TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 29, 2005<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI HÀM LƯỢNG PROTEIN, <br />
PHỔ ĐIỆN DI PROTEIN CỦA DÒNG CALLUS MÍA <br />
(SACCHARUM OFFICINARUM L.) CHỊU HẠN<br />
Ngô Thị Minh Thu, Hoàng Văn Hạnh, Trương Thị Bích Phượng<br />
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế<br />
<br />
I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Mía là một loại cây công nghiệp ngắn ngày, có vị trí kinh tế ngày càng quan <br />
trọng ở nước ta. Ở một số vùng của Việt Nam, cây mía đã trở thành một trong những <br />
nguồn thu nhập chủ yếu của người dân. <br />
Miền Trung Việt Nam là một vùng nông nghiệp đa dạng, có tiềm năng lớn <br />
trong sản xuất nông nghiệp, nhưng sản lượng lương thực thực phẩm ở vùng này <br />
chưa cao do điều kiện khí hậu khắc nghiệt, hạn hán kéo dài vào mùa khô. Đặc biệt <br />
đối với mía, điều kiện khô hạn, thiếu nước, đất xấu... làm mía sinh trưởng chậm, <br />
thân mía nhỏ, lóng ngắn, năng suất rất thấp. <br />
Vì vậy việc chọn tạo các giống cây trồng có khả năng chống chịu tốt với điều <br />
kiện ngoại cảnh bất lợi, cho năng suất cao, phẩm chất tốt là việc vô cùng quan <br />
trọng, cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn to lớn. <br />
Trong phạm vi bài báo này chúng tôi chỉ xin được trình bày những kết quả <br />
nghiên cứu thu được về sự biến đổi hàm lượng protein, phổ điện di protein và bước <br />
đầu tìm hiểu bản chất của việc xuất hiện băng protein mới ở callus mía xử lý stress <br />
hạn.<br />
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
1. Đối tượng<br />
Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là hai mía giống ROC 10 và ROC 16 của <br />
cây mía đường (Saccharum officinarum L.) [2].<br />
Giống mía ROC 10 có nguồn gốc từ Đài Loan. Giống này có khả năng thâm <br />
canh cao, có tính thích ứng rộng, khả năng nảy mầm và tái sinh khỏe, có năng suất <br />
bình quân đạt 70 tấn/ha và hàm lượng đường cao (1315%). Nếu được thâm canh tốt <br />
có thể đạt năng suất 120125 tấn/ha. Giống mía này đã được công nhận là giống <br />
quốc gia và hiện tại đây là giống mía có diện tích lớn nhất trong vùng mía nguyên <br />
liệu của tất cả nhà máy đường công nghiệp ở nước ta hiện nay [1]. <br />
85<br />
Giống mía ROC 16 có nguồn gốc từ Đài Loan. Đặc điểm của giống này là nảy <br />
mầm và đẻ nhánh mạnh, tập trung, tốc độ vươn lóng cao, độ đồng đều khá, không <br />
trổ cờ, chịu úng tốt, có năng suất trung bình cao (60 tấn/ha) và hàm lượng đường cao. <br />
Giống mía này đã được công nhận là giống quốc gia và áp dụng phổ biến ở nhiều địa <br />
phương trên cả nước [2].<br />
2. Phương pháp nghiên cứu:<br />
2.1. Xử lý stress nước cho callus <br />
Nuôi cấy các mô lá non của mía trên môi trường tạo callus gồm có môi trường <br />
cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung saccharose 30 g/l, 2,4D 3,0 mg/l, <br />
kinetin 0,1 mg/l, agar 8 g/l và pH 5,8. <br />
Các callus chọn lọc được trên môi trường xử lý 3, 6% mannitol được tiếp tục <br />
xử lý mannitol ở các nồng độ 9, 12 và 15% mannitol ở các khoảng thời gian 7, 14, 21 <br />
và 28 ngày xử lý. Các callus sống sót sẽ được phân tích các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh <br />
chứng tỏ cho khả năng chịu hạn của callus.<br />
2.2. Xác định hàm lượng protein và phổ điện di protein<br />
2.2.1. Xác định hàm lượng protein <br />
Hàm lượng protein tổng số được xác định bằng cách đo độ hấp thụ trên máy <br />
quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm (mẫu trắng là đệm PBS pH 7,4). Nồng độ <br />
protein hòa tan tổng số tính theo công thức [5]:<br />
PC (mg/ml) = 1,5 x A280 0,75 x A260<br />
Trong đó PC : nồng độ protein; <br />
A280: độ hấp thụ quang ở bước sóng 280 nm; <br />
A260: độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm. <br />
