Nghiên cứu tạo chủng escherichia coli tái tổ hợp biểu hiện interleukin-3 và interleukin-11 người dưới dạng lai với PelB

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI TÁI TỔ HỢP<br /> BIỂU HIỆN INTERLEUKIN-3 VÀ INTERLEUKIN-11 NGƯỜI<br /> DƯỚI DẠNG LAI VỚI PelB<br /> Nguyễn Thị Quý, Dương Thu Hương, Lê Ngọc Giang,<br /> Lê Thị Thu Hồng, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải*<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *tnhai@ibt.ac.vn<br /> TÓM TẮT: Interleukin-3 (IL-3) và Interleukin-11 (IL-11) là những cytokine đa chức năng, đóng vai trò<br /> điều hòa sự nhân lên, biệt hóa và trưởng thành của nhiều loại tế bào máu. Gen mã hóa cho protein IL-3 và<br /> IL-11 của người (mã số NM_000588 và NM_000641 trên ngân hàng gen quốc tế) được tổng hợp nhân tạo<br /> cùng tín hiệu tiết pelB và trình tự nhận biết của hai enzyme hạn chế NdeI ở đầu 5' và NotI ở đầu 3', được<br /> đưa vào vector tách dòng pUC57. Sau đó toàn bộ đoạn DNA được chuyển vào vị trí NdeI- NotI của vector<br /> biểu hiện pET22b(+) để tiến hành biểu hiện gen il-3, il-11 trong vi khuẩn E. coli BL21. Kết quả cho thấy ở<br /> 37oC và nồng độ chất cảm ứng là 0,5 mM IPTG, IL-3 được biểu hiện dưới hai dạng: dạng đơn (IL-3<br /> nguyên vẹn đã được cắt bỏ tín hiệu tiết PelB) có kích thước khoảng 15 kDa và dạng lai với tín hiệu tiết<br /> PelB (khoảng 18 kDa). Protein IL-11 biểu hiện ở mức độ thấp và ở dạng đơn, có kích thước khoảng 19<br /> kDa đúng với kích thước của protein IL-11 chuẩn.<br /> Từ khóa: Escherichia coli, Interleukin-3, Interleukin-11, Isopropylthio-β-galactoside (IPTG), tín hiệu tiết PelB.<br /> <br /> MỞ ĐẦU<br /> Interleukin-11 (IL-11) là một cytokine thuộc<br /> họ Interleukin-6, đóng vai trò điều hòa sự nhân<br /> lên, biệt hóa và trưởng thành của nhiều loại tế<br /> bào máu. Theo Souto et al. (2012) [6], protein<br /> IL-11 người tái tổ hợp sản xuất bằng công nghệ<br /> DNA tái tổ hợp từ chủng E. coli hiện nay được<br /> sử dụng trên toàn thế giới để phòng bệnh giảm<br /> tiểu cầu sau hóa trị liệu và giảm nhu cầu truyền<br /> tiểu cầu đối với bệnh nhân bị u tủy ác tính.<br /> Interleukin 3 (IL-3) cũng là một cytokine có<br /> bản chất là glycoprotein, tham gia vào quá trình<br /> tự đổi mới và sống sót của các tế bào nguồn tạo<br /> máu, sự nhân lên, biệt hóa của các tế bào nguồn<br /> và hoạt hóa chức năng của các bạch cầu trưởng<br /> thành [3].<br /> Trong số các hệ biểu hiện protein ngoại lai<br /> hiện nay thì vi khuẩn Gram âm E. coli vẫn là<br /> một trong những hệ biểu hiện thu hút nhiều<br /> quan tâm nhất vì chúng có tốc độ sinh trưởng<br /> nhanh với mật độ tế bào cao trên môi cơ chất<br /> không đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền<br /> đã được nghiên cứu đầy đủ. Hơn nữa, trên thị<br /> trường hiện nay thương mại nhiều loại vector<br /> tách dòng và chủng đột biến đối với hệ biểu<br /> hiện này.<br /> Protein ngoại lai tổng hợp trong tế bào chất<br /> 94<br /> <br /> ở E. coli thường đi kèm với sự cuộn xoắn không<br /> chính xác và tích tụ ở dạng thể vùi. Mặc dù sự<br /> tạo thành thể vùi thuận lợi cho tinh sạch nhưng<br /> việc tái cấu trúc để đảm bảo chức năng sinh học<br /> chưa hiệu quả. Việc tiết protein vào khoang chu<br /> chất sẽ có nhiều ưu điểm, nhất là giảm sự phân<br /> cắt protein đích, tinh sạch dễ dàng, protein độc<br /> với tế bào khu trú trong khoang chu chất. Hầu<br /> hết các protein được tiết ra khoang chu chất là<br /> protein dạng tan, có chức năng sinh học.