Nghiên cứu quá trình tái sinh chồi của hương nhu tía (Ocimum tenuiflorum) trong nuôi cấy in vitro

Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(87)/2018<br /> <br /> Khurnpoon, L., Siriphanich, J. and Labavitch, J. M., Ofelia, K.B and Elda B.E., 1990. Postharvest Technology<br /> 2008. Cell wall metabolism during durian fruit for Southeast Asian Perishable Crops. (Ed). Chapter<br /> dehiscence. Postharvest Biology and Technology 12: Ripening, degreening and color adding, 171:190.<br /> 48:391-401. Knee, M. 1987. Development of Siriphanich, J. and Jarimopas, B., 1993. Postharvest<br /> ethylene biosynthesis in pear fruits at -1 ºC. Journal loss of durian. National Agricultural Machinery<br /> of Experimental Botany 38:1724-1733. Center Newsletter, 6(4):1-3.<br /> Miguela, S., Demetrio, V., Elda., B. and Merly, A., Sutthaphan, S., 1993. Postharvest change in chemical<br /> 2006. Postharvest behavior and storage life of 3 composition of Chanee and Monthong durian pulp.<br /> durian cultivars with varying maturity, waxing and MS Thesis, Kasetart University, Bangkok.<br /> temperature. Philippine Journal of Crop Science, Tira-daengkanit., 1995. Relationships between activities<br /> 31(1): 29-46. of polygalacturonase, pectin methylesterase, cellulase<br /> and beta-galactosidase and pulp softening of ripe<br /> Nafsi N., 2007. Diversity analysis of durian (Durio durians, Bangkok (Thailand), 64p.<br /> zibethinus Murr.) varieties using microsatellite<br /> Tongdee, S.C., Chayasombat, A and Neamprem, S.,<br /> markers. Thesis School of Bioscience and<br /> 1988. Respiration, ethylene production and changes<br /> Biotechnology, Bandung Institute of Technology. in interal atmospheres of durian (Durio zibethinus<br /> Bandung. Indonesia. Murr.) In: Proceedings of the seminar on durian.<br /> Oeticker, J.H and Yang S.F., 1995. The role of ethylene Thailand Institute of Scientific and Technological<br /> in fruit ripening. Acta Hort. 398: 167-178. Research, Bangkok, 31-36.<br /> <br /> Study on ripening process of Ri 6 durian fruit by exogenous ethylene gas<br /> Duong Thi Cam Nhung and Nguyen Van Phong<br /> Abstract<br /> Study on the effect of exogenous ethylene fumigation approaches on the ripening process of “Ri 6” durian fruit was<br /> conducted to find out ripening effective method. The experiment was arranged in completely randomized design<br /> with different treatments (ethephone dip 500 ppm, ethylene from ethephone in NaOH, ethylene generator with conc.<br /> 200 ppm - 24 hrs and control) and five replications; each replication was one fruit. Durian fruits with 90% of mature<br /> and uniform size were harvested from durian orchard belonging to Thanh Binh commune, Vinh Long province. After<br /> harvesting, fruits were carefully transported to the postharvest laboratory and treated with ethylene as described<br /> above. After treatment, the samples were kept in ambient (27 - 29oC) and recorded the number of days to ripening<br /> edibility. Among three ripening approaches, fumigations with ethylene gas obtained from ethylene generator and<br /> ethephone reacted with NaOH could be considered as the most suitable for ripening Ri-6 durian fruits. The ripening<br /> time of Ri-6 durian fruits using the fumigation was shortened down 2 days and fruit gave optimum eating quality.