Nghiên cứu thành phần alkaloid trong tâm sen (nelumbo nucifera gaertn nelumbonaceae)

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN ALKALOID TRONG TÂM SEN<br /> (NELUMBO NUCIFERA GAERTN NELUMBONACEAE)<br /> Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ*, Nguyễn Đức Tuấn**, Trần Hùng*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) họ Nelumbonaceae là một trong số ít các dược thảo mà tất cả các<br /> bộ phận đều là những vị thuốc quí. Việc nghiên cứu thành phần hóa học cây Sen đã được một số tác giả trên thế<br /> giới thực hiện. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu kỹ và toàn diện về tâm Sen. Trong<br /> hướng nghiên cứu về thành phần và tác dụng sinh học của Sen ở các tỉnh phía Nam, bài báo này công bố về<br /> thành phần alkaloid của tâm Sen và phân lập alkaloid chính trong Sen để dùng làm chất chuẩn cho tiêu chuẩn<br /> hoá các dược liệu cũng như góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học cho cây Sen Việt Nam.<br /> Mục tiêu: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của alkaloid trong tâm Sen.<br /> Phương pháp: Chiết cao chiết toàn phần và tách thành các phân đoạn đơn giản bằng phân bố giữa nuớc với<br /> các dung môi có độ phân cực khác nhau và theo pH. Phân lập chất tinh khiết bằng sắc ký cột chân không và sắc<br /> ký cột cổ điển... Cấu trúc các chất phân lập được xác định bằng phổ UV-Vis, MS, NMR.<br /> Kết quả: Tách được các phân đoạn đơn giản hơn (P, NP8, NP5) từ cao alkaloid toàn phần theo sự biến<br /> thiên pH. Đồng thời đã phân lập được alcaloid EN-1, EN-2 được xác định là neferin và nuciferin.<br /> Kết luận: Đề tài đã xác định được chất tinh khiết neferin và nuciferin tạo cơ sở cho việc định tính điểm chỉ<br /> và định lượng neferin trong tâm Sen ở các vùng miền và mùa thu hái khác nhau hay các chế phẩm chứa tâm Sen<br /> bằng kỹ thuật HPLC/PDA.<br /> Từ khóa: Nelumbo nucifera, Nelumbonaceae, Alkaloid, Neferin.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON ALKALOIDAL CONSTITUENTS OF LOTUS EMBRYO<br /> (NELUMBO NUCIFERA GAERTN )<br /> Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 606 - 611<br /> Background: Lotus (or Sen in Vietnamese) - Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae is one of the few<br /> herbs that all components are valuable medicines. The studies on its chemical constituents have been conducted<br /> by numbers of authors in the world. However, in Vietnam there have not been many researchs on this plants. In<br /> the direction of chemical and pharmacological studies on lotus of south Vietnam, this paper will report the<br /> alkaloidal constituents and the isolation of the main alkaloid of Loti embryo.<br /> Objectives: Extraction, isolation and structure elucidation of alkaloids in Loti embryo.<br /> Methods: Alcoholic extract of embryo was subjected to liquid-liquid distribution based on the solubility of<br /> the substances in solution by pH. Simple fractions was separated by extraction, fractionation and isolation were<br /> carried out as common phytochemical methods. Structures of isolated compounds were deduced by means of UV,<br /> MS and NMR spectroscopy.<br /> Results: The content of alkaloid in crude ethanol extraction of Loti embryo was 0.99%. The simpler fractions<br /> (P, NP8, NP5) obtained by liquid-liquid distribution based gradient pH. Two alkaloids EN-1, EN-2 were isolated<br /> *Khoa Dược, Trường đại học Y Dược Cần Thơ **Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 0918057096<br /> Email: tranhung@uphcm.edu.com<br /> <br /> 606<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> and identified as neferine and nuciferine.<br /> Conclusion: Two major alkaloids of Loti embryo. ie. neferine and nuciferine, was isolated and identified.