<br /> Khoang chu chất của tế bào E. coli chứa các<br /> enzyme xúc tác việc tạo thành hoặc tái sắp xếp<br /> cầu disulfide, vì vậy các protein tái tổ hợp biểu<br /> hiện trong E. coli thường được định hướng vận<br /> chuyển đến đây [1].<br /> Có nhiều chuỗi tín hiệu xuất phát từ những<br /> protein tiết trong tự nhiên như OmpA, OmpT,<br /> PelB, β-lactamase và alkaline phosphatase giúp<br /> vận chuyển các polypeptide ngoại lai qua màng<br /> trong nếu được thiết kế ở dạng lai với chúng.<br /> Người ta thường thiết kế thêm tín hiệu dẫn<br /> đường vào đầu N của protein đích. Chúng sẽ<br /> định hướng chuyển protein ra khoang chu chất<br /> và sau đó bị cắt bởi peptidase của màng trong,<br /> phần protein còn lại có hoạt tính được định<br /> hướng tới khoang chu chất của tế bào.<br /> Theo Georgiou & Segatori (2005) [2], nhờ<br /> <br /> Nguyen Thi Quy et al.<br /> tiến bộ về công nghệ biểu hiện trong thời gian<br /> qua, nhiều protein của động vật có vú được sản<br /> xuất đều đặn dưới dạng tiết, năng suất lên tới<br /> gam/lít.<br /> Trong bài báo này, chúng tôi thiết kế tín hiệu<br /> tiết PelB ngay trước gen il-3 và il-11 để định<br /> hướng biểu hiện protein IL-3 và IL-11 người tái<br /> tổ hợp ở khoang chu chất của E. coli, đồng thời<br /> tránh sự gắn không mong muốn của methionin<br /> vào đầu chuỗi polypeptide mới tổng hợp.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Vật liệu<br /> Gen il-3 và il-11 được tổng hợp bởi hãng<br /> Genscript (Hoa Kỳ) và tách dòng trong vector<br /> pUC57. Plasmid pET22b(+) được dùng làm<br /> vector biểu hiện. Chủng E. coli DH10b dùng<br /> cho mục đích tách dòng gen. Chủng E. coli<br /> BL21 (Invitrogen) được dùng làm chủng biểu<br /> hiện protein.<br /> Enzyme hạn chế NotI, NdeI, DNA marker,<br /> protein chuẩn của hãng Fermentas (Đức).<br /> Skimmed<br /> milked<br /> (Difco),<br /> 3,3′,5,5′Tetramethylbenzidine (TMB, Sigma). Protein<br /> tái tổ hợp IL-3 người chuẩn (Biovision) và IL11 chuẩn (Sigma) được dùng làm đối chứng<br /> dương. Kháng thể kháng IL-3 (Bioworld) và IL11 (Abcam) được sử dụng cho phản ứng lai<br /> western blot. Tất cả các hóa chất khác được<br /> mua từ hãng Merck.<br /> Phương pháp<br /> Thiết kế plasmid mang gen il-3 và il-11<br /> Trình tự gen mã hóa protein IL-3 và IL-11<br /> người được tổng hợp dựa trên trình tự gen mã<br /> số NM_000588 và NM_000641 trên Ngân hàng<br /> gen quốc tế, trong đó trình tự amino acid của<br /> IL-11 giống với trình tự amino acid của IL-11<br /> đã được thương mại của hãng Neumega (không<br /> có Prolin). Để định hướng protein tiết ra khoang<br /> chu chất và đảm bảo methionin được cắt khỏi<br /> protein đích, gen il-3 và il-11 được thiết kế thêm<br /> đoạn peptide dẫn đường pelB ở đầu mỗi gen.