áp<br />
d ng, tiến hành một số đi u chỉnh trong<br />
quy trình, có so sánh trước và sau khi<br />
thay đổi để đưa ra nh n định:<br />
- So sánh giữa ly giải hồng cầu trước<br />
khi ủ kháng thể với ly giải hồng cầu sau<br />
khi ủ kháng thể.<br />
- Rửa mẫu so với không rửa mẫu sau<br />
khi ủ với kháng thể.<br />
- So sánh giữa sử d ng dung dịch cố<br />
định TB để bảo quản TB với không sử<br />
d ng dung dịch bảo quản TB.<br />
* Thu thập kết quả, so sánh và đánh giá<br />
các kết quả thu được:<br />
- Thu th p kết quả có được khi xếp loại<br />
miễn dịch theo quy trình ban đầu và quy<br />
trình có sửa đổi.<br />
85<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br />
<br />
- Đánh giá, so sánh kết quả khi thực<br />
hiện quy trình ban đầu với kết quả khi<br />
thực hiện với quy trình có thay đổi ở một<br />
bước nhất định.<br />
- Thống nhất áp d ng một số thay đổi<br />
có hiệu quả để có một quy trình tối ưu<br />
nhất.<br />
* Vật liệu nghiên cứu:<br />
- Bệnh phẩm nghiên cứu: 10 mẫu máu<br />
ngoại vi chống đông EDTA của 10 người<br />
khỏe mạnh (m i mẫu 2 ml).<br />
- Hóa chất, sinh phẩm: dung dịch PBS,<br />
dung dịch phá hồng cầu NH4Cl, dung dịch<br />
formaldehyde 40%, sodium azide dạng<br />
bột, huyết thanh bào thai bê, bộ kháng<br />
thể gắn chất màu hu nh quang.<br />
- Thực hiện trên máy đếm TB dòng chảy<br />
Navious (Hãng Beckmann Coulter).<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br />
BÀN LUẬN<br />
1. Xây dựng quy trình sơ b cho xét<br />
nghiệm xếp loại miễn dịch BCC.<br />
Qua tham khảo các quy trình xử lý<br />
mẫu và xét nghiệm xếp loại miễn dịch của<br />
tài liệu khác nhau trên thế giới [2, 3, 4, 5],<br />
chúng tôi nh n thấy một số điểm chung<br />
như sau:<br />
- Mẫu sử d ng xếp loại miễn dịch là<br />
máu hoặc dịch hút tủy xương chống đông<br />
bằng EDTA.<br />
<br />
Với các dữ kiện như trên, chúng tôi xây<br />
dựng quy trình sơ bộ dùng cho xử lý mẫu<br />
và xét nghiệm xếp loại kiểu hình miễn dịch<br />
như sau:<br />
Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy<br />
xương hoặc máu toàn phần), kháng thể<br />
pha sẵn, dung dịch PBS 1X, dung dịch<br />
lysing, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn,<br />
máy Vortex.<br />
Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể<br />
tương ứng vào ống nghiệm.<br />
Bước 3: hút 100 μl bệnh phẩm vào ống<br />
xét nghiệm, trộn đ u bằng máy Vortex.<br />
Bước 4: ủ h n hợp trên trong đi u kiện<br />
tối, 40C trong 30 phút.<br />
Bước 5: thêm 1 ml dung dịch ly giải<br />
hồng cầu vào ống nghiệm.<br />
Bước 6: tiếp t c ủ trong 10 phút.<br />
Bước 7: trộn đ u ống nghiệm bằng<br />
máy Vortex, đưa ống nghiệm vào máy<br />
đọc kết quả.<br />
2. Áp dụng thử nghiệm quy trình xét<br />
nghiệm xếp loại iểu hình miễn dịch.<br />
Với quy trình xét nghiệm sơ bộ trên,<br />
chúng tôi áp d ng trên hệ thống máy<br />
Navious-Beckman Coulter với 10 bệnh<br />
phẩm của người bình thường, các dấu ấn<br />
miễn dịch được phối hợp như sau:<br />
<br />
- Dung dịch phá hồng cầu NH4Cl.<br />
<br />
HLA-DRFITC - CD34PE - CD45ECD<br />
<br />
- Dung dịch pha loãng bệnh phẩm PBS.<br />
<br />
CD13FITC - CD33PE - CD45ECD<br />
<br />
- Bệnh phẩm cần được ủ với kháng<br />
thể trong đi u kiện tối, nhiệt độ 40C trong<br />
30 phút để đảm bảo gắn kết hoàn toàn.<br />
