intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Nghiên cứu phương pháp PCR-RFLP gen 16S rRNA để đánh giá đa dạng vi khuẩn trong phân trẻ tiêu chảy không rõ nguyên nhân

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST
Báo xấu
12
lượt xem 5
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Nghiên cứu phương pháp PCR-RFLP gen 16S rRNA để đánh giá đa dạng vi khuẩn trong phân trẻ tiêu chảy không rõ nguyên nhân trình bày việc thiết lập phương pháp PCR-RFLP để đánh giá đa dạng phổ vi khuẩn trong mẫu phân trẻ bị tiêu chảy chưa rõ nguyên nhân và mẫu chứng từ trẻ khỏe mạnh để tiến tới định hướng hỗ trợ tìm kiếm các tác nhân vi khuẩn gây bệnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu phương pháp PCR-RFLP gen 16S rRNA để đánh giá đa dạng vi khuẩn trong phân trẻ tiêu chảy không rõ nguyên nhân

  1. HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XXV – CHÀO MỪNG 60 NĂM THÀNH LẬP HỘI HÓA SINH Y HỌC VIỆT NAM NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP GEN 16S rRNA ĐỂ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG VI KHUẨN TRONG PHÂN TRẺ TIÊU CHẢY KHÔNG RÕ NGUYÊN NHÂN Nguyễn Hồng Dương1, Nguyễn Thị Quý1, Ngọc Thu Thảo2, Nghiêm Đỗ Như Thảo3, Phùng Thị Bích Thủy4, Đỗ Thị Huyền1,5 TÓM TẮT 27 chương trình PCR thông thường và chương trình Tiêu chảy là bệnh phổ biến dẫn đến tình tough-down, do đó đã tạo nguồn gen tốt nhất cho trạng mất nước, suy dinh dưỡng ở trẻ em, nặng phân tích RFLP. Qua quan sát điện di đồ PCR- nhất có thể gây tử vong. Bên cạnh các trường RFLP, một số băng DNA khác biệt có nguồn gốc hợp tiêu chảy xác định được nguyên nhân, một tỷ từ phân trẻ bị bệnh có kích thước tương ứng tại lệ đáng kể các trường hợp tiêu chảy không rõ vị trí các băng chỉ thị của E. coli hoặc nguyên nhân. Trong nghiên cứu này, phương Salmonella. Các đoạn DNA này cần được giải pháp PCR-RFLP gen 16S rRNA được thiết lập trình tự để khẳng định sự có mặt của vi khuẩn để đánh giá tính đa dạng của vi khuẩn trong phân này trong mẫu bệnh phẩm. của trẻ tiêu chảy không rõ nguyên nhân và hỗ trợ thêm cho việc xác định nguyên nhân. Đầu tiên, SUMMARY trong số bảy enzyme giới hạn được nghiên cứu, ESTABLISHMENT OF PCR-RFLP OF MboI đã cắt metagene 16S của chín chủng chỉ thị 16S rRNA GENE FOR ANALYSIS OF và vi khuẩn từ phân tạo ra đa hình chiều dài đoạn BACTERIAL DIVERSITY IN STOOLS giới hạn đa dạng nhất. Các đoạn DNA được tạo OF CHILDREN SUFFER FROM ra từ sự phân cắt bằng RsaI có giá trị bổ sung DIARRHEA WITH UNKNOWN CAUSE thông tin cho một số đoạn DNA nhất định. Diarrhea is common disease leading to Chương trình tough-up PCR đã khuếch đại dehydration and malnutrition in children and in metagene 16S rRNA đa dạng nhất so với các the most severity can cause mortality. Besides the identified-cause diarrhea, significant percent cases are unknown reason. In this study, a 1 Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa method PCR-RFLP of the 16S rRNA gene was học và Công nghệ Việt Nam established for assessment of bacterial diversity 2 Đại học Y Hà Nội in stools of children suffer from unknown-cause 3 diarrhea and further assists for identification of University of Nebraska-Lincoln 4 Bệnh viện Nhi Trung Ương reason. Firstly, of