<br /> Ngoài ra, trình tự nhận biết bởi enzyme hạn chế<br /> NdeI và NotI được đưa vào hai đầu của mỗi gen<br /> để thuận tiện cho việc tách dòng các gen. Trình<br /> tự cassette biểu hiện gen il-3, il-11 được gửi<br /> sang hãng Genscript để tổng hợp và tách dòng<br /> <br /> trong vector pUC57. Sau đó, đoạn gen pelBil3,<br /> pelBil11 được cắt khỏi vector tách dòng bằng<br /> NdeI và NotI và nối vào vector pET22b(+) cũng<br /> đã được xử lý bằng hai enzyme hạn chế trên để<br /> tạo thành vector pET22pelBil3, pET22pelBil11.<br /> Biểu hiện gen il-3 và il-11<br /> Các tế bào E. coli mang vector biểu hiện<br /> pET22pelBil3, pET22pelBil11 được nuôi cấy<br /> trong môi trường Luria Broth có ampicillin<br /> (LBamp) nồng độ 100 µg/ml qua đêm ở 37oC,<br /> 200 vòng/phút rồi chuyển sang sang môi trường<br /> LBamp mới sao cho OD600 ban đầu là 0,1. Tiếp<br /> tục nuôi cấy trong cùng điều kiện cho tới khi<br /> OD600=0,4-0,6 thì bổ sung 0,5 mM<br /> Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) để cảm ứng<br /> promoter tổng hợp protein ngoại lai ở 37oC và<br /> thu mẫu sau 4 giờ nuôi cấy cảm ứng. Tế bào<br /> được thu lại bằng cách ly tâm và hòa lại trong<br /> đệm TrisHCl 20 mM sao cho OD600=10. Sau đó,<br /> tế bào được xử lý trực tiếp bằng đệm xử lý mẫu<br /> để giải phóng protein tổng số. Protein tổng số<br /> có chứa protein tái tổ hợp được phân tích bằng<br /> SDS-PAGE và Western blot.<br /> Tính kháng nguyên của IL-3 và IL-11 được<br /> đánh giá thông qua khả năng liên kết với kháng<br /> thể đặc hiệu.<br /> Mẫu protein được điện di biến tính trên gel<br /> SDS-PAGE 15% và chuyển màng bằng bộ<br /> chuyển màng của BioRad trong 1 giờ, 120 V.<br /> Màng được lấy ra và phủ bằng sữa tách béo 5%,<br /> rồi ủ với kháng thể 1 là kháng thể kháng IL-3<br /> (hoặc IL-11) người trong 1 giờ. Sau bước rửa<br /> bằng đệm TBS 1X, màng tiếp tục được ủ với<br /> kháng thể 2 cộng hợp với enzyme peroxidase<br /> trong 1 giờ và hiện màu với 3,3′,5,5′Tetramethylbenzidine (TMB).<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Thiết kế plasmid mang gen il3 và il11 để biểu<br /> hiện trong E. coli<br /> Các gen il-3, il-11 của người có kích thước<br /> tương ứng là 405 bp và 537 bp. Khi được gắn<br /> pelB và trình tự nhận biết enzyme hạn chế vào đầu<br /> 5', kích thước gen tăng lên tương ứng là 488 bp và<br /> 620 bp (hình 1). Do trong vector có thêm trình tự<br /> nhận biết của NdeI nên khi cắt bằng cặp enzyme<br /> hạn chế này vector đã bị cắt thành hai đoạn có<br /> kích thước khoảng 2,5 kb và 0,25 kb (hình 1).<br /> 95<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99<br /> bp<br /> <br /> 1<br /> <br /> M<br /> <br /> Gen il-3 và il-11, pET22b(+) sau khi xử lý<br /> với NdeI và NotI được phân tách trên gel<br /> agarose và được tinh sạch bằng kít của Qiagen.<br /> Cả ba đoạn DNA pET22b(+), il3, il11 giới hạn<br /> bởi NdeI+NotI có kích thước lần lượt là 5,37 kb,<br /> 488 bp, 620 bp đều được cắt và tinh sạch hiệu<br /> quả (hình 2).<br /> Các đoạn gen il-3, il-11 lần lượt được nối<br /> vào vector pET22b(+) để tạo thành vector<br /> pET22pelBil3 và pET22pelBil11. Sự có mặt của<br /> gen il-3, il-11 trong vector biểu hiện được kiểm<br /> tra bằng chính cặp enzyme hạn chế NdeI và<br /> NotI (hình 3) và giải trình tự gen (kết quả không<br /> trình bày).<br /> <br /> 2<br /> <br /> 10000<br /> 6000<br /> 4000<br /> 3000<br /> 2500<br /> 2000<br /> 1500<br /> 1000<br /> 750<br /> 500<br /> 250<br /> <br /> Hình 1. DNA plasmid được xử lý<br /> bằng enzyme hạn chế<br /> 1. pUC57pelBil11/NdeI+NotI;<br /> 2: pUC57pelBil3/NdeI+NotI; M: DNA marker 1 kb.