Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR phát hiện nhanh vi khuẩn salmonella spp. gây ngộ độc thực phẩm

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR PHÁT HIỆN<br /> NHANH VI KHUẨN SALMONELLA SPP. GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM<br /> Trần Hoàng Ngâu, Nguyễn Bá Thọ, Phạm Văn Quan<br /> Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM<br /> Ngày gửi bài: 09/5/2016<br /> Ngày chấp nhận đăng: 30/5/2016<br /> TÓM TẮT<br /> Salmonella spp. là vi khuẩn có khả năng nhiễm vào bất cứ công đoạn nào của quá trình chế biến và bảo<br /> quản thực phẩm, nhất là thực phẩm tươi sống. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu một số yếu tố ảnh<br /> hưởng đến phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm phát hiện nhanh Salmonella spp. so với các kỹ<br /> thuật sinh hóa truyền thống. Bộ genome của Salmonell spp. được thu nhận từ phương pháp dung dịch tách chiết<br /> (I, II, III, IV). Trình tự gen độc tố (enterotoxin) được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu<br /> khác nhau như UNI_O, UNI_I, InvA_fr, InvA_12. Nồng độ tối ưu của thành phần tham gia trong phản ứng PCR<br /> là dNTPs và enzyme Taq Polymerase đều là 0.1mM để cho band DNA rõ nhất. Kết quả này giúp hoàn thiện<br /> bước đầu việc nghiên cứu sản xuất bộ kit PCR thương mại phát hiện nhanh Salmonella spp. trong khoảng thời<br /> gian 3-5 giờ có ý nghĩa trong an toàn thực phẩm.<br /> Từ khóa: Gen độc tố, Salmonella spp., InvA gene, bộ kit PCR<br /> STUDY OF INFLUENTIAL ELEMENTS IN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) TO<br /> DIAGNOGIS SALMONELLA SPP. FROM FOODING POISONING<br /> ABSTRACT<br /> Salmonella spp. bacteria is able to infect at any stage of processing and preserving food, especially fresh<br /> food. In this study, we invesgated influential elements in PCR test in order to identify fast Salmonella spp.<br /> compared to traditionally biochemistry techniques. Salmonella genome is extracted from isolation chemical<br /> compounds set (I, II, III, IV). Enterotoxin genes isolated from its are amplified by PCR technique with many<br /> differently specifical primers, such as: UNI_O, UNI_I, InvA_fr, InvA_12. Optimal concentration of dNTPs and<br /> Taq Polymerase is 0.1mM to discover clear and bright DNA bands. This study helping to produce PCR kits<br /> market is important to diagnosis poising bacteria from food safety.<br /> Key words: Enterotoxin gene, Salmonella spp., InvA gene, PCR kit<br /> <br /> 1. Đặt vấn đề<br /> Dựa theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7926 – 2008) vi sinh vật trong thực phẩm yêu<br /> cầu lượng Salmonella trong 25g là 0. Vì vậy, hiện nay có nhiều phương pháp được sử dụng để<br /> phát hiện nhóm vi khuẩn này. Các phương pháp để phân tích Salmonella trong thực phẩm đa<br /> phần là sử dụng các phản ứng sinh hóa và ELISA nhưng các phương pháp này tốn thời gian từ<br /> 5-7 ngày và rất tốn kém tiền bạc. Do đó, nhu cầu sử dụng các phương pháp phát hiện<br /> Salmonella nhanh, nhạy và chính xác rất cao<br /> Hiện nay những tiến bộ của sinh học phân tử đã được áp dụng nhiều trong các lĩnh vực<br /> nghiên cứu khoa học. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một trong những tiến bộ<br /> có thể phát hiện các dòng vi khuẩn thông qua việc khuyếch đại các đoạn DNA bằng các cặp<br /> mồi đặc hiệu. PCR có thể phát hiện ra một lượng nhỏ DNA bị trộn lẫn trong hỗn hợp các<br /> DNA khác nhau. Nhiều kỹ thuật PCR đã được sử dụng để phát hiện Salmonella như PCR đơn<br /> mồi hoặc đa mồi. Với mục đích sản xuất thương mại hóa bộ kit PCR để phát hiện nhanh<br /> Salmonella spp. trong thực phẩm tại cơ sở, chúng tôi tiến hành nghiên cứu và tối ưu hóa các<br /> thành phần tham gia trong phản ứng PCR đơn mồi với lần lượt các cặp mồi UNI và InvA.<br /> Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát một số cặp mồi đặc hiệu và xác định nồng độ tối<br /> ứu của dNTPs, Taq Polymerase nhằm xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella spp.<br /> Trong bài báo, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu quy trình tách chiết tối ưu thu nhận<br /> 34<br /> <br /> DNA genome của Salmonella spp. trong mẫu thực phẩm, kỹ thuật PCR đơn mồi với các cặp<br /> mồi đặc hiệu khác nhau phát hiện trình tự gen độc tố (enterotoxin) và nồng độ tối ưu của 2<br /> yếu tố ảnh hưởng đến PCR là dNTPs, Taq Polymerase.<br /> 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu<br /> 2.1. Vật liệu<br /> Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập trong mẫu thực phẩm tự nhiên và<br /> cung cấp từ Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh và Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội.<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.2.1. Khảo sát phân lập và định danh Salmonella spp. từ các nguồn thực phẩm tự nhiên<br /> Mẫu thu nhận gồm lòng đỏ và trắng của trứng vịt (DT), vỏ trứng vịt (VT), thịt gà (TG),<br /> cà chua (CC), thịt heo (TH), sò (S1), sữa (S2), tôm (T), ruột gà (RG), thịt bò (TB). Mẫu được<br /> tăng sinh trên môi trường BHI, sau đó cấy ria lên môi trường XLD, ủ ở 370C trong 18-24h.<br /> Quan sát khuẩn lạc tròn, màu hồng, trong suốt, có tâm đen. Tiến hành các thử nghiệm định<br /> danh bằng các phản ứng sinh hóa như nhuộm Gram, H2S, LDC, Urea, Sorbitol, Indol, Vosges<br /> Proskauer (VP). (Trần Hoàng Ngâu, 2015).<br /> 2.2.2. Khảo sát phương pháp tách chiết DNA genome tối ưu của Salmonella spp.<br /> Thí nghiệm được khảo sát trên các mẫu Salmonella spp. dương tính. Chọn lọc 3 phương<br /> pháp để khảo sát quy trình tách chiết và thu nhận DNA genome tối ưu là: đệm TE và nhiệt độ,<br /> Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol (25:24:1), bằng dung dịch tách chiết (I, II, III, IV)<br /> (Trần Hoàng Ngâu, 2015).<br /> 2.2.3. Khảo sát phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau<br /> Tổng thể tích của phản ứng PCR là 50µl. Các thao tác đều thực hiện trên đá. Chu kỳ phản<br /> ứng PCR gồm: (1) biến tính 950C, 5 phút; (2) bắt cặp, 720C, 30 giây; (3) kéo dài 720C, 1 phút,<br /> 35 chu kỳ. Tiến hành khuếch đại trình tự DNA thu nhận bằng phản ứng PCR với các cặp mồi<br /> đặc hiệu có trình tự nucleotide là:<br /> Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi đặc hiệu<br /> Ký hiệu<br /> Kích thước sản phẩm<br /> Trình tự mồi (5’-3’)<br /> mồi<br /> PCR (bp)<br /> GTGTAGCGGTGAAATGCG<br /> UNI_O<br /> 709bp<br /> ACGGGCGGTGTGTACAA<br /> GGTGGAGCATGTGGTTTA<br /> UNI_I<br /> 287bp<br /> CCATTGTAGCACGTGTGT<br /> GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA<br /> InvA_12<br /> 284bp<br /> TCATCGCACCGTCAAAGGAACC<br /> TGGCATTATCGATCAGTACCAG<br /> InvA_fr<br /> 600bp<br /> AACAGCTGCGTCATGATATTCC<br /> 2.