86<br />
<br />
- Ly tâm ở tốc độ 500 g/5 phút để thu<br />
cặn và loại bỏ dịch nổi chứa các kháng<br />
thể thừa.<br />
<br />
CD3FITC - CD19PE - CD45ECD - CD2PC5<br />
CD15FITC - CD117PE - CD45ECD<br />
CD20FITC - CD22PE - CD45ECD<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br />
<br />
Phân tích kết quả thu được khi nhuộm<br />
các dấu ấn trên với bệnh phẩm dựa trên<br />
quần thể TB đã khẳng định tính chính<br />
xác của kháng nguyên biểu hiện, quần<br />
thể dòng hạt dương tính mạnh với CD15,<br />
CD13, CD33; quần thể lympho dương<br />
tính với CD2, CD3, CD19, HLA-DR, CD20,<br />
CD22; quần thể mono dương tính với<br />
HLA-DR, CD33; các dấu ấn đặc trưng của<br />
m i dòng thì âm tính trên các dòng còn<br />
lại (ví d : CD19 âm tính trên dòng hạt,<br />
CD15 âm tính trên dòng lympho). Kết<br />
quả bước đầu như sau:<br />
Dương tính giả: 3/10 mẫu (30%); âm<br />
tính giả: 0 mẫu (0%).<br />
Quy trình xét nghiệm trên đã cơ bản<br />
đảm bảo khả năng gắn các kháng thể lên<br />
b mặt TB với tỷ lệ âm tính giả 0%. Tuy<br />
nhiên, tỷ lệ dương tính giả của các dấu<br />
ấn khá cao, tới 30%, do kháng thể thừa<br />
bám không đặc hiệu trên b mặt TB. Bên<br />
cạnh đó, còn một số vấn đ liên quan đến<br />
xử lý mẫu như hiện tượng cặn xơ, hạt<br />
mỡ, hồng cầu tồn đọng gây tắc kim và<br />
gây nhiễu trong quá trình phân tích.<br />
<br />
3. Hoàn thiện quy trình xếp loại iểu<br />
hình miễn dịch.<br />
* Ly giải hồng cầu:<br />
Qua áp d ng sơ bộ quy trình ban đầu,<br />
chúng tôi nh n thấy việc ly giải hồng cầu ở<br />
cuối quy trình không đảm bảo chất lượng<br />
xét nghiệm. Với cách ly giải hồng cầu này,<br />
các ống mẫu tồn dư nhi u cặn xơ, hạt mỡ,<br />
cửa sổ phân tích lẫn nhi u quần thể rác<br />
hoặc hồng cầu chưa tan hoàn toàn lẫn vào<br />
TB có nhân, dễ dẫn đến sai lệch kết quả.<br />
Một số phòng xét nghiệm trên thế giới áp<br />
d ng phương pháp ly giải hồng cầu, thu<br />
cặn bạch cầu trước khi ủ kháng thể.<br />
Phương pháp này có thể giúp tránh được<br />
ảnh hưởng của hóa chất ly giải hồng cầu<br />
đối với kháng thể sau ủ. Chúng tôi cải tiến<br />
quy trình trên bằng cách chuyển bước ly<br />
giải hồng cầu vào trước khi thu được cặn<br />
bạch cầu để ủ với kháng thể.<br />
So sánh hiệu quả của quy trình này với<br />
quy trình nêu trước đó, kết quả như sau:<br />
<br />
Bảng 1: So sánh kết quả giữa 2 quy trình ly giải hồng cầu trước và sau ủ.<br />
Ly giải hồng cầu sau hi ủ<br />
(n = 10)<br />
<br />
Ly giải hồng cầu trƣớc hi ủ<br />
(n = 10)<br />
<br />
Hạt mỡ trong ống xét nghiệm<br />
<br />
10/10 (100%)<br />
<br />
0/10 (0%)<br />
<br />
Cặn, xơ trong ống xét nghiệm<br />
<br />
8/10 (80%)<br />
<br />
0/10 (0%)<br />
<br />
Nhi u<br />
<br />
Ít<br />
<br />
1/10 (10%)<br />
<br />
0/10 (0%)<br />
<br />
Quần thể mảnh vỡ hồng cầu, cặn bẩn<br />
phân tích trên máy<br />
Hiện tượng tắc kim khi chạy máy<br />
<br />
Việc phá hồng cầu trước khi ủ bệnh phẩm với kháng thể giúp loại bỏ được cặn bẩn,<br />
hạt mỡ trong ống xét nghiệm. Đi u này cải thiện chất lượng bệnh phẩm khi phân tích<br />
trên máy, không bị lẫn các mảnh hồng cầu tồn dư hoặc rác với TB có nhân. Ngoài ra,<br />
việc phá hồng cầu trước khi ủ cũng cải thiện hiện tượng tắc kim khi chạy máy.<br />
87<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016<br />
<br />