<br /> bp<br /> <br /> 1<br /> <br /> M<br /> <br /> 2<br /> <br /> bp<br /> <br /> 1<br /> <br /> M<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> 10000<br /> 6000<br /> <br /> 10000<br /> 6000<br /> <br /> 2500<br /> 2000<br /> <br /> 2500<br /> 2000<br /> 1500<br /> <br /> 1500<br /> 1000<br /> <br /> 1000<br /> <br /> 750<br /> <br /> 750<br /> 500<br /> <br /> 500<br /> <br /> 250<br /> <br /> 250<br /> <br /> Hình 2. pET22b(+), gen pelBil3 và pelBil11 tinh<br /> sạch sau khi xử lý bằng NotI và NdeI.<br /> <br /> Hình 3. Cắt kiểm tra vector biểu hiện mang gen<br /> bằng enzyme hạn chế<br /> <br /> 1. pET22b(+)/NdeI+NotI; 2: pelBil3/NdeI+NotI;<br /> 3: pelBil11/NdeI+NotI; M: DNA marker 1kb<br /> (fermentas).<br /> <br /> 1. pET22pelBil3/NdeI+NotI; 2: pET22pelB<br /> il11/NdeI+NotI; M: DNA marker 1 kb<br /> (fermentas).<br /> <br /> a kDa<br /> 116,<br /> 66,2<br /> 45,0<br /> 35,0<br /> <br /> 1 M 1 2 3 4 DC 5 K<br /> <br /> b kDa<br /> <br /> 1 M 2 P 2 3 DC 4 5 K<br /> <br /> 70<br /> 55<br /> 40<br /> 35<br /> 25<br /> <br /> 25,0<br /> 18,4<br /> 14,4<br /> <br /> 15<br /> 10<br /> <br /> Hình 4. Kiểm tra protein biểu hiện từ các dòng E. coli BL21 mang pETpelBil3<br /> bằng Coomassie (a) và phản ứng lai western blot (b)<br /> 1-6. các dòng mang pETpelBIL-3; DC: chủng đối chứng không mang gen;<br /> K. chủng mang gen không cảm ứng IPTG; M1. thang protein chuẩn (Fermentas);<br /> M2. thang protein màu chuẩn (Fermentas); P: protein chuẩn hIL3 (Biovision)<br /> <br /> 96<br /> <br /> Nguyen Thi Quy et al.<br /> Biểu hiện gen il-3 và il-11 trong E. coli<br /> Vector tái tổ hợp mang gen pelBil-3 và il-11<br /> được biến nạp vào tế bào biểu hiện E. coli<br /> BL21. Các dòng biến nạp được nuôi cấy trong<br /> môi trường LBamp và cảm ứng với IPTG. Dịch<br /> phá tế bào được điện di biến tính trên gel SDSPAGE 15% để kiểm tra sự có mặt của protein<br /> quan tâm (hình 4 và 5).<br /> Kết quả nhuộm Coomassie trên hình 4a cho<br /> thấy sau cảm ứng, tất cả các dòng biến nạp (16) đều biểu hiện protein ngoại lai, thể hiện với<br /> một băng protein có kích thước khoảng 15 kDa<br /> tương ứng với kích thước của protein IL-3 và<br /> một băng protein khác có kích thước khoảng<br /> gần 18 kDa, trong khi dòng đối chứng âm<br /> (đường chạy DC) là dòng chỉ mang vector<br /> pET22b(+) và dòng mang gen nhưng không<br /> được cảm ứng IPTG (đường chạy K) đều không<br /> cho hai băng protein này. Theo lý thuyết, đoạn<br /> peptide tín hiệu PelB có kích thước khoảng 2,42<br /> kDa. Sự xuất hiện băng protein có kích thước<br /> khoảng 18 kDa trên điện di đồ được cho là băng<br /> của protein IL-3 gắn với PelB và trong quá trình<br /> biểu hiện có thể chỉ một phần protein IL-3 được<br /> cắt khỏi đoạn peptide tín hiệu. Để chứng minh<br /> lập luận trên, phản ứng lai western blot dựa trên<br /> sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng<br /> thể được thực hiện. Kết quả phân tích miễn dịch<br /> trên Hình 4b cho thấy có hai băng màu xuất<br /> hiện được đánh dấu bằng mũi tên, đó là băng<br /> protein IL-3 (khoảng 15 kDa) và IL-3 liên kết<br /> với PelB (khoảng 18 kDa). Kết quả liên kết<br /> <br /> a kDa<br /> 116,<br /> 66,2<br /> 45,0<br /> 35,0<br /> 25,0<br /> 18,4<br /> 14,4<br /> <br /> 1 K DC P M1 2 3 4 5<br /> <br /> miễn dịch này hoàn toàn thống nhất với kết quả<br /> phân tích SDS-PAGE.