TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br />
<br />
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT ELISA<br />
ĐỊNH LƢỢNG NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA<br />
Hà Thị Hải*; Nguyễn Ngọc Tuấn**; Nguyễn Trung Nguyên***<br />
Phùng Thế Hải**; Nguyễn Đặng Dũng**<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: xây dựng bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Việt Nam<br />
(Naja atra). Đối tượng và phương pháp: bộ xét nghiệm ELISA sử dụng huyết thanh kháng nọc<br />
rắn N.atra đặc hiệu từ ngựa và thỏ; tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, xác định<br />
ngưỡng phát hiện và giới hạn định lượng của bộ xét nghiệm. Kết quả: ngưỡng phát hiện (LOD)<br />
của bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn Hổ mang N.atra là 0,87 ng/ml, giới hạn định lượng<br />
(LOQ) là 1,27 ng/ml; bộ kít đạt yêu cầu về độ nhạy, độ ổn định và độ đúng.<br />
* Từ khóa: Nọc rắn; Naja atra; ELISA.<br />
<br />
Development of Quantitative ELISA Test Kit for the Detection of<br />
Chinese Cobra (Naja atra) Venom<br />
Summary<br />
Objective: To develop an ELISA test for venom quantitation in clinical samples of snakebite<br />
victims by Chinese cobra (Naja atra). Materials and methods: An ELISA testkit (developed using<br />
horse and rabbit sera specific to N.atra venom) was optimized for reaction conditions, as well as<br />
limit of detection (LoD), limit of quantitation (LoQ). Results: LoD and LoQ values of the test for<br />
were 0.87 ng/ml and 1.27 ng/ml, respectively; the test was primarily qualified for analytical<br />
sensitivity, reproducibility and accuracy.<br />
* Key words: Venom; Naja atra; ELISA.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Với nạn nhân rắn độc cắn, việc đánh<br />
giá mức độ nhiễm độc có giá trị hỗ trợ<br />
cho việc theo dõi tiến triển bệnh nhân<br />
(BN), chỉ định điều trị bằng huyết thanh<br />
kháng nọc đặc hiệu và tiên lượng bệnh.<br />
Tuy nhiên, việc phân mức độ nhiễm độc<br />
<br />
đối với nạn nhân rắn độc cắn nói chung,<br />
với rắn Hổ mang nói riêng chủ yếu dựa<br />
vào kinh nghiệm lâm sàng của bác sỹ<br />
điều trị nạn nhân rắn độc cắn. Do vậy,<br />
có sự khác nhau giữa các trung tâm<br />
điều trị nạn nhận rắn độc cắn. Xét nghiệm<br />
xác định nọc rắn định tính và định lượng<br />
được xem là cơ sở khoa học khách quan,<br />
<br />
* §¹i häc Y Th¸i B×nh<br />
** Häc viÖn Qu©n y<br />
*** BÖnh viÖn B¹ch Mai<br />
Người phản hồi (Corresponding): NguyÔn §Æng Dòng (dzungmd@yahoo.com)<br />
Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015<br />
Ngày bài báo được đăng: 28/01/2015<br />
<br />
38<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br />
<br />
giúp phân loại mức độ nhiễm độc nọc rắn<br />
trên lâm sàng. Dựa trên kết quả định lượng<br />
nồng độ nọc rắn trong máu nạn nhân, đối<br />
chiếu với sự xuất hiện và mức độ biểu hiện<br />
của một số triệu chứng, bác sỹ điều trị có<br />
thể đánh giá một cách khách quan hơn<br />
mức độ nhiễm độc nọc rắn và đặc biệt, có<br />
thể chỉ định và/hoặc điều chỉnh liều sử<br />
dụng huyết thanh kháng nọc đặc hiệu<br />
cho nạn nhân. Kỹ thuật ELISA (EnzymeLinked Immunosorbent Assay) là phương<br />