<br /> Keywords: Ethephon, ethylene, respiration, Ri 6 durian, ripening<br /> Ngày nhận bài: 15/1/2018 Người phản biện: PGS.TS. Lê Nguyễn Đoan Duy<br /> Ngày phản biện: 30/1/2018 Ngày duyệt đăng: 12/2/2018<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁI SINH CHỒI CỦA HƯƠNG NHU TÍA<br /> (Ocimum tenuiflorum) TRONG NUÔI CẤY IN VITRO<br /> Lương Thị Hoan1, Hoàng Thị Như Nụ1, Nguyễn Đăng Minh Chánh2<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Hương nhu tía (Ocimum tenuiflorum) là một trong các loài dược liệu có giá trị trong điều trị đường hô hấp, tiêu<br /> chảy, nhức đầu… và làm mỹ phẩm. Tuy nhiên, nhân giống bằng con đường hữu tính đã giảm do tỷ lệ nảy mầm hạt<br /> giống thấp. Mục tiêu của nghiên cứu này xác định quá trình tái sinh chồi của Hương nhu tía trong nuôi cấy in vitro.<br /> Chồi của hương nhu tía lấy từ vườn cây thuốc tại Hà Nội, được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong các thời gian<br /> khác nhau (2, 4, 6, và 8 phút) và được đưa vào môi trường MS; môi trường tái sinh chồi gồm MS + 0,5 mg/l BA,<br /> MS + 0,25 mg/l BA và môi trường ½ MS + 0,5 mg/l BA, ½ MS + 0,25 mg/l BA. Kết quả cho thấy mẫu chồi khử trùng<br /> tối ưu nhất khi dùng HgCl2 0,1% trong 4 phút, đạt tỷ lệ bật chồi cao nhất (32%); môi trường tái sinh chồi ½ MS bổ<br /> <br /> 1<br /> Viện Dược liệu; 2 Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm<br /> <br /> 22<br />  Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(87)/2018<br /> <br /> sung 0,25 mg/l BA cho hệ số nhân chồi trung bình 4,5 chồi/mẫu và chiều cao trung bình 1,5 cm/chồi. Kết quả nghiên<br /> cứu này là cơ sở tìm ra môi trường nhân nhanh chồi, tái sinh hữu hiệu và tạo cây con hoàn chỉnh ngoài vườn ươm<br /> làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo.<br /> Từ khóa: Hương nhu tía, tái sinh chồi, nuôi cấy mô, nhân giống<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ bách. Trong đó, Hương nhu tía là một trong các loài<br /> Hương nhu tía (Ocimum tenuiflorum) là một loại cây nằm trong định hướng phát triển nguồn dược<br /> cây thân thảo, thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae), có liệu quốc gia, nhưng hiện nay trồng Hương nhu tía<br /> nguồn gốc dân gian từ Ấn độ, được trồng rộng rãi ở còn tản mạn, phân tán rải rác nên chưa được quan<br /> nước Đông Nam Á. Ở Việt Nam, trước đây cây chủ tâm. Để đáp ứng như cầu của người dân vùng trồng<br /> yếu mọc hoang dại ở một số địa phương như Quảng dược liệu nói riêng và cả nước nói chung, mục tiêu<br /> Ninh, Hà Giang, Phú Thọ, Yên Bái và Cửu Long... của nghiên cứu này xác định quá trình tái sinh chồi<br /> Đến nay, cây đã được trồng ở một số tỉnh Nam Hà, của Hương nhu tía (Ocimum tenuiflorum) trong<br /> Lạng Sơn, Sơn La, Lai Châu, Đắc Lắc, Vĩnh Phúc và nuôi cấy in vitro nhằm tạo nguồn cây giống có giá<br /> một số tỉnh Đông Nam bộ... Theo y học cổ truyền, trị đáp ứng nhu cầu sản xuất cây trồng trên quy mô<br /> Hương nhu tía có tinh dầu với tỷ lệ 0,2 - 0,3% ở thương mại.<br /> cây tươi và 0,5% ở cây khô; thành phần chính của<br /> tinh dầu là eugenol (trên 70%), methyleugenol (trên II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 12%) và β- caryophyllen. Sử dụng chữa trị nhiều căn 2.1. Vật liệu nghiên cứu<br /> bệnh về đường hô hấp, tiêu chảy, nhức đầu, sốt, bệnh Đoạn chồi của Hương nhu tía được lấy từ cây<br /> về da và viêm phổi. Chiết xuất từ cây này chứa các giâm hom 6 tháng tuổi ở vườn cây thuốc, Trung tâm<br /> chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và hoạt Nghiên cứu Trồng và Chế biến cây thuốc Hà Nội,<br /> tính chống sốt rét, chảy máu cam…và dùng làm mỹ Viện Dược liệu.<br /> phẩm (Đỗ Tất Lợi, 2004; Jurges et al., 2009; Adebolu<br /> et al., 2005; Gopi et al., 2006). 