<br /> Như đã đề cập ở trên, để protein biểu hiện<br /> dưới dạng tiết thì người ta thường thiết kế thêm<br /> tín hiệu tiết vào đầu N của protein đích. Tuy<br /> nhiên, hiệu suất biểu hiện thường thấp hơn<br /> nhiều và không phải tất cả protein biểu hiện đều<br /> được tiết vào khoang chu chất mà còn tìm thấy<br /> ở trong môi trường, trong tế bào chất và màng<br /> nguyên sinh chất [1, 7]. Kết quả biểu hiện<br /> protein IL-3 từ chủng E. coli tái tổ hợp do<br /> chúng tôi thiết kế cũng giống như trường hợp<br /> trên. Mặc dù được thiết kế gắn thêm pelB vào<br /> đầu gen nhưng chỉ một phần protein biểu hiện<br /> ra được cắt khỏi PelB và phần còn lại vẫn gắn<br /> với tín hiệu tiết này. Theo Mergulhao et al.<br /> (2005) [5], kích thước protein có thể ảnh hưởng<br /> đến hiệu quả tiết. Thành phần amino acid của<br /> peptide tín hiệu và protein đích cũng đóng vai<br /> trò quan trọng. Tốc độ vận chuyển protein ngoại<br /> lai ra khoang chu chất có thể bắt nguồn từ khả<br /> năng tiết hạn chế của bộ máy vận chuyển trong<br /> E. coli. Khi khả năng này bị lấn át thì phần lớn<br /> protein biểu hiện ra dưới dạng thể vùi. Vì thế<br /> việc tối ưu mức độ biểu hiện là điều rất quan<br /> trọng.<br /> Tương tự như vậy, các dòng biến nạp với gen<br /> il-11 cũng được nuôi cấy và cảm ứng với IPTG<br /> để phân tích sự biểu hiện protein IL-11 người tái<br /> tổ hợp trong dịch phá tế bào. Sự biểu hiện protein<br /> ngoại lai được phân tích trên gel SDS-PAGE và<br /> phản ứng lai western blot (hình 5).<br /> <br /> b kDa<br /> <br /> 1 K DC P M2 2 3 4 5 DC<br /> <br /> 170<br /> 70<br /> 55<br /> 40<br /> 35<br /> 25<br /> 15<br /> 10<br /> <br /> Hình 5. Kiểm tra protein biểu hiện từ các dòng E. coli BL21 mang pETpelBil11<br /> bằng Coomassie (a) và phản ứng lai western blot (b)<br /> 1-5. các dòng mang vector pETpelBil11; ĐC. chủng đối chứng không mang gen;<br /> K. chủng mang gen không cảm ứng IPTG; P: protein chuẩn human IL-11 (Sigma);<br /> M1. thang protein chuẩn (Fermentas); M2. thang protein màu chuẩn (Fermentas).<br /> <br /> 97<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2013, 35(3se): 94-99<br /> <br /> Kết quả nhuộm Coomassie trên hình 5a cho<br /> thấy so với dòng đối chứng (ĐC) và dòng không<br /> cảm ứng IPTG (K) thì các dòng còn lại đều<br /> không quan sát thấy băng protein khác biệt<br /> trong khi kết quả lai với kháng thể kháng IL-11<br /> người (hình 5b) cho một băng duy nhất bắt màu<br /> rất yếu, tương ứng với kích thước của protein<br /> IL-11 chuẩn (đường chạy P, mũi tên) ở các dòng<br /> số 1, 3, 4 và 5. Như vậy IL-11 biểu hiện kém<br /> trong chủng chủ và dưới dạng đơn, không giống<br /> như trường hợp IL-3. Mức độ biểu hiện yếu của<br /> IL-11 trong chủng tái tổ hợp có thể liên quan<br /> đến cấu trúc gen il-11 và tính chất của protein<br /> tạo ra. Thành phần nucleotide của gen liên quan<br /> đến mã bộ ba mã hóa cho amino acid.