<br /> These alkaloids could be used as markers for quality control and investigation of there pharmacological activities<br /> in further studies.<br /> Keywords: Nelumbo nucifera, enbryo, alkaloid, neferine, nuciferine, structure.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Trong kho tàng thực vật và cây thuốc Việt<br /> Nam, cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn.<br /> Nelumbonaceae) mọc ở ao, hồ có ở khắp mọi<br /> miền đất nước, là một trong số ít các dược thảo<br /> mà tất cả các bộ phận đều là những vị thuốc quí,<br /> có giá trị sinh học cao(2,5). Tuy nhiên, hiện nay<br /> việc sử dụng các chế phẩm bào chế từ tâm, lá<br /> Sen như thuốc viên uống, cao thuốc, các loại trà<br /> đều là dạng cao toàn phần, dịch chiết toàn phần.<br /> Do đó nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tiêu<br /> chuẩn hóa thành phần alkaloid chính có tác<br /> dụng sinh học trong tâm Sen Việt Nam sẽ góp<br /> phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của dược<br /> liệu và các chế phẩm từ Sen cũng như thăm dò<br /> các tác dụng sinh học của chúng là việc làm cần<br /> thiết.<br /> <br /> Định tính bằng sắc ký lớp mỏng<br /> <br /> NGUYÊN<br /> LIỆUNGHIÊN CỨU<br /> <br /> PHƯƠNG<br /> <br /> Qua thăm dò một số hệ dung môi cho sắc ký<br /> lớp mỏng, hệ dung môi DCM-MeOH-NH4OH<br /> (90:10:1) có khả năng tách tốt các alkaloid phân<br /> cực mạnh và trung bình của tâm Sen và hệ dung<br /> môi DCM-MeOH-NH4OH (95:5:1) tách tốt các<br /> alkaloid kém phân cực.<br /> UV365<br /> <br /> UV254<br /> <br /> Dragendorf<br /> f<br /> <br /> PHÁP<br /> <br /> Nguyên liệu<br /> Tâm Sen (được sấy khô ở 40 0C và bảo quản<br /> ở nhiệt độ thấp) được thu mua từ cơ sở “Chế<br /> biến các sản phẩm từ Sen” tại Thị Trấn Mỹ Thọ,<br /> TP. Cao Lãnh. Mẫu được định danh và lưu tại<br /> bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược<br /> TP.HCM.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Phân tách các phân đoạn chiết bằng phân bố<br /> lỏng-lỏng, sắc kí cột chân không. Phân lập các<br /> chất bằng sắc kí cột cổ điển, sắc ký rây phân tử<br /> và kết tinh phân đoạn.<br /> <br /> Hình 1. Sắc ký đồ alkaloid toàn<br /> phần của tâm sen<br /> Hdm: DCM-MeOH-NH4OH (90:10:1)<br /> <br /> Chiết cao chiết cồn toàn phần<br /> Cao cồn toàn phần của tâm Sen được chiết<br /> theo quy trình sau:<br /> <br /> Xác định phổ UV các chất phân lập được<br /> trên máy Hitachi L2000 detector DAD và phổ<br /> MS trên máy Quatro Micro API (Waters).<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 607<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Bột tâm sen<br /> Cồn 70%,<br /> thu hồi cồn dưới áp suất giảm<br /> <br /> Dịch chiết đậm<br /> đ<br /> <br /> Kết quả tách các phân đoạn từ cao chiết cồn<br /> được minh hoạ trong Hình 2<br /> <br /> Thêm H2SO4<br /> <br /> TP P NP NP5<br /> NP7<br /> <br /> Dịch acid<br /> <br /> Dịch sau khi loại kết<br /> tinh<br /> <br /> phân đoạn NP5. Tiếp tục kiềm hóa dịch pH=4-5<br /> ở trên đến pH=7-8, chiết phân bố với CHCl3 đến<br /> khi hầu như không còn alkaloid qua lớp CHCl3.<br /> Dịch chiết được gộp lại thu được phân đoạn<br /> NP8.<br /> <br /> UV365<br /> <br /> UV254<br /> <br /> Dragendorff<br /> <br /> Kết tinh thô I<br /> <br /> NH4OH đến pH=9, chiết với CHCl3<br /> Dịch chiết CHCl3<br /> <br /> Dịch kiềm pH=7-8<br /> <br /> Chiết với NaOH<br /> TP P NP NP5 NP7<br /> <br /> Phân đoạn NP<br /> <br /> Phân đoạn P<br /> <br /> TP P NP NP5 NP7<br /> <br /> TP P NPNP5 NP7<br /> <br /> Hình 2. Sắc ký đồ các phân đoạn từ cao cồn<br /> Hdm: DCM-MeOH-NH4OH (90:10:1)<br /> <br /> Phân lập EN-1<br /> Dịch chiết pH=5<br /> <br /> Phân đoạn NP5<br /> <br /> Điều chỉnh đến pH=7-8, Chiết với CHCl3<br /> Dịch