2.2.2. Điện di protein <br />
Protein sau khi xác định hàm lượng sẽ được điện di SDS trên gel polyacrylamide <br />
12%. <br />
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
1. Hàm lượng protein tổng số của callus mía xử lý stress hạn: <br />
Phản ứng thông thường của thực vật khi chịu tác động bất lợi của ngoại cảnh <br />
là biến đổi hàm lượng và thành phần của protein. Hàm lượng protein và thành phần <br />
chất lượng của chúng đã ảnh hưởng mạnh mẽ lên tính chịu hạn của cây, lượng acid <br />
nucleic cao, đặc biệt là RNA tạo khả năng tổng hợp protein và điều đó làm tăng tính <br />
chống chịu của cây đối với hạn. Purin và primidin ở hàm lượng cao cũng có tác dụng <br />
kích thích sự tổng hợp acid nucleic ở trong cây chịu hạn, chúng ức chế hoạt tính của <br />
enzyme RNase để tăng quá trình tổng hợp protein [4]. <br />
<br />
86<br />
Ở các dòng mía xử lý stress hạn, hàm lượng protein thay đổi khác nhau và <br />
không theo quy luật. Điều này liên quan đến tính đa dạng và không định hướng của <br />
các biến dị di truyền xuất hiện trong qúa trình nuôi cấy mô. Qua kết quả nghiên cứu, <br />
60<br />
chúng tôi nhận thấy callus <br />
Hµm lîng protein (mg/gTLT)<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
48.33<br />
giống ROC 10 xử lý stress hạn <br />
hàm lượng protein tổng số <br />
40<br />
7 ngµy tăng dần khi tăng nồng độ <br />
14 ngµymannitol từ 9 đến 12% và hàm <br />
19.51 21 ngµylượng protein giảm khi xử lý <br />
20 28 ngµycallus trên môi trường bổ sung <br />
15% mannitol trong khoảng <br />
thời gian xử lý 728 ngày. <br />
0 Hàm lượng protein đạt giá trị <br />
0 9 12 15 cao nhất là 48,33 mg/g TLT ở <br />
Nång ®é mannitol (%) môi trường bổ sung 12% <br />
mannitol sau 7 ngày xử lý và <br />
Biểu đồ 1: Sự thay đổi hàm lượng protein hòa tan của callus mía <br />
giá trị thấp nhất là 19,51 mg/g <br />
giống ROC 10 trên môi trường xử lý stress hạn TLT trên môi trường bổ sung <br />
15% mannitol sau 14 ngày xử <br />
Đối với giống ROC 16, hàm lượng protein tăng so v lý. ới đối chứng khi callus <br />
được xử lý stress trên môi trường bổ sung từ 915% mannitol trong 728 ngày xử lý. <br />
Hàm lượng protein đạt giá trị cao nhất là 39,11 mg/g TLT ở môi trường bổ sung 12% <br />
mannitol sau 21 ngày xử lý và giá trị thấp nhất là 12,71 mg/g TLT trên môi trường bổ <br />
sung 9% mannitol sau 7 ngày xử lí.<br />
60<br />
Kết quả nghiên cứu <br />
của chúng tôi phù hợp với <br />
Hµm lîng protein (mg/gTLT)<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
kết quả nghiên cứu của <br />
Nguyễn Hoàng Lộc (1992), <br />
40 39.11<br />
7 ngµy ở những dòng thuốc lá chọn <br />
14 ngµy lọc chịu muối và mất nước, <br />
21 ngµy<br />
hàm lượng các protein tan <br />
20<br />
28 ngµy<br />
trong muối đã tăng lên từ <br />
12.71 1,411,52 lần theo trọng <br />
lượng khô, ngược lại hàm <br />
0<br />
lượng các protein thuộc <br />
0 9 12 15 nhóm albumin lại giảm từ <br />
Nång ®é mannitol (%) 0,810,96 lần so với đối <br />
Biểu đồ 2: Sự thay đổi hàm lượng protein hòa tan của callus mía <br />
chứng [4]. Kết quả nghiên <br />
cứu của Nguyễn Hữu Nhân <br />
giống ROC 16 trên môi trường xử lý stress hạn<br />
(2003) cho thấy, hàm lượng <br />
protein tổng số biến động <br />
rất lớn trong callus mía bị xử <br />
lý mannitol. <br />
87<br />
Callus xử lý 9% mannitol, hàm lượng protein tổng số thấp hơn đối chứng sau <br />
tuần xử lý đầu tiên và cao hơn trong các khoảng thời gian xử lý tiếp theo và đạt giá <br />
trị cực đại 42,953 mg/g TLT [6]. Như vậy, callus khi chuyển lên môi trường có nồng <br />
độ mannitol cao, thế năng nước đã chênh lệch một cách đột ngột, thay đổi đó đã ảnh <br />
hưởng sâu sắc đến trạng thái và độ hoạt động các hệ enzyme trong tế bào [8].<br />
2. Điện di protein: <br />
Kỹ thuật điện di là một công cụ phân tích cho phép đánh giá gián tiếp dò tìm bộ <br />