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> Ở một số nước, Hương nhu tía đã được trồng và - Phương pháp khử trùng và chuẩn bị mẫu: Đoạn<br /> phát triển với quy mô thương mại phục vụ cho sản chồi được cắt dài 6 - 8 cm xử lý sạch trên bề mặt<br /> xuất đám ứng yêu cầu về dược liệu và mỹ phẩm cho trước, sau đó dùng HgCl2 0,1% khử trùng trong thời<br /> loài cây này. Ở Ấn Độ, hương nhu là loài quan trọng gian 2, 4, 6 và 8 phút, được rửa sạch bằng nước cất<br /> và nằm trong số 178 loài cây cao cấp và là một trong vô trùng, khi đưa vào bình cấy mẫu được cắt thành<br /> số 36 loài cây ổn định hệ thống nông nghiệp ở địa từng đoạn 2 cm và cấy trên môi trường MS.<br /> phương của Ấn Độ (Ved and Goraya, 2008). Theo - Phương pháp nuôi cây tái sinh chồi: Sau khi<br /> truyền thống, nhân giống bằng hạt tỷ lệ nảy mầm mẫu vào 20 ngày bật chồi, các chồi được tách ra và<br /> hạt giống thấp ≤ 10% (Gopi et al., 2006), cách tiếp cấy vào môi trường. Bốn công thức tái sinh chồi từ<br /> cận này dẫn đến mức độ đa dạng hóa cao, các sản mẫu được sử dụng là TS1 (MS + 0,5 mg/l BA), TS2<br /> phẩm thảo dược không phù hợp với yêu cầu thương (MS + 0,25 mg/l BA), TS3 (1/2 MS + 0,5 mg/l BA)<br /> mại (Engels & Brinckmann, 2013; Tyub & Kamili, và TS4 (1/2 MS + 0,25 mg/l BA). Thí nghiệm được<br /> 2009) đã giảm hoạt tính và tạo ra sản phẩm kém nhắc lại 3 lần đánh giá khả năng hình thành chồi sau<br /> chất lượng. Để nâng cao trong ngành công nghiệp 5 tuần nuôi cấy.<br /> sản phẩm chăm sóc sức khỏe tự nhiên, nhân giống - Điều kiện nuôi cấy: Mẫu được nuôi cấy trong<br /> trong ống nghiệm in vitro là một kỹ thuật hữu ích bình tam giác, giữ điều kiện nhiệt độ nuôi cấy<br /> và nhân giống được chọn lọc có giá trị cao (Paek 25 ± 2oC, môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng<br /> et al., 2005; Rout et al., 2000) giúp tuân thủ được các 15 phút ở 121oC, 1atm. Thời gian chiếu sáng 14 - 16<br /> quy định và hướng dẫn, tiêu chuẩn chất lượng thực giờ/ngày.<br /> hành khai thác nông nghiệp sạch đối với sức khỏe<br /> - Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu thu thập<br /> ở Canada và Ấn Độ (Government of Canada, 2004;<br /> khử trùng mẫu và tái sinh chồi được sử dụng phần<br /> Ved & Goraya, 2008). Do đó, việc cung cấp Hương<br /> mền SPSS và Excel để tính toán.<br /> nhu tía chất lượng cao, sản xuất hàng loạt thông qua<br /> việc nhân giống trong ống nghiệm kết hợp với sản 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu<br /> xuất nhà kính sẽ là một hệ thống lý tưởng. Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 8 đến tháng<br /> Ở Việt Nam, phát triển và khai thác nguồn giống 12 năm 2017 tại phòng Công nghệ sinh học, Viện<br /> dược liệu phục vụ cho sản xuất đang là vấn đề cấp Dược liệu.<br /> 23<br /> Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(87)/2018<br /> <br /> III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN cho khả năng tạo mẫu sạch và khả năng bật chồi của<br /> Hương nhu tía khác nhau. Trong đó, công thức CT2<br /> 3.1. Kết quả khử trùng mẫu chồi của hương nhu tía<br /> cho tỷ lệ mẫu sạch bật chồi tốt nhất vào 4 phút, đây<br /> Mẫu chồi hương nhu tía sau khi được làm sạch cũng là công thức khử trùng đạt hiệu quả cao nhất<br /> khử trùng HgCl2 0,1% với 4 công thức khác nhau về đối với chồi Hương nhu tía (32%). Khi tăng thời gian<br /> thời gian, sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi khử trùng lên 6 và 8 phút, tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi và<br /> cấy khởi đông, kết quả thu được ở bảng 1. mẫu chết giảm dần, tỷ lệ mẫu chết tăng ở công thức<br /> Bảng 1. Kết quả về thời gian khử trùng khử trùng 8 phút (CT4), tỷ lệ mẫu sống bật chồi 12%,<br /> đến tỷ lệ mẫu sạch bật chồi Hương nhu tía không có mẫu nhiễm nào, trong khi mẫu chết đạt<br /> 