pháp phân tích miễn dịch dựa trên tương<br />
tác giữa kháng nguyên và kháng thể, với<br />
một số ưu điểm đáng kể là độ nhạy phân<br />
tích cao, tương đối dễ thực hiện, thời gian<br />
thực hiện không kéo dài, có thể thực hiện<br />
đồng thời với nhiều mẫu hoặc thực hiện<br />
từng mẫu thử. Trong nghiên cứu này,<br />
chúng tôi tiến hành xây dựng và tối ưu<br />
hóa những điều kiện chủ yếu cho một hệ<br />
thống kít ELISA sử dụng lượng nọc rắn<br />
Hổ mang Naja atra trên in vitro.<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
<br />
1. Vật liệu nghiên cứu.<br />
* Sinh phẩm, hóa chất:<br />
- Nọc rắn Hổ mang miền Bắc (Naja atra).<br />
- Kháng thể IgG ngựa kháng nọc rắn<br />
Hổ mang Naja atra (Đài Loan), kháng thể<br />
IgG thỏ kháng nọc rắn Hổ mang Naja atra<br />
(Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y),<br />
kháng thể kháng IgG thỏ gắn enzym (Thermo).<br />
- Các hóa chất: OPD, gelatin, PBS...<br />
(Hãng Sigma và Merck).<br />
* Dụng cụ, thiết bị:<br />
- Micropipette và đầu côn các loại: 2 µl,<br />
10 µl, 20 µl, 200 µl, 1.000 µl.<br />
- Pipet đa kênh loại 100 - 300 µl.<br />
- Phiến ELISA 96 giếng (Corning).<br />
- Tủ ấm.<br />
- Máy đo mật độ quang DTX 880<br />
(Beckman Coulter).<br />
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
* Nguyên lý phản ứng:<br />
<br />
Hình 1: Sơ đồ thiết kế và các bước tiến hành phản ứng ELISA.<br />
39<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br />
<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br />
BÀN LUẬN<br />
<br />
Thiết kế phản ứng dựa dựa trên<br />
nguyên lý của kỹ thuật ELISA sandwich<br />
(hình 1), trong đó kháng thể thứ nhất (KT1)<br />
là kháng thể IgG đặc hiệu với nọc rắn Hổ<br />
<br />
1. Xác định các điều kiện tối ƣu của<br />
phản ứng.<br />
<br />
mang Naja atra (sử dụng làm kháng thể bắt<br />
giữ), gắn cố định trên bề mặt giếng phản<br />
ứng (pha rắn - solid phase); kháng thể thứ<br />
hai (KT2 - kháng thể phát hiện) là kháng thể<br />
đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, nhưng<br />
có nguồn gốc khác với kháng thể bắt giữ;<br />
kháng thể thứ ba (KT3) kháng thể kháng lại<br />
kháng thể phát hiện, được gắn enzym<br />
horse-radish peoxidase (HRP).<br />
* Xây dựng và tối ưu hóa hệ thống ELISA<br />
định lượng nọc rắn:<br />
- Xác định các điều kiện tối ưu của phản<br />
ứng.<br />
- Xây dựng đường chuẩn tương quan<br />
tuyến tính giữa mật độ quang (OD) của<br />
dung dịch phản ứng và nồng độ nọc rắn<br />
chuẩn.<br />
- Xác định ngưỡng phát hiện của bộ kít.<br />
- Xác định độ ổn định của bộ kít bằng<br />
cách tính toán hệ số biến thiên (CV) giữa<br />
các lần thực hiện phản ứng độc lập nhau.<br />
- Xác định độ đúng của kỹ thuật bằng<br />
cách tính toán tỷ lệ phục hồi (%) sau khi tiến<br />
hành định lượng trên mẫu chuẩn với nồng<br />
<br />
Nhằm đạt độ nhạy và độ chính xác cao<br />
nhất khi phân tích bằng phương pháp<br />
ELISA, tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết<br />
quả phân tích cần được khảo sát. Dưới đây<br />
là một số thông số để phản ứng đạt được<br />
mật độ quang (OD) tối ưu và phù hợp nhất<br />
cho phản ứng bao gồm:<br />
- Nọc rắn chuẩn pha trong dung dịch FBS.<br />