gen thông qua kĩ thuật phân tích tính biến dị cấu trúc của các enzyme và protein. Dấu <br />
phân tử phát hiện bằng kỹ thuật điện di là độc lập với hình thái và sinh lý của giống <br />
nên nó có nhiều tiện lợi hơn các phương pháp xác định bằng hình thái của giống và <br />
loài [9]. Protein thường được nghiên cứu để đánh giá chất lượng cây trồng như gạo, <br />
đậu, bắp,... Ngoài ra thông qua phân tích protein còn có thể đánh giá tính chịu stress <br />
môi trường (Fan Shuguo, 1999) [3].<br />
Đối với giống ROC 10 xử lý stress hạn ở khoảng nồng độ 1215% mannitol, <br />
phổ điện di của mẫu xử lý stress hạn và đối chứng không có sự khác biệt nhiều. <br />
Trong khoảng 3045 kDa, ở callus được xử lý 1215% mannitol có sự xuất hiện của <br />
một băng protein mới. Ngoài ra, ở callus xử lý stress hạn có xuất hiện một băng <br />
protein có trọng lượng phân tử khoảng 6697 kDa và hai băng protein có trọng lượng <br />
phân tử khoảng 20,130 kDa bắt màu đậm hơn so với đối chứng.<br />
Qua hình 2 chúng tôi nhận thấy, có sự khác biệt rất rõ giữa phổ điện di của <br />
callus mía giống ROC 16 xử lý stress hạn ở nồng độ 1215% mannitol với callus đối <br />
chứng. <br />
Đánh giá phổ điện di của giống ROC 16 xử lý stress hạn cho thấy xuất hiện 4 <br />
băng protein mới và có sự thay đổi về hàm lượng protein thể hiện ở mức độ đậm <br />
nhạt của cả 4 băng. Trên tất cả các mẫu xử lý stress hạn đều thấy xuất hiện 3 băng <br />
protein mới có trọng lượng phân tử khoảng 97 kDa, 4566 kDa, 3045 kDa, trong đó <br />
băng protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 3045 kDa xuất hiện đậm hơn ở <br />
callus xử lý 15% mannitol. Bên cạnh đó, ở callus bị xử lý 15% mannitol có sự xuất <br />
hiện một băng protein mới có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 3045 kDa. Các <br />
callus bị xử lý 12% và 15% mannitol có xuất hiện 3 băng có trọng lượng phân tử <br />
khoảng 6697 kDa, 4566 kDa, 45 kDa bắt màu đậm hơn so với đối chứng.<br />
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá phù hợp với các kết quả nghiên cứu <br />
trước đây. Chua và cs. (1998) đã phát hiện 4 protein mới được tổng hợp trong mô <br />
callus lúa và 7 protein có hàm lượng tăng lên 510 lần dưới tác dụng của stress nước <br />
[4]. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nhân (2003) cho thấy, khi xử lý stress hạn <br />
callus mía ở nồng độ 6% và 9% mannitol không thấy xuất hiện các protein mới, tuy <br />
nhiên có sự khác nhau về hàm lượng protein của các dòng xử lý hạn so với đối <br />
chứng, thể hiện ở mức độ đậm nhạt của các băng trên gel [6].<br />
<br />
<br />
88<br />
89<br />
Hình 1: Phổ điện di của callus mía giống Hình 2: Phổ điện di của callus mía giống <br />
ROC10 xử lý stress hạn ROC16 xử lý stress hạn<br />
Chú thích: A1, A2: callus mía xử lý trên môi trường mannitol 12% ; B1, B2, B3: callus <br />
mía xử lý trên môi trường mannitol 15%; M: protein maker, DC: đối chứng<br />
: vị trí xuất hiện các protein mới : vị trí hàm lượng protein thay đổi so với đối <br />
chứng<br />
Theo Trương Thị Bích Phượng (2004) ngoài sự khác nhau về thành phần protein <br />
còn có sự khác nhau về hàm lượng protein của các dòng chịu hạn so với giống gốc, thể <br />
hiện ở mức độ đậm nhạt của các băng trên gel. Như vậy có thể cho rằng các gene liên <br />
quan đến tính chống chịu tồn tại trong các dòng lúa chọn lọc in vitro và đã hoạt hóa khi <br />
gặp điều kiện bất lợi của môi trường, thể hiện thành protein mới [7].<br />
<br />
4. KẾT LUẬN<br />
<br />
1. Hàm lượng protein của callus giống ROC 10 và ROC 16 có sự thay đổi khi được xử <br />
lý bằng mannitol nồng độ 915% thời gian 728 ngày nuôi cấy. Nhìn chung callus mía bị xử lý <br />
stress hạn có hàm lượng protein cao hơn so với đối chứng.<br />
2. Kết quả phân tích phổ điện di protein:<br />