88%. Ở công thức CT2 (thời gian khử trùng 2 phút)<br /> Thời Tỷ lệ Tỷ lê Tỷ mẫu<br /> tỷ lệ mẫu nhiễm khuẩn cao 90% trên tổng số mẫu,<br /> Công gian khử mẫu mẫu mẫu<br /> tỷ lệ mẫu sạch bật chồi thấp (10%), không có mẫu<br /> thức trùng sạch nảy nhiễm chết<br /> (phút) chồi (%) (%) (%)<br /> nào chết. Điều này cho thấy nếu kéo dài thời gian<br /> khử trùng với HgCl2 0,1%, hóa chất sẽ ngấm vào mô<br /> CT1 2 10 90 0<br /> thực vật sẽ làm hỏng và gây độc do đó protocorm<br /> CT2 4 32 40 28 không thể phát sinh chồi, phù hợp với các nghiên<br /> CT3 6 25 20 55 cứu trước đây của Jaime et al. (2015) và Nguyễn Văn<br /> CT4 8 12 0 88 Việt (2017). Kết quả nghiên cứu cho thấy công thức<br /> khử trùng phù hợp là công thức CT2 với thời gian<br /> Bảng 1 cho thấy rằng khi sử dụng dung dịch khử trùng 4 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ bật chồi<br /> HgCl2 0,1% để khử trùng với thời gian khác nhau 32% (Hình 1).<br /> <br /> (a) (b) (c)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. (a) chồi sau khi khử trùng đưa vào môi môi trường khởi động; (b) chồi xuất hiện sau 2 tuần nuôi cấy<br /> trên môi trường khởi động; (c) sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy khởi đông<br /> <br /> Kết quả này phù hợp với phân tích thống kê về lẽ trong môi trường MS nồng độ các chất khoáng<br /> phương sai một nhân tố Ftính < 0,05 (= 0,002) thời đa lượng và vi lượng cao hơn nên không thích hợp<br /> gian khử trùng khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến khả cho sự tái sinh chồi nên chồi tái sinh ngắn, các đầu<br /> năng tạo mẫu sạch bật chồi của Hương nhu tía. lá xoăn lại. Trong môi trường ½ MS có tỷ lệ các chất<br /> khoáng phù hợp với sự phát triển của tái sinh chồi<br /> 3.2. Tái sinh chồi Hương nhu tía<br /> nên số chồi trung bình/mẫu đạt 3,0 - 4,5 chồi, chiều<br /> Những chồi tái sinh từ mẫu đưa vào trong môi cao từ 1,1 - 1,5 cm (Hình 2). Kết quả này chứng tỏ<br /> trường nuôi cấy khởi động được cấy chuyển sang môi trường ½ MS cho khả năng tái sinh chồi Hương<br /> môi trường nhân nhanh chồi. Thí nghiệm được bố nhu tía phát triển nhanh và cây xanh tốt và dài hơn<br /> trí với 4 công thức có sử dụng 2 loại môi trường MS môi trường còn lại. Vì vậy thành phần môi trường<br /> và ½ MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA ở nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất<br /> nồng độ 0,5 mg/l và 0,25 mg/l, sau 5 tuần nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của bộ<br /> kết quả thu được thể hiện ở bảng 2. phận nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy<br /> Số liệu bảng 2 cho thấy, hàm lượng vi lượng và Tiên, 2002; Ngô Xuân Bình, 2009), đặc biệt thành<br /> đa lượng ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ nảy chồi của phần khoáng có vai trò quan trọng trong việc cảm<br /> Hương nhu tía. Trong môi trường cả MS số chồi ứng, tăng trưởng và tái sinh chồi trong nuôi cấy mô<br /> trung bình/mẫu đạt 1,5 - 2,0 chồi/mẫu và chiều dài do lượng chất dinh dưỡng trong 2 môi trường khác<br /> của các chồi đạt từ 0,4 tới 0,7 cm, thấp hơn so với nhau. Kết quả này phù hợp với với lý thuyết về khả<br /> các công thức giảm ½ thành phần khoáng (vi lượng năng chuyển hóa và bảo toàn vật chất (Ngô Xuân<br /> và đa lượng) ở công thức thí nghiệm TS3 và TS4. Có Bình, 2009).