- Nồng độ kháng thể gắn bản (IgG ngựa<br />
kháng nọc rắn) 10 µg/ml.<br />
- Nồng độ kháng thể phát hiện (IgG thỏ<br />
kháng nọc rắn) 5 µg/ml.<br />
- Kháng thể gắn enzym pha loãng ở tỷ lệ<br />
thể tích 1:10.000 trong dung dịch PBS-T<br />
(0,05% Tween).<br />
- Dung dịch blocking: gelatin 1%.<br />
- Nồng độ cơ chất 0,5 mg/ml OPD pha<br />
trong đệm citrate có bổ sung 0,006% H2O2.<br />
- Thời gian ủ mẫu 60 phút, ủ kháng thể<br />
phát hiện 30 phút, ủ kháng thể gắn enzym<br />
30 phút và ủ cơ chất 10 phút.<br />
- Nhiệt độ áp dụng 37oC.<br />
2. Xây dựng đƣờng chuẩn.<br />
<br />
lượng nọc rắn Hổ mang Naja atra trên nạn<br />
<br />
Tổng số nọc rắn 1 mg/ml, pha thành các<br />
nồng độ: 100 ng/ml; 31,6 ng/ml; 10 ng/ml; 3<br />
ng/ml; 1 ng/ml và 0,3 ng/ml (pha trong dung<br />
dịch FBS). Qua nghiên cứu, chúng tôi đã<br />
<br />
nhân đã được chẩn đoán xác định là bị rắn<br />
<br />
xây dựng được khoảng tuyến tính từ 0,3 -<br />
<br />
Hổ mang Naja atra cắn. Do đó, trong nghiên<br />
<br />
31,6 ng/ml có OD từ 0,06 - 0,6 (R2 = 0,999;<br />
<br />
cứu này, chúng tôi không tiến hành khảo sát<br />
<br />
hình 2).<br />
<br />
độ nọc rắn đã biết.<br />
Mục đích phát triển bộ kít là nhằm định<br />
<br />
độ đặc hiệu chẩn đoán của bộ kít đã xây<br />
dựng.<br />
<br />
40<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br />
<br />
Nång ®é näc r¾n chuÈn<br />
<br />
Bảng 1: Độ nhạy của bộ kít ELISA (LOD<br />
và LOQ).<br />
L O D<br />
<br />
L O Q<br />
<br />
O D<br />
S è<br />
c h ø n Sg D<br />
g iÕ n g<br />
© m<br />
<br />
Nồng<br />
<br />
Nồng<br />
<br />
độ<br />
<br />
OD<br />
<br />
MËt ®é quang OD<br />
<br />
24<br />
<br />
0,073<br />
<br />
0,001 0,075<br />
<br />
độ<br />
<br />
OD<br />
<br />
(ng/ml)<br />
0,82<br />
<br />
(ng/ml)<br />
0,083<br />
<br />
1,27<br />
<br />
Như vậy, LOD của phản ứng có mật độ<br />
Hình 2: Đồ thị đường chuẩn của<br />
phản ứng.<br />
<br />
quang 0,075 và LOQ là 0,083. Dựa theo<br />
đường chuẩn, LOD, tính theo nồng độ của<br />
nọc rắn tổng số là 0,87 ng/ml và LOQ tương<br />
ứng là 1,27 ng/ml.<br />
4. Kết quả xác định độ ổn định và độ<br />
đúng của phƣơng pháp.<br />
Bảng 2: Hệ số biến thiên.<br />
M<br />
M É u<br />
Mo (ng/ml)<br />
t h ö<br />
<br />
H Ö<br />
c ñ a<br />
<br />
l Ë p<br />
<br />
Hình 3: Phản ứng ELISA với mẫu<br />
nọc rắn chuẩn.<br />
3. Xác định ngƣỡng phát hiện của bộ<br />
kít.<br />
Độ nhạy của phản ứng được đại diện bởi<br />
giới hạn phát hiện (LOD: Limit of Detection)<br />
và giới hạn định lượng (LOQ: Limit of<br />
Quantification). LOD là lượng thấp nhất chất<br />
cần thử trong mẫu thử còn có thể phát hiện<br />
được mà không nhất thiết phải xác định<br />
chính xác hàm lượng. LOQ là lượng thấp<br />
nhất chất cần thử có trong mẫu thử còn có<br />
thể xác định được với mức độ đúng và<br />
chính xác thích hợp.<br />
<br />
(ng/ml)<br />
<br />
t h iª n<br />
(<br />
<br />
® é<br />
® Þn h<br />
(<br />
<br />
1<br />
<br />
15<br />
<br />
14,93 ± 0,38<br />
<br />
2,12<br />
<br />
97,88<br />
<br />
2<br />
<br />
45<br />
<br />
44,18 ± 0,62<br />
<br />
1,4<br />
<br />
98,6<br />
<br />
3<br />
<br />
75<br />
<br />
74,15 ± 1,67<br />
<br />
2,25<br />
<br />
97,75<br />
<br />