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dNTPs và Taq Polymerase đến phản ứng PCR<br /> Tiến hành khảo sát sự biến thiên của nồng độ khác nhau dNTPs (0.1mM ÷ 0.6mM) và<br /> của enzyme Taq polymerase (0.1µl ÷ 0.6µl) để xác định vạch band DNA sáng nhất (Trần<br /> Hoàng Ngâu, 2015).<br /> 2.3. Điều kiện thí nghiệm<br /> Hóa chất và môi trường sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp bởi Bioline<br /> (www.Bioline.com) và Macrogen (www.Macrogen.com) và bảo quản trong điều kiện nhiệt độ<br /> 35<br /> <br /> là -40C. Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Đại học Công<br /> nghiệp Thực phẩm Tp. Hồ Chí Minh.<br /> 2.4. Phương pháp định tính và định lượng DNA thu nhận<br /> Kết quả DNA thu nhận được định tính bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 1.2%,<br /> thời gian là 21phút, hiệu điện thế là 100V và định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang<br /> ở hai bước sóng là 260nm và 280nm.<br /> 2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu<br /> Các nghiệm thức được bố trí một cách hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) và số liệu thu nhận<br /> được xử lý thống kê phần mềm Statgraphics centurion.<br /> 3. Kết quả nghiên cứu và bàn luận<br /> 3.1. Khảo sát phân lập và định danh Salmonella spp. từ các nguồn thực phẩm tự nhiên<br /> Tiến hành phân lập chủng lấy ở mẫu thực phẩm quanh khu vực chợ Sơn Kỳ quận Tân<br /> Phú, Tp.HCM trên môi trường XLD, xuất hiện khuẩn lạc có tâm đen và màu môi trường thay<br /> đổi. Từ đó, thu được 2 mẫu có biểu hiện đúng trên 10 mẫu.<br /> Bảng 3.1: Kết quả phân lập trên môi trường XLD<br /> STT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> <br /> Tên mẫu<br /> DT<br /> VT<br /> TH<br /> CC<br /> TG<br /> S1<br /> S2<br /> T<br /> RG<br /> TB<br /> <br /> Có tâm đen, môi trường<br /> đổi màu<br /> +<br /> +<br /> -<br /> <br /> Nhận/Loại<br /> Loại<br /> Loại<br /> Nhận<br /> Loại<br /> Nhận<br /> Loại<br /> Loại<br /> Loại<br /> Loại<br /> Loại<br /> <br /> Chú thích: (+) vi khuẩn có tâm đen và màu môi trường XLD thay đổi; (-) vi khuẩn không có tâm đen và<br /> lam thay đổi màu môi trường.<br /> <br /> Kết quả nhuộm Gram cho thấy 2 mẫu thịt heo (TH) và thịt gà (TG) là vi khuẩn Gram âm,<br /> dạng hình que ngắn đặc trưng cho Salmonella. Chọn chủng TH làm đại diện để tiến hành định<br /> danh mẫu TH đến cấp loài. Mẫu được giữ trên đĩa petri nuôi cấy trên môi trường XLD gửi<br /> đến Phòng Xét nghiệm Nam Khoa-Biotek (793/58 Trần Xuân Soạn, P. Tân Hưng, Q.7, TP.<br /> HCM) để định danh khoa học đến cấp loài. Kết quả mẫu TH là vi khuẩn Salmonella spp.<br /> 3.2. Khảo sát phương pháp tách chiết DNA genome tối ưu của Salmonella spp.<br /> Theo kết quả định lượng ở biểu đồ 3.1, khi tách chiết bằng 3 phương pháp là phương<br /> pháp shock nhiệt, phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), dung dịch tách chiết thì<br /> phương pháp tách bằng dung dịch tách chiết (I, II, III, IV) đạt kết quả tốt nhất là 1.811. Thông<br /> thường tỉ số O260/O280 nằm trong khoảng từ 1,8 – 2,0 thì sản phẩm DNA tinh sạch, không lẫn<br /> 36<br /> <br /> protein và các tạp chất khác. Vậy sản phẩm DNA genome thu nhận được sử dụng cho các thí<br /> nghiệm tiếp theo.