the seven investigated 5 Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm restriction enzyme, MboI digested 16S metagene Khoa học và Công nghệ Việt Nam of nine indicator strains and bacteria from stools Chịu trách nhiệm chính: Đỗ Thị Huyền to generate the most diversity of restriction fragment length polymorphism. The DNA SĐT: 0967060875 fragments created from RsaI cleavage also Email: dohuyen@ibt.ac.vn contributed additional information for certain Ngày nhận bài: 7.7.2023 DNA fragments. The tough-up PCR program Người phản biện khoa học: PGS.Nguyễn Nghiêm Luật amplified the most diverse 16S rRNA metagene Ngày duyệt bài: 8.7.2023 182
  2. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 529 - THÁNG 8 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2023 than normal and tough-down PCR programs thus công trình nghiên cứu này, chúng tôi trình contributed the best materials for RFLP analysis. bày việc thiết lập phương pháp PCR-RFLP Some discriminated DNA bands originated from để đánh giá đa dạng phổ vi khuẩn trong mẫu disease stool were observed at the position of E. phân trẻ bị tiêu chảy chưa rõ nguyên nhân và coli or Salmonella indicator bands, that should be mẫu chứng từ trẻ khỏe mạnh để tiến tới định confirmed bysequencing. hướng hỗ trợ tìm kiếm các tác nhân vi khuẩn gây bệnh. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ở Việt Nam, tiêu chảy là một trong 10 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU bệnh phổ biến ở trẻ và đứng thứ 4 về tỷ lệ tử 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên liệu vong. Tại bệnh viện, để xác định tác nhân nghiên cứu gây bệnh, phương pháp phổ biến nhất được Các vi khuẩn có khả năng gây bệnh gồm áp dụng là soi tươi, cấy phân và PCR để chẩn E. coli HM 3175, E. coli ATCC27117, B. đoán các tác nhân thông thường. Tuy nhiên, aureus, B. subtilis 168, Staphylococcus trên thế giới, con số trẻ tiêu chảy không tìm aureus, Salmonella typhymurium, S. được ra nguyên nhân chiếm khoảng 30-65%. enteritidis ATCC 13076, Listeria fermentum, Ở Việt Nam, nghiên cứu năm 2016 trên 122 Enterococcus faecium có trong bộ sưu tập trẻ tiêu chảy kéo dài cho thấy có tới 47,38% chủng của phòng Kỹ thuật di truyền, Viện trẻ có dấu hiệu nhiễm trùng nhưng không xác Công nghệ sinh học được sử dụng làm chủng định được căn nguyên [1]. Trong những năm chỉ thị để khuếch đại gen 16S rRNA, đánh gần đây, nhiều phương pháp sinh học phân tử giá các enzyme giới hạn phù hợp cắt sản được áp dụng để phân tích đa dạng hệ vi phẩm PCR của 9 loại vi khuẩn này thành các khuẩn trong phân của nhiều loại mẫu bệnh đoạn có độ đa hình cao. DNA đa hệ gen vi phẩm trong đó có tiêu chảy và đã phát hiện khuẩn từ mẫu phân của trẻ khỏe mạnh và trẻ ra nhiều nguyên nhân từ mất cân bằng vi sinh tiêu chảy (mẫu đã được kiểm tra âm tính với đường ruột dẫn tới bệnh tật, điển hình như các tác nhân tiêu chảy bằng QIAstat-Dx® béo phì, tự kỷ, tiểu đường, tim mạch, ung thư Gastrointestinal Panel25 tác nhân) được tách đại tràng, ... Những phát hiện mới này đã chiết từ công trình nghiên cứu trước [5]. thúc đẩy phát triển nhiều con đường tiếp cận DNA đa hệ gen được sử dụng trong nghiên khác nhau cho chẩn đoán và điều trị bệnh. cứu