1,92<br />
<br />
98,1<br />
<br />
Trung bình<br />
<br />
Độ ổn định được thể hiện bằng hệ số<br />
biến thiên giữa các lần thực hiện phản ứng<br />
với mẫu nọc rắn chuẩn. Trong nghiên cứu<br />
này, chúng tôi xác định hệ số biến thiên (CV:<br />
coefficient of variation) sau khi thực hiện lặp<br />
lại phản ứng 6 lần trên cùng một khay phản<br />
ứng ELISA, bằng cách sử dụng công thức<br />
tính toán: CV = SD/M x 100 (%), trong đó, M<br />
<br />
Từ mật độ quang của mẫu chứng âm, độ<br />
nhạy của phản ứng được tính toán và trình<br />
bày ở bảng 1.<br />
41<br />
<br />
là giá trị nồng độ đo được dựa vào đường<br />
chuẩn, SD là độ lệch chuẩn.<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015<br />
<br />
Bảng 3: Tỷ lệ phục hồi trên mẫu chuẩn.<br />
M<br />
<br />
T û<br />
<br />
M É u<br />
Mo (ng/ml)<br />
<br />
c ñ a<br />
<br />
h å i<br />
<br />
o<br />
<br />
x<br />
<br />
t h ö<br />
t h ù c (ng/ml)<br />
<br />
1<br />
<br />
1<br />
<br />
15<br />
<br />
14,68 ± 1,16<br />
<br />
97,8<br />
<br />
2<br />
<br />
45<br />
<br />
44,5 ± 2,7<br />
<br />
98,88<br />
<br />
3<br />
<br />
75<br />
<br />
73,48 ± 3,58<br />
<br />
97,97<br />
<br />
Trung bình<br />
<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
<br />
đúng của phương pháp, được tính theo<br />
công thức: M/Mo x 100, trong đó M là giá trị<br />
đo được dựa vào đường chuẩn, Mo là giá trị<br />
thực (nồng độ mẫu chuẩn đã biết trước). Để<br />
xác định tỷ lệ phục hồi và độ lặp lại giữa các<br />
lần thực hiện độc lập nhau (cùng một quy<br />
trình và do 3 người khác nhau thực hiện,<br />
mỗi người lặp lại 3 lần), mẫu nọc rắn chuẩn<br />
được pha ở 3 nồng độ 15 ng/ml; 45 ng/ml và<br />
75 ng/ml (trong dung dịch FBS).<br />
Với tỷ lệ phục hồi 98,22% và hệ số biến<br />
thiên trung bình trong cùng lần thực hiện<br />
phản ứng là 1,92% cho thấy phương pháp<br />
<br />
42<br />
<br />
Đã phát triển được bộ kít ELISA định<br />
lượng nọc rắn Hổ mang miền Bắc Naja atra<br />
sử dụng hai nguồn kháng thể đặc hiệu nọc<br />
rắn Hổ mang Naja atra từ thỏ và ngựa. Bộ<br />
kít đạt được các chỉ tiêu về độ nhạy, độ ổn<br />
định và độ đúng.<br />
<br />
98,22<br />
<br />
Tỷ lệ phục hồi là đại lượng đánh giá độ<br />
<br />
đạt độ đúng và độ ổn định cao.<br />
<br />
KẾT LUẬN<br />
<br />
1. Lê Văn Đông và CS. Nghiên cứu chế tạo<br />
bộ xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán rắn độc cắn<br />
ở Việt Nam. Báo cáo kết quả đề tài. Học viện<br />
Quân y, Bộ Quốc phòng. 2010.<br />
2. Nguyễn Văn Cường và CS. Phát triển<br />
phương pháp xác định tồn dư 2,4-D trong hoa<br />
quả bằng kỹ thuật ELISA. Nông nghiệp-Nông<br />
thôn-Môi trường. 2005, số 1, tr.69-71.<br />
3. Christiane K. Fæste, Christin Plassen.<br />
Quantitative<br />
sandwich<br />
ELISA<br />
for<br />
the<br />
determination of fish in foods. Journal of<br />
Immunological Methods. 2008, (329), pp.45-55.<br />
4. Jeffre C. Johnson, Jeanette M. Van Emon,<br />
Ann N. Clarke, Brad N. Wamsley. Quantitative<br />
ELISA of polychlorinated biphenyls in an oily soil<br />
matrix using supercritical fluid extraction.<br />
Analytica Chimica Acta. 2001, 428, pp.191-199.<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