<br /> <br /> 24<br />  Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(87)/2018<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của môi trường này, nồng độ BA 0,25 mg/l thích hợp hơn so với nồng<br /> đến khả năng tái sinh chồi Hương nhu tía độ BA 0,5 mg/l. Trong 2 loại môi trường MS và ½<br /> Chiều MS số chồi ở nồng độ BA 0,25 mg/l đạt 2,2 chồi/mẫu<br /> Nồng Số chồi và 4,5 chồi /mẫu, trong khi ở nồng độ 0,5 mg/l cho<br /> Công Môi cao trung<br /> độ BA trung<br /> thức trường bình/chồi số chồi thấp hơn dao động là 1,5 chồi/mẫu và 3 chồi/<br /> (mg/l) bình/mẫu<br /> (cm) mẫu. Điều này nhận thấy rằng nồng độ BA có ảnh<br /> TS1 MS 0,5 1,5 0,4 hưởng đáng kể đến sự hình thành chồi của Hương<br /> nhu tía vì BA là chất cytokinin có vai trò trong việc<br /> TS2 0,25 2,2 0,7<br /> hình thành chồi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy<br /> TS3 ½ MS 0,5 3,0 1,1 Tiên, 2002). Qua kiểm tra số chồi/mẫu giữa các công<br /> TS4 0,25 4,5 1,5 thức thí nghiệm p < 0,000, vì vậy điều này chứng tỏ<br /> Sig = 0.000 rằng giữa các công thức thí nghiệm có sự khác nhau<br /> rõ rệt. Kết quả này phù hợp với một vài nghiên cứu<br /> Ngoài ra, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng ảnh về Hương nhu tía nhân giống in vitro trên thế giớí sử<br /> hưởng đến tái sinh chồi Hương nhu tía. Ở nồng độ dụng BA với nồng độ 0,25 mg/l đối với việc tái sinh<br /> khác nhau cho số chồi khác nhau. Trong nghiên cứu chồi (Neeti, 2013; Helgde et al., 2015).<br /> <br /> (a) (b) (c)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. (a) môi trường nuôi cấy 1/2 MS + 0,25 mg/l BA; (b) môi trường nuôi cấy MS + 0,5 mg/l BA;<br /> (c) môi trường nuôi cấy ½ MS + 0,5 mg/l BA<br /> <br /> IV. KẾT LUẬN<br /> Mẫu chồi Hương nhu tía được khử trùng bằng Nigeria. African Journal of Biotechnology Vol 4<br /> dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 4 phút cho tỷ (7):682-684.<br /> lệ tái sinh chồi tốt nhất. Nhân nhanh chồi tái sinh Engels G, Brinckmann J., 2013. Hly Basil Ocimum<br /> được tạo ra trên môi trường ½ MS có bổ sung 0,25 tenuiflorum (syn. O.sanctum) HerbalGram 2013.<br /> mg/l BA cho hệ số nhân chồi và khả năng phát triển American Botanical Council:1-6.<br /> chiều dài của chồi cao hơn so với ở nồng độ 0,5 mg/l, Gopi C, Nataraja Sekhar Y, Ponmurugan P., 2006.<br /> cao hơn môi trường MS cùng nồng độ. In vitro Multiplication of Ocimum gratissimum L.<br /> through direct regeneration. African Journal of<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO Biotechnology Vol 5 (9): 723-726.<br /> Ngô Xuân Bình, 2009. Nuôi cấy tế bào thực vật cơ sở lý Government of Canada, 2013. Natural Health products<br /> luận và ứng dụng. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật. Regulations.<br /> Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Helgde VK, Sunil Kumar MAKH, Deepa Kumari AB.,<br /> NXB Y học. 2015. In vitro callus induction and multiple shoot<br /> Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Công induction of Ocimum tenuiflorum. Global Journal<br /> nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ of Multidisciplinary Studies Vol 4 No. 5, 2348-2495.<br /> Chí Minh. Jaime Ateixeira da Silva, jean arlos Cardoso et al.,<br /> Nguyễn Văn Việt, 2017. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy 2015. Dendrobium micropropagation a review. Plant<br /> Invitro trong nhân giống Lan Hoàng Thảo Kèn Cell Rep. 30: 671-704.<br /> (Dendrobium lituiflorum Lindley). Tạp chí Khoa học Jurges G, Beyerle K, tosenberger M, Haser A, Nick P.,<br /> và Công nghệ Lâm nghiệp số 4: 39-45. 2009. Development and validation of microscopical<br /> Adebolu TT, Aladimeji SA., 2005. Antimicrobial diagnostics for “Tulsi” (Ocimum tenuiflorum L.) in<br /> activity of leaf extracts of Ocimum gratissimum on ayurvedic preparation. European Food Research and<br /> selected diarrhoea causing bacteria in Southwestern Technology 229: 99-106.<br /> <br /> 25<br />