này là được bằng phương pháp của Các phương pháp điển hình gồm giải trình tự Sambrook (ký hiệu là S) và GenJET (ký hiệu đa hệ gen bằng công nghệ giải trình tự thế hệ là G). DNA đa hệ gen tách từ mẫu trẻ tiêu mới, phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn chảy (ký hiệu là D) và mẫu từ trẻ khỏe mạnh (SSCP), phân tích đa hình giới hạn DNA (ký hiệu là H) được tách lặp lại hai lần gồm ribosome khuếch đại (ARDRA), phân tích đa DS1, DS2, DG1, DG2, HS1, HS2, HG1, hình đoạn giới hạn (RFLP), phân tích đa hình HG2. Các mẫu được dùng để đánh giá: (1) chiều dài đoạn giới hạn (T- RFLP), điện di chương trình PCR làm tăng độ đa dạng gen trên gel gradient biến tính (Denaturing 16S của mẫu; (2) phương pháp tách chiết Gradient Gel Electrophoresis-DGGE), ... Các DNA đa hệ gen làm tăng độ đa dạng gen 16S phương pháp này đều có khả năng đánh giá của mẫu. đa dạng vi khuẩn và đồng thời tìm kiếm các 2.2. Phương pháp nghiên cứu gen khác biệt trùng với gen chỉ thị gây bệnh 2.2.1 PCR khuếch đại gen 16S rRNA hoặc khác biệt so với đối chứng để tiến hành DNA hệ gen của chủng vi khuẩn chỉ thị giải trình tự, xác định căn nguyên [4]. Trong được tách chiết dựa theo phương pháp của 183
  3. HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XXV – CHÀO MỪNG 60 NĂM THÀNH LẬP HỘI HÓA SINH Y HỌC VIỆT NAM Sambrook và cộng sự [7]. Gen 16S rRNA cắt hỗn hợp sản phẩm PCR gen 16S từ 9 được khuếch đại bằng cặp mồi 27F (5′- chủng chỉ thị để tìm ra các enzyme giới hạn GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) và cho phổ băng DNA sau khi cắt đa dạng nhất, 1527R (5′-AGAAAGG có khả năng phân biệt cao giữa 9 chủng. AGGTGATCCAGCC-3′). PCR được tiến Tổng thể tích phản ứng cắt là 15 µl gồm 1,5 hành với tổng thể tích 100 μl gồm 10 μl đệm µl đệm CutSmart 10x, 900 ng metagen 16S Pfu 10x, 8 μl dNTP 2 mM, 4 μl mồi (2 μM) (trộn từ 100 ng DNA hệ gen của mỗi chủng), mỗi loại, 10 ng DNA hệ gen hoặc 50 ng 10 U enzyme hạn chế và nước deion vô DNA đa hệ gen, 1 μl Pfu DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific, 2,5 U/μl) và nước trùng. Phản ứng cắt diễn ra ở 37oC trong 3 deion vô trùng. Gen 16S của các chủng vi giờ sau đó sản phẩm sau khi cắt được điện di khuẩn chỉ thị được khuếch đại bằng chương kiểm tra trên gel agarose 2%. Enzyme cắt tạo trình chuẩn (Ký hiệu là N: normal) với chu đoạn giới hạn tốt được dùng để cắt gene 16S trình gồm: (1) biến tính sợi khuôn ở 94oC, 4'; của mỗi chủng giúp định vị đoạn chỉ thị đa (2) khuếch đại gen với 35 chu kỳ (94oC, 30''; hình. Tổng thể tích phản ứng cắt là 15 µl 55oC, 30'', 72oC, 1'); (3) hoàn thiện ở 72oC, gồm 1,5 µl đệm CutSmart 10x, 100 ng DNA 4'; giữ sản phẩm PCR ở 4oC. Gen 16S rRNA sản phẩm PCR gen 16S của mỗi chủng, 2 U của các vi khuẩn trong mẫu DNA đa hệ gen enzyme hạn chế (DS1, DS2, DG1, DG2, HS1, HS2, HG1, và nước deion vô trùng và được ủ ở 37oC HG2) được khuếch đại bằng chương trình trong 3 giờ. chuẩn và chương trình tough-up (ký hiệu là 2.2.3. Nghiên cứu khảo sát chương U có nhiệt độ gắn mồi thay đổi tăng dần sau trình PCR thích hợp thuận lợi cho đánh giá mỗi 5 chu kỳ từ 50oC đến 52oC, 55oC, và đa hệ gen vi khuẩn trong mẫu phân cuối cùng là 20 chu kỳ có nhiệt độ gắn mồi 58oC) và chương trình tough-down (ký hiệu Việc khảo sát để tìm ra chương trình là D, có nhiệt độ gắn mồi giảm dần sau mỗi 5 PCR thích hợp giúp đánh giá tốt đa dạng vi chu kỳ từ 58 xuống 52oC như phương pháp khuẩn trong mẫu phân, chúng tôi sử dụng tough-up, 20 chu kỳ có nhiệt độ gắn mồi ở phương pháp PCR-RFLP với sự hỗ trợ phân 50oC). Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại tích bằng sơ đồ heatmap. Đầu tiên, sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose PCR gen 16S được khuếch đại bằng 3 0,8%, được tủa lại bằng 2 lần thể tích ethanol chương trình PCR từ DNA đa hệ gen vi 98o (Sigma) qua đêm ở -20oC, rửa bằng khuẩn trong mẫu phân của bệnh nhi tiêu chảy ethanol 70%, làm khô và hòa lại bằng 50 l và trẻ khỏe mạnh và được cắt bằng enzyme nước vô trùng. Hàm lượng DNA được đo MboI, RsaI. Ảnh điện di sản phẩm cắt được bằng máy Nanodrop 2000 (Implen). chuyển vào phần mềm ImageLab để phần 2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn enzyme hạn mềm quét và đưa ra chỉ số cường độ đậm chế thích hợp để cắt sản phẩm PCR gen nhạt của các băng ở mỗi vị trí tương ứng với 16S rRNA của các vi khuẩn khác nhau tạo hàm lượng DNA của các băng ở mỗi vị trí. các đoạn giới hạn đa dạng Dựa vào chỉ số cường độ băng, đồ thị Đầu tiên, các enzyme giới hạn nhận biết Heatmap sẽ được xây dựng dựa trên ngôn bộ 4 nucletide bao gồm AluI (10 U/l), DpnI ngữ R [3] để đánh giá mức độ phân biệt phổ (20 U/l), HaeIII (10 U/l), MboI (5 U/l), băng DNA sau cắt bằng các enzyme khác MspI (20 U/l), RsaI (10 U/l), Sau3AI (4 nhau. U/l) (New England Biolab) được khảo sát 184
  4. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 529 - THÁNG 8 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2023 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN enzyme hạn chế này. Sau khi cắt kiểm tra lại, 3.1. Nghiên cứu khảo sát enzyme giới hai enzyme MboI, RsaI cắt hỗn hợp thành hạn tạo đa hình đoạn gen 16S rRNA cao nhiều đoạn có độ đa dạng chiều dài cao nhất. Để khảo sát được enzyme hạn chế thích Để tạo marker phân tử có thể nhận biết hợp cho cắt gen 16S rRNA của vi khuẩn tạo đoạn gen của vi khuẩn gây bệnh có trong đoạn đa hình cao, đầu tiên, gen 16S từ 9 mẫu phân, sản phẩm PCR gen 16S của từng chủng chỉ thị đã được khuếch đại đặc hiệu, chủng chỉ thị đã được cắt lại bằng MboI, hàm lượng lớn với kích thước khoảng 1,5 kb RsaI. Kết quả (Hình 1C, D) cho thấy MboI như tính toán lý thuyết (Hình 1A). Sau khi cắt gen của 9 chủng chỉ thị thành các đa hình trộn chung sản phẩm PCR và cắt bằng các đoạn giới hạn có độ đa dạng cao, có khả enzyme hạn chế, hầu như gen của 9 chủng năng phân biệt lớn hơn RsaI. Tuy nhiên, việc không bị cắt bởi AluI, một phần nhỏ bị cắt cắt bằng RsaI cũng cho kết quả bổ sung cho bởi DpnI nhưng tạo các đoạn không rõ ràng. việc cắt bằng MboI tốt. Do vậy, chúng tôi Các enzyme HaeIII, MboI, MspI, RsaI và chọn hai enzyme hạn chế này để thiết lập Sau3AI đều cắt hỗn hợp gen thành các đoạn phương pháp PCR-RFLP cho đánh giá đa khác nhau. Enzyme EcoRI và HindIII cũng dạng vi khuẩn trong mẫu phân và hỗ trợ giúp được thử nghiệm, tuy nhiên hầu như gen 16S tìm nhanh vi khuẩn gây bệnh có thể có trong từ các chủng vi khuẩn không bị cắt bởi hai mẫu. bp