* R a bệnh phẩm sau ủ kháng thể:<br />
Một nguyên nhân khác gây nên hiện<br />
tượng dương tính giả khi phân tích TB<br />
dòng chảy là do thừa kháng thể trong quá<br />
trình ủ. Khi lượng kháng thể thừa so với<br />
số TB đưa vào, chúng có thể bám không<br />
đặc hiệu lên TB với ái lực thấp và cho tín<br />
hiệu dương tính đối với cảm biến của<br />
máy đếm, gây sai lệch kết quả. Để giải<br />
quyết vấn đ này, chúng tôi bổ sung<br />
bước rửa bệnh phẩm sau khi ủ bằng<br />
cách: thêm 2 ml PBS vào h n hợp sau ủ,<br />
ly tâm 500 g/5 phút, hút dịch nổi và tái<br />
huy n dịch lại bằng 1 ml PBS.<br />
Bảng 2: So sánh kết quả giữa 2 quy<br />
trình có rửa và không rửa kháng thể.<br />
<br />
Tỷ lệ dương tính giả<br />
Mức độ t p trung của<br />
tín hiệu phân tích<br />
<br />
Kh ng rửa<br />
háng thể<br />
<br />
Có rửa<br />
háng thể<br />
<br />
4/10 (40%*)<br />
<br />
0/10 (0%)<br />
<br />
Phân tán<br />
<br />
T p trung<br />
<br />
(* Các dấu ấn thường có hiện tượng<br />
dương tính giả gồm CD22, CD20, CD15).<br />
Việc rửa kháng thể thừa sau khi ủ với<br />
bệnh phẩm là bước quan trọng, giúp tối<br />
ưu hóa kết quả phân tích trên máy đếm<br />
TB dòng chảy.<br />
Qua 2 bước cải tiến trên, chúng tôi<br />
đưa ra quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm<br />
xếp loại kiểu hình miễn dịch hoàn thiện<br />
như sau:<br />
- Kỹ thu t xử lý mẫu trước khi xếp loại<br />
kiểu hình miễn dịch:<br />
Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy xương<br />
hoặc máu toàn phần), kháng thể pha sẵn,<br />
dung dịch PBS 1X, dung dịch ly giải hồng<br />
cầu, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn, máy<br />
Vortex.<br />
88<br />
<br />
Bước 2: ủ bệnh phẩm với dung dịch ly<br />
giải theo tỷ lệ 1/15 trong 10 phút.<br />
Bước 3: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch<br />
nổi, thu cặn bạch cầu.<br />
Bước 4: tái huy n dịch cặn bằng 2 ml<br />
dung dịch PBS 1X.<br />
Bước 5: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi,<br />
thu cặn bạch cầu.<br />
- Kỹ thu t ủ kháng thể xếp loại kiểu<br />
hình miễn dịch:<br />
Bước 1: tái huy n dịch cặn bằng dung<br />
dịch PBS 1X, pha loãng đảm bảo nồng độ<br />
106 bạch cầu/μl dung dịch (theo số đếm<br />
bạch cầu).<br />
Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể<br />
tương ứng vào ống nghiệm.<br />
Bước 3: hút 100 μl dung dịch bạch cầu<br />
đã chuẩn bị vào ống xét nghiệm, trộn đ u<br />
bằng máy Vortex.<br />
Bước 4: ủ h n hợp trên trong đi u kiện<br />
tối, 40C trong 30 phút.<br />
Bước 5: thêm 2 ml PBS vào h n hợp<br />
sau ủ, ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi,<br />
thu cặn bạch cầu đã gắn kháng thể.<br />
Bước 6: thêm 1 ml dung dịch PBS 1X<br />
vào ống nghiệm, trộn đ u bằng máy Vortex,<br />
đọc kết quả sau khi chạy máy.<br />
* Bảo quản bệnh phẩm bằng dung dịch<br />
cố định TB:<br />
Một vấn đ khó khăn là bệnh phẩm chỉ<br />
có thể lưu giữ trong vòng 48 giờ. Sau thời<br />
gian này, TB có xu hướng thoái hóa, vón<br />
t lại và không còn đảm bảo tính chính<br />
xác khi phân tích. Vì v y, chúng tôi áp<br />
d ng phương pháp bảo quản bệnh phẩm<br />
bằng cách sử d ng dung dịch cố định TB<br />
và dung dịch bảo quản TB pha chế theo<br />
công thức tham khảo từ nhi u tài liệu<br />
nghiên cứu.<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