Đối với callus giống ROC 10 xử lý stress hạn thấy xuất hiện 1 băng protein mới và 3 <br />
băng protein bắt màu đậm hơn so với đối chứng.<br />
Đối với callus giống ROC 16 thấy xuất hiện 4 băng protein mới và 3 băng có sự thay <br />
đổi về hàm lượng protein thể hiện ở mức độ đậm nhạt của các băng. <br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO:<br />
<br />
1. Cục khuyến nông và khuyến lâm Giới thiệu giống mía năng suất chất lượng cao. <br />
Nhà xuất bản Nông nghiệp (1998). <br />
2. Phạm Hoàng Hộ. Cây cỏ Việt Nam. Quyển 3, Tập 2. Mekong Printing Company, <br />
USA.<br />
3. Nguyễn Thị Lang. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. NXB <br />
Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh (2002). <br />
<br />
<br />
<br />
<br />
90<br />
4. Nguyễn Hoàng Lộc. Chọn dòng chịu muối và chịu mất nước ở thuốc lá bằng kỹ <br />
thuật nuôi cấy mô tế bào. Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Viện sinh vật học, Hà <br />
Nội (1992). <br />
5. Nguyễn Văn Mùi. Thực hành Hóa sinh học. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội <br />
(2001).<br />
6. Nguyễn Hữu Nhân. Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh hóa liên quan đến khả năng <br />
chống chịu stress nước ở callus mía (Saccharum officinarum L.). Luận văn tốt <br />
nghiệp, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Huế (2003). <br />
7. Trương Thị Bích Phượng. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy in vitro <br />
và chiếu xạ tia gamma đến sự biến đổi sinh lý, hóa sinh, tế bào và hình thái của cây <br />
lúa (Oryza sativa L.). Luận án tiến sĩ, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học <br />
Huế (2004). <br />
8. Võ Châu Tuấn. Nghiên cứu khả năng chống chịu stress nước ở mô callus lúa (Oryza <br />
sativa L.). Luận văn thạc sĩ khoa học, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Huế <br />
(2000). <br />
9. Dương Hoa Xô. Ứng dụng kĩ thuật điện di protein SDSPage trong công tác chọn <br />
tạo giống lúa chất lượng cao. Trang web Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn <br />
Tp Hồ Chí Minh (www.mard.gov.vn) (2004)<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Các callus giống ROC 10 và ROC 16 được xử lý mannitol ở các nồng độ 9, 12 và 15% ở <br />
các khoảng thời gian 7, 14, 21 và 28 ngày xử lý. <br />
Hàm lượng protein của callus giống ROC 10 và ROC 16 có sự thay đổi khi được xử lý <br />
bằng mannitol nồng độ 915% thời gian 728 ngày nuôi cấy, n hìn chung callus mía bị xử lý <br />
stress hạn có hàm lượng protein cao hơn so với đối chứng.<br />
Kết quả phân tích phổ điện di protein:<br />
Đối với callus giống ROC 10 xử lý stress hạn thấy xuất hiện 1 băng protein mới và 3 <br />
băng protein bắt màu đậm hơn so với đối chứng.<br />
Đối với callus giống ROC 16 thấy xuất hiện 4 băng protein mới và 3 băng có sự thay đổi <br />
về hàm lượng protein thể hiện ở mức độ đậm nhạt của các băng. <br />
<br />
SOME CHANGES OF PROTEIN CONTENTS AND PROTEIN COMPOSITION <br />
OF THE DROUGHT TOLERANT SUGAR CANE <br />
(SACCHARUM OFFICINARUM L.) CALLUS<br />
Ngo Thi Minh Thu, Hoang Van Hanh, Truong Thi Bich Phuong<br />
College of Sciences, Hue University<br />
<br />
SUMMARY<br />
Sugarcane callus of cultivar ROC 10 and ROC 16 were exposed to the aseptic nutritional <br />
medium containing different concentrations of mannitol of 9 to15% after 7, 14, 21 and 28 days.<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
91<br />
Our result showed that the protein contents of callus of cultivar ROC 10 and ROC 16 <br />
increased during the treatment period in the text.<br />
We found that there were changes in its protein composition:In cultivar ROC 10 calli, there <br />
were a new protein band and 3 different protein bands.<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
92<br />