<br /> Biểu đồ 3.1: So sánh kết quả đo mật độ quang của Samonella spp. bằng phương pháp shock nhiệt, phenol:<br /> chloroform: isoamyl alcohol, dung dịch tách chiết DNA<br /> <br /> Nồng độ DNA<br /> <br /> 0.5<br /> <br /> 0.411<br /> <br /> 0.4<br /> <br /> λ=260nm<br /> λ=280nm<br /> <br /> 0.285<br /> <br /> 0.3<br /> <br /> 0.227<br /> 0.173<br /> <br /> 0.2<br /> 0.1<br /> <br /> 0.047<br /> <br /> 0.038<br /> <br /> 0<br /> <br /> Shock nhiệt<br /> <br /> Dung dịch<br /> tách chiết<br /> <br /> DNA<br /> <br /> Phenol<br /> Chloroform:<br /> Isoamyl alcohol<br /> <br /> Theo kết quả định tính ở hình 3.1, giếng số 1 là kết quả tách theo dung dịch tách chiết (I,<br /> II, III, IV) có nồng độ DNA cao, band DNA rõ và đậm nhưng còn nhiễm tạp chất. Do đó,<br /> DNA genome của Salmonella spp. trong các nghiệm thức được thu nhận từ phương pháp tách<br /> chiết của hỗn hợp các dung dịch (I, II, III, IV).<br /> <br /> Hình 3.1: Định tính DNA genome của vi khuẩn Samonella spp. Trong đó: M là thang DNA chuẩn có kích thước 1kb.<br /> Giếng 1 là mẫu DNA tách bằng dung dịch tách chiết DNA. Giếng 2 là mẫu DNA tách bằng phương pháp phenol:<br /> chloroform: isoamyl alcohol. Giếng 3: mẫu DNA tách bằng shock nhiệt<br /> <br /> 3.3. Khảo sát phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu khác nhau<br /> <br />  Kết quả PCR với mồi UNI_O<br /> Ở hình 3.2 cho thấy giếng 1(TG), giếng 2(TH), sản phẩm DNA khuyếch đại có kích<br /> thước là 709bp. So sánh với mẫu đối chứng dương, chứng tỏ cặp mồi UNI_O đã được thiết kế<br /> đặc hiệu cho phản ứng PCR.<br /> <br /> Hình 3.2: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp. với cặp mồi Uni_O. Trong đó: T<br /> là thang DNA chuẩn 1kb. Giếng 1: là mẫu TG. Giếng 2: là mẫu TH. Giếng 3,4:<br /> là mẫu đối chứng dương. Giếng 5: Đối chứng âm.<br /> <br /> <br /> <br /> Kết quả PCR với mồi UNI_I<br /> 37<br /> <br /> Ở hình 3.3 cho thấy các giếng 1(TG), giếng 2 (TH) , giếng 3 và 4 (đối chứng dương) đều<br /> cho ra kết quả bằng nhau, đối chiếu với thang DNA chuẩn có kích thước là 287bp. Như vậy,<br /> cặp mồi UNI_I được thiết kế đặc hiệu để khuyếch đại trình tự đoạn gen trong PCR.<br /> <br /> Hình 3.3: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp. với cặp mồi Uni_I. Trong đó:<br /> T là thang DNA chuẩn 1kb. Giếng 1: là mẫu TG. Giếng 2: là mẫu TH. Giếng<br /> 3, 4: đối chứng dương. Giếng 5: đối chứng âm.<br /> <br />  Kết quả PCR với mồi InvA_fr<br /> Ở hình 3.4 cho thấy các giếng 1(TG), giếng 2 (TH) , giếng 3 và 4 (đối chứng dương) đều<br /> cho ra kết quả bằng nhau, đối chiếu với thang DNA chuẩn có kết quả là 600bp. Chứng tỏ cặp<br /> mồi InvA_fr thiết kế đặc hiệu cho trình tự đoạn gen InvA (600bp) của vi khuẩn Salmonella<br /> spp.<br /> <br /> Hình 3.4: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp. với cặp mồi InvA_fr. Trong đó: T là thang DNA chuẩn 1kb.<br /> Giếng 1: là mẫu TG. Giếng 2: là mẫu TH. Giếng 3,4: là đối chứng dương. Giếng 5: Đối chứng âm.<br /> <br /> So sánh với nghiên cứu của Galan (1991), trình tự gen InvA đặc trưng để phát hiện vi<br /> khuẩn Salmonella, không thấy xuất hiện ở các nhóm vi khuẩn khác. Kết quả nghiên cứu của<br /> chúng tôi của cũng thu nhận được sản phẩm PCR có kích thước tương tự (600bp).<br />  Kết quả PCR DNA với mồi InvA_12<br /> <br /> Hình 3.6: Mẫu PCR DNA của Salmonella spp. với cặp mồi Uni_O. Trong đó: T là thang DNA 1kb. Giếng 1:<br /> dNTPs ở 0.1mM. Giếng 2: dNTPs ở 0.2mM. Giếng 3: dNTPs ở 0.3mM. Giếng 4: dNTPs ở 0.4mM. Giếng 5:<br /> dNTPs ở 0.5mM. Giếng 6: dNTPs ở 0.6mM.<br /> <br /> Kết quả PCR với mồi InvA_12 ở hình 3.5 cho thấy các giếng 1(TG), giếng 2 (TH),<br /> giếng 3 và 4 (đối chứng dương) đều cho ra kết quả bằng nhau, đối chiếu với thang DNA<br /> 38<br /> <br />