M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M2 M3 (-) 10000 − 1500 − Listeria/Enterococcus 6000 − E. coli/Bacillus/Staphylococcus 4000 − 1000 − E. coli/Bacillus/Salmonella 3000 − E. coli/Bacillus 600 − E. coli/Salmonella 2000 − 400 − E. coli/Salmonella E. coli/Bacillus E. coli/Salmonella 1000 − 200 − 100 − E. coli/Bacillus 500 − 250 − A C Sau3AI HaeIII MboI MspI DpnI RsaI AluI (-) M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 2 M3 (-) bp Bacillus/Listeria/Enterococcus 2000 − 1500 − E. coli/Bacillus/Staphylococcus Salmonella 500 − Listeria/Enterococcus 250 − Bacillus B D Hình 1. Điện di đồ phân tích sản phẩm PCR và sản phẩm cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme khác nhau 185
  5. HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XXV – CHÀO MỪNG 60 NĂM THÀNH LẬP HỘI HÓA SINH Y HỌC VIỆT NAM A. Sản phẩm PCR gen 16S rRNA; B: nhau. Sau khi tủa cồn và loại bỏ muối, DNA Sản phẩm cắt hỗn hợp gen 16S rRNA của 9 có chất lượng tốt với A260/280 đạt từ 1,96 chủng chỉ thị; C, D: Tương ứng là sản phẩm đến 2,07; A260/230 đạt trên 2,2. MboI cắt cắt gen 16S rRNA của từng chủng và hỗn metagene 16S thành 14 đoạn đa hình, RsaI hợp 9 chủng chỉ thị bằng enzyme MboI, cắt metagen 16S thành 13 đoạn đa hình. Nhìn RsaI. 1: E. coli HM 3175; 2: E. coli ATCC tổng quát trong cả 6 ảnh phân tích (Hình 2), 27117; 3: B. aureus; 4: B. subtilis 168; 5: metagen 16S khuếch đại từ DNA đa hệ gen Staphylococcus aureus; 6: Salmonella vi khuẩn mẫu phân được tách chiết bằng kit typhymurium; 7: S. enteritidis ATCC 13076; GenJET có độ đa dạng cao hơn, được thể 8: Listeria fermentum; 9: Enterococcus hiện ở cả mẫu bệnh và mẫu chứng (Hình 2A, faecium; M1: DNA chuẩn 1 kb (Fermentas); B, C). Trong khi đó, gen khuếch đại từ đa hệ M2: DNA chuẩn 100 bp (Fermentas); M3: gen vi khuẩn tách bằng Sambrook cũng thể Hỗn hợp của 9 chủng chỉ thị. hiện một số băng khác biệt so với kit GeJET. 3.2. Nghiên cứu thiết lập phương pháp Nguyên nhân có thể có là do bản chất các PCR-RFLP cho đánh giá đa dạng vi hóa chất được sử dụng trong ly trích thu hồi khuẩn và hỗ trợ phát hiện tác nhân vi DNA đa hệ gen ở hai phương pháp tách chiết khuẩn gây bệnh là khác nhau nên hiệu quả thu hồi DNA từ vi Trước hết, gen 16S rRNA được khuếch khuẩn thuộc các chi, ngành khác nhau có sự đại từ khuôn DNA đa hệ gen DS1, DS2, khác nhau. Các mẫu được tách lặp lại hai lần DG1, DG2, HS1, HS2, HG1, HG2 bằng cho các kết quả tương tự nhau. Như vậy có chương trình chuẩn, tough-up và tough- thể nói để có thể thu được đa hệ gen vi khuẩn down. Kết quả, gen 16S được khuếch đại là phong phú nhất cho đánh giá đa dạng, việc đặc hiệu, có kích thước 1,5 kb như tính toán tách chiết DNA đa hệ gen từ mẫu phân bằng lý thuyết (Kết quả không được trình bày cả hai phương pháp là cần thiết. trong bài) với hàm lượng gần tương đương 186