kiềm<br /> <br /> Phân đoạn NP8<br /> <br /> Tách phân đoạn P, NP, NP8<br /> Từ phân đoạn NP ở trên, dịch CHCl3 được<br /> cô đến cắn, hòa vào H2SO4 2% điều chỉnh đến<br /> pH=5 bằng NH4OH 25%, chiết phân bố với<br /> CHCl3 đến khi hầu như không còn alkaloid qua<br /> lớp CHCl3. Dịch chiết được gộp lại thu được<br /> <br /> 608<br /> <br /> Phần kết tinh thô I được hòa tan trong một<br /> lượng vừa đủ H2SO4 loãng, lọc và để kết tinh<br /> trong tủ lạnh. Tinh thể được lọc và rửa kỹ bằng<br /> nước lạnh đến khi dịch rửa trung tính, thu được<br /> tinh thể hình kim, màu trắng (EN-1).<br /> Tiến hành sắc ký lớp mỏng cho thấy EN-1 là<br /> một alkaloid phân cực trung bình và có hàm<br /> lượng cao nhất trong tâm Sen và EN-1 chỉ cho<br /> một vết trên đèn UV và thuốc thử Dragendorff<br /> cho thấy kết tinh thô I là tinh khiết trên TLC với<br /> EN-1.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Hình 4. SKĐ của EN-1 trên ba hệ dung môi khác nhau<br /> với λmax của neferin mà tài liệu nước ngoài đã<br /> Phổ UV của EN-1 trong dung môi nước cho<br /> công bố(4).<br /> λmax 282nm nằm trong vùng hấp thu của<br /> alkaloid có khung bibenzylisoquinolein phù hợp<br /> Phổ MS có đỉnh [M-Na]+ có m/z = 647, tương<br /> ứng với khối lượng phân tử 624 của neferin(4).<br /> EN1-20ppm<br /> <br /> Abs<br /> <br /> 1.0<br /> <br /> 0.5<br /> <br /> 0.0<br /> 200<br /> <br /> 282<br /> <br /> 300<br /> <br /> 400<br /> <br /> Hình 5. Phổ Uv-vis của EN-1<br /> <br /> Phân lập EN-2 từ NP8<br /> NP8 được cô dưới áp suất giảm để được<br /> dịch CHCl3 đậm đặc và phần kết tủa màu vàng.<br /> Dịch CHCl3 được cô tới cắn. Hòa tan cắn với<br /> lượng vừa đủ dung dịch H2SO4 2%. Dịch acid<br /> được loại tạp bằng ether dầu hỏa và kiềm hóa<br /> bằng amoniac tới pH 8-9. Chiết alkaloid từ dịch<br /> kiềm bằng chloroform và cô thu hồi dung môi<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Hình 6. Phổ MS của EN-1<br /> thu được cắn. Hòa tan vào một lượng tối thiểu<br /> methanol và để kết tinh thu được hình lăng trụ<br /> (EN-2).<br /> Tiến hành SKLM cho EN-2 với ba hệ dung<br /> môi khác nhau, EN-2 chỉ cho một vết trên đèn<br /> UV và thuốc thử Dragendorff cho thấy EN-2 là<br /> một alkaloid kém phân cực và tinh khiết trên<br /> TLC.<br /> <br /> 609<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Hình 7. Sắc ký đồ kiểm tra EN-2<br /> huỳnh quang xanh lục sáng dưới đèn UV254. Phổ<br /> EN-2 có dạng tinh thể hình lăng trụ, không<br /> khối ESI – MS positive của EN-2 cho mảnh [M<br /> màu, không mùi, vị đắng. Nhiệt độ nóng chảy<br /> +H]+ ở m/z = 296,01, mảnh [M + Na]+ có m/z =<br /> khoảng 163-164 0C, αD27 = -1450C<br /> 317,93, mảnh [M – OCH3]+ có m/z = 264,96 và<br /> = 0.67, EtOH), λmax (log ε EtOH) = 310 nm (3.83),<br /> mảnh [M – (OCH3 + CH3)]+ có m/z = 249,91.<br /> 272 nm (4.32), 230 nm (4.36) (Hình 8). EN-2 có<br /> <br /> Hình 8. Phổ UV của EN-2<br /> <br /> Hình 9. Phổ MS của nuciferin<br /> <br /> Phổ 1H-NMR, 13C-NMR của EN-2 cho thấy<br /> phân tử có 21H, 19C trong đó có 3C bậc 1, 3C<br /> bậc hai, 6C bậc ba, 7C bậc 4. Chuyển dịch hoá<br /> học của carbon của EN-2 được so sánh với<br /> nuciferin, một trong những alkaloid chính của<br /> tâm Sen. EN-2 có chuyển dịch hoá học hoàn toàn<br /> phù hợp với chuyển dịch hoá học của nuciferin<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> trong tài liệu<br /> <br /> Thành phần alkaloid của tâm Sen đã được<br /> khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng. alkaloid chính<br /> trong đó đã được phân lập và xác định cấu trúc<br /> <br /> . Qua các dữ liệu thu được có thể<br /> <br /> (5,6)<br /> <br /> kết luận EN-2 là nuciferin (C19H21NO2)<br /> <br /> 610<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br />