Nghiên cứu thu nhận, nuôi cấy và đánh giá một số đặc điểm hình thái quần thể tế bào gốc phôi bò Việt Nam

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284<br /> <br /> NGHIÊN CỨU THU NHẬN, NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM<br /> HÌNH THÁI QUẦN THỂ TẾ BÀO GỐC PHÔI BÒ VIỆT NAM<br /> <br /> Lê Thành Long*, Đoàn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Thị Hồng Vân, Hoàng Nghĩa Sơn<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)lelong2510@gmail.com<br /> <br /> TÓM TẮT: Tế bào gốc phôi bò hiện nay được phân lập và nuôi cấy ở giai đoạn phôi nang từ 7-9 ngày<br /> hoặc giai đoạn phôi từ 12-14 ngày. Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào<br /> gốc phôi bò ở giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Kết quả 9 phôi dâu và 3 phôi nang giai đoạn sớm đã được<br /> thử nghiệm nuôi cấy phôi nguyên cho thiết lập tế bào gốc phôi. Tuy nhiên, các blastomere trong 9 phôi<br /> dâu không thể bám vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển, chỉ có 1 trong 3 phôi nang giai đoạn sớm bám<br /> được vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển thành quần thể tế bào gốc phôi bò. Quần thể tế bào gốc phôi<br /> bò sơ cấp được cấy chuyền 2 lần. Ở lần cấy chuyền thứ nhất, 6 quần thể tế bào gốc phôi được quan sát<br /> thấy và kích thước các quần thể này dao động từ 50-100 µm. Chỉ có 2 trong 6 quần thể tế bào ở lần cấy<br /> chuyển thứ nhất duy trì được hình thái của quần thể tế bào gốc phôi. Ở lần cấy chuyền thứ hai, 5 quần thể<br /> tế bào gốc phôi được quan sát và kích thước các quần thể này dao động từ 70-140 µm. Các quần thể tế bào<br /> gốc phôi bò trên đều có đường bao quanh rõ tuy nhiên bề mặt của các quần thể này không trơn bóng như<br /> quần thể tế bào gốc phôi chuột. Cả 5 quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thứ 2 bị thoái hoá chỉ<br /> sau một tuần nuôi cấy. Tế bào gốc phôi bò được thử nghiệm biệt hoá in vitro và chúng có khả năng biệt<br /> hoá thành thể phôi. Đây là một đặc điểm quan trọng cho thấy tế bào gốc phôi bò thu được có tính đa tiềm<br /> năng.<br /> Từ khóa: Phôi bò, đa tiềm năng, nuôi cấy phôi nguyên, tế bào gốc phôi..<br /> <br /> MỞ ĐẦU nuôi cấy tế bào gốc phôi bò được thực hiện ở<br /> Tế bào gốc phôi (embryonic stem cells - phôi nang giai đoạn ngày 7-9 [172,11, 9] hoặc<br /> ESCs) là những tế bào đa tiềm năng thường có thể phân lập từ phôi giai đoạn ngày thứ 12-<br /> được thu nhận từ phôi nang (blastocyst) giai 14 [6]. Tuy nhiên, thời gian tối ưu cho viêc phát<br /> đoạn tiền làm tổ (pre-implantation). Chúng có triển phôi giai đoạn tiền làm tổ để thu nhận tế<br /> khả năng tự làm mới (re-newal) để tạo thành bào gốc phôi vẫn còn chưa biết rõ. Những cố<br /> một số lượng lớn tế bào mà không thay đổi đặc gắng thu nhận tế bào gốc phôi bò từ hợp tử và<br /> tính đa tiềm năng và có khả năng biệt hóa thành phôi phân chia giai đoạn sớm hầu hết đều thất<br /> các loại tế bào khác nhau trong cơ thể [5]. bại [18, 8], trong đó chỉ có một dòng tế bào tế<br /> Chúng biểu hiện các makers hay các đặc tính bào gốc phôi bò duy nhất được tăng sinh từ phôi<br /> chuyên biệt bao gồm các kháng nguyên đặc giai đoạn hai tế bào, được nuôi cấy hơn 3 năm<br /> hiệu cho giai đoạn phôi, sự hoạt động