  6. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 529 - THÁNG 8 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2023 Hình 2. Điện di đồ sản phẩm cắt metagen 16S rRNA được khuếch đại bằng các chương trình PCR từ khuôn DNA đa hệ gen vi khuẩn từ phân trẻ bị tiêu chảy (DS1, DS2, DG1, DG2) và trẻ khỏe mạnh HS1, HS2, HG1, HG2) trên gel agarose (-): Sản phẩm PCR gen 16S không cắt; chương trình tough-up. Độ đa đa hình các M2: DNA chuẩn 100 bp (Fermentas); M3: đoạn giới hạn thấp nhất khi gen 16S được Sản phẩm cắt gen 16S rRNA của 9 chủng chỉ khuếch đại bằng chương trình tough-down. thị. Mũi tên chỉ các băng DNA khác biệt điển Tương tự như vậy, đối với các mẫu hình giữa mẫu bệnh so với mẫu khỏe. cắt bằng RsaI băng DNA ở vị trí khoảng 450 Như được quan sát thấy trong mẫu chủng bp có kích thước tương ứng với đoạn chỉ thị chỉ thị, gen 16S khuếch đại từ đa hệ gen của Salmonella (Hình 2E, F). Ngoài ra, đoạn được cắt bằng MboI cho phổ băng rõ ràng, gen ở vị trí 300 bp tương ứng với chỉ thị tách biệt hơn và có sự phân biệt giữa mẫu Listeria/ Enterococcus cũng được quan sát bệnh và mẫu chứng khá rõ. Đối với mẫu cắt thấy trong mẫu bệnh phẩm trong đó không bằng MboI, đoạn DNA kích thước khoảng 1 quan sát thấy ở mẫu chứng và được quan sát kb chỉ thấy xuất hiện ở mẫu bệnh với hàm rõ ở mẫu được PCR bằng chương trình lượng khá lớn và không trùng với đoạn đa tough-up. Ở mẫu đối chứng, một số đoạn hình của chủng chỉ thị. Đây là đoạn đáng DNA khác biệt so với mẫu bệnh và với gen quan tâm nên được giải trình tự để dự đoán từ chủng chỉ thị cũng được quan sát thấy và vi khuẩn có mặt. Đoạn gen ở vị trí 700 bp, có hàm lượng lớn. Như vậy có thể thấy đối 200 bp không thấy có ở mẫu trẻ khỏe nhưng với trẻ bị tiêu chảy, cấu trúc vi khuẩn trong thấy rất rõ với hàm lượng khá lớn ở mẫu trẻ phân đã có sự thay đổi khi quan sát bằng bị tiêu chảy đều tương ứng với đoạn chỉ thị PCR-RFLP. của E. coli và Salmonella. Do vậy, rất có thể PCR-RFLP đã được ứng dụng trong việc trẻ tiêu chảy chưa rõ nguyên nhân là do mắc xác định tác nhân gây bệnh ở bệnh nhân các loại vi khuẩn này. Tuy nhiên, để khẳng viêm mủ nội nhãn [6], chứng giảm bạch cầu định chắc chắn, các đoạn gen này cần được kèm theo sốt và tiêu chảy do ký sinh trùng giải trình tự và so sánh với gen tương ứng trên một số chủng đặc trưng phân lập hoặc của E. coli và Salmonella. Quan sát điện di nguồn gen đích có sẵn. Hiện nay chưa có đồ phân tích đa hình đoạn giới hạn chúng tôi nghiên cứu nào ứng dụng PCR-RFLP để xác cũng nhận thấy, các đoạn đa hình khác biệt định vi khuẩn gây bệnh trong mẫu phân. Về giữa mẫu bệnh này được thể hiện rõ hơn, nét cơ bản, phương pháp này có các ứng dụng hơn khi gen 16S được khuếch đại bằng tương tự như DGGE chỉ khác DGGE phân 187
  7. HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC LẦN THỨ XXV – CHÀO MỪNG 60 NĂM THÀNH LẬP HỘI HÓA SINH Y HỌC VIỆT NAM tách vùng gen 16S dựa trên điểm nóng chảy sardiniense, và Peptostreptococcus của vùng gen của các chủng vi khuẩn khác anaerobius là các vi khuẩn trội trong mẫu nhau. Phương pháp DGGE đã được áp dụng phân bệnh nhi bị tiêu chảy do thành công trong việc xác định tác nhân gây Rotavirus.Bacteroides, Bifidobacterium, tiêu chảy ở 15 trẻ tiêu chảy do Rotavirus. Lactobacillus, Proteobacteria Dựa trên các băng khác biệt của cụm mẫu bacterium, Clostridium, và vi khuẩn không bệnh phẩm và mẫu trẻ khỏe, tác giả đã phát nuôi cấy được là trội ở mẫu phân trẻ khỏe hiện được E. coli, Bacteroides mạnh [2]. vulgatus, Enterococcus 3.3. Nghiên cứu đánh giá độ đa dạng faecium, Clostridium, E. fergusonii, C. của PCR-RFLP gen 16S Đa