<br /> Khi phân tích sự phù hợp của gen il-11 đối<br /> với chủng chủ thì thấy thành phần GC của gen<br /> lên tới 71,13% và chỉ số phù hợp codon là 0,61.<br /> Thông thường để gen biểu hiện tốt trong chủng<br /> chủ thì chỉ số phù hợp codon lớn hơn 0,8 và<br /> thành phần GC nằm trong ngưỡng 30-70%.<br /> Mức độ biểu hiện protein ngoại lai trong chủng<br /> chủ phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau. Theo<br /> Mehlin at el. (2006) [4], sự phù hợp của gen,<br /> kích thước phân tử, điểm đẳng điện (PI) của<br /> protein đích đối với E. coli liên quan mật thiết<br /> đến khả năng biểu hiện trong chủng chủ.<br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Gen il-3 và il-11 đã được thiết kế gắn với tín<br /> hiệu tiết pelB và đưa vào vector biểu hiện<br /> pET22b(+) và biểu hiện trong tế bào E. coli<br /> BL21. Protein IL-3 tái tổ hợp tạo ra ở dạng đơn<br /> và dạng lai với tín hiệu tiết PelB trong khi<br /> protein IL-11 biểu hiện ở dạng đơn. Phân tích<br /> miễn dịch cho thấy protein IL-11 biểu hiện ở<br /> mức độ thấp, thể hiện ở tín hiệu yếu với kháng<br /> thể kháng IL-11.<br /> Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện từ<br /> nguồn kinh phí của đề tài độc lập cấp nhà nước<br /> “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-3 và<br /> Interleukin-11 tái tổ hợp chất lượng cao dùng<br /> trong y học (điều trị)” giai đoạn 2013-2015.<br /> Công trình có sử dụng trang thiết bị của Phòng<br /> <br /> 98<br /> <br /> thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> 1. Baneyx F., 1999. Recombinant protein<br /> expression in Escherichia coli. Curr Opin<br /> Biotechnol., 10(5): 411-21.<br /> 2. Georgiou G., Segatori L., 2005. Preparative<br /> expression of secreted proteins in bacteria:<br /> status report and future prospects. Curr Opin<br /> Biotechnol., 16(5): 538-545.<br /> 3. Kaushansky K., Shoemaker S. G., Broudy<br /> V. C., Lin N. L., Matous J. V., Alderman E.<br /> M., Aghajanian J. D., Szklut P. J., VanDyke<br /> R. E., Pearce M. K., 1992. Structurefunction relationships of interleukin-3. An<br /> analysis based on the function and binding<br /> characteristics of a series of interspecies<br /> chimera of gibbon and murine interleukin-3.<br /> J. Clin. Invest., 90(5): 1879-1888.<br /> 4. Mehlin C., Boni E., Buckner F. S., Engel L.,<br /> Feist T., Gelb M. H., Haji L., Kim D., Liu<br /> C., Mueller N., Myler P. J., Reddy J. T.,<br /> Sampson J. N., Subramanian E., Van<br /> Voorhis W. C., Worthey E., Zucker F., Hol<br /> W. G., 2006. Heterologous expression of<br /> proteins from Plasmodium falciparum:<br /> results from 1000 genes. Mol. Biochem.<br /> Parasitol., 148(2): 144-160.<br /> 5. Mergulhao F. J. M., Summers D. K.,<br /> Monteiro G. A., 2005. Recombinant protein<br /> secretion in Escherichia coli. Biotechnology<br /> Advances 23: 177-202.<br /> 6. Souto R. B., Stamm F. P., Ribela M. T.,<br /> Bartolini P., Calegari G. Z., Dalmora S. L.,<br /> 2012. Validation of a stability-indicating<br /> RP-LC method for the assessment of<br /> recombinant human interleukin-11 and its<br /> correlation with bioassay. Anal Sci., 28(3):<br /> 215-220.<br /> 7. http://www.embl.de/pepcore/pepcore_servic<br /> es/protein_expression/ecoli/improving_prot<br /> ein_solubility/<br /> <br />