gen 16S rRNA được cắt bằng MboI Mẫu bệnh Mẫu chứng 1 2 3 Cường Thứ tự đa hình 4 độ đậm 5 6 của băng 7 DNA 8 9 10 11 12 13 14 Hình 3. Hình ảnh so sánh tương quan của 24 mẫu điện di phân tích đa hình gen 16S của vi khuẩn từ mẫu phân trẻ khỏe mạnh và trẻ tiêu chảy được cắt bằng MboI, sử dụng thuật toán Spearman và mô hình hóa trên sơ đồ heatmap. Để phân tích đánh giá đa dạng một cách bệnh được tách bằng kit GenJET khác biệt so khách quan nhất dựa trên các phần mềm tin với mẫu tách bằng phương pháp Sambrook. sinh học, hình ảnh điện di đồ phân tích đa Phổ gen 16S khuếch đại bằng chương trình hình trên gel agarose đã được đưa vào phần tough-up và tough-down khác biệt với mềm quét ảnh để đánh giá cường độ, số chương trình chuẩn. Kết quả này cũng tương lượng các đa hình. Dựa trên thuật toán tự như phân tích với gen được cắt bằng RsaI Spearman, sơ đồ heatmap đánh giá mối (Kết quả không được trình bày). tương quan phổ đa hình và hàm lượng DNA giữa các đa hình đã được xây dựng (Hình 3). IV. KẾT LUẬN Kết quả cho thấy, đa hình trong mẫu bệnh và Phương pháp PCR-RFLP đã được thiết mẫu chứng hoàn toàn khác biệt nhau. Mẫu lập thành công để đánh giá đa dạng vi khuẩn 188
  8. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 529 - THÁNG 8 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2023 và hỗ trợ tìm tác nhân vi khuẩn gây bệnh tiêu 3. Gu Z, Eils R, Schlesner M. Complex chảy dựa trên việc khuếch đại toàn bộ heatmaps reveal patterns and correlations in metagene 16S của hệ vi khuẩn trong phân multidimensional genomic data. bằng chương trình tough-up và cắt bằng Bioinformatics 2016; 32(18): 2847-2849 MboI. Phổ đa hình đoạn giới hạn được tách 4. Mai V, Braden CR, Heckendorf J, Pironis B, Hirshon JM. Monitoring of stool biệt tốt. Một số đoạn đa hình trong mẫu bệnh microbiota in subjects with diarrhea indicates phẩm đã được phát hiện tương ứng với đoạn distortions in composition. J Clin Microbiol gen chỉ thị của E. coli và Salmonella. Các 2006; 44(12): 4550-4552 đoạn gen này cần được giải trình tự để xác 5. Nguyen TQ, Ngoc TT, Do TH. A định chính xác tác nhân gây bệnh. comparison of five methods for effective extraction of bacterial metagenomic DNA TÀI LIỆU THAM KHẢO from stools of children suffer from diarrhea 1. Vũ Thị Thu Hà, Nguyễn Tuấn Khiêm, with unknown cause. Acad J Biol 2023; Tăng Chí Thượng, Trần Thị Mộng Điệp Under review (2016) Khảo sát đặc điểm bệnh tiêu chảy kéo 6. Okhravi N, Adamson P, Matheson MM, dài ở trẻ em tại bệnh viện nhi đồng 2. Tạp Towler HMA, Lightman S. PCR-RFLP– Chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh 20(2): Mediated detection and speciation of 96–102 bacterial species causing endophthalmitis. 2. Fei P, Li L, Cai X, Zhang X, Bai HJ, Jiang Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41(6): YJ, Feng Z, Guo L. Differences in the 1438-1447 biodiversity of the fecal microbiota of infants 7. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T with Rotaviral diarrhea and healthy infants. (2001). Molecular cloning: a laboratory Jundishapur J Microbiol 2016; 9(4): e32356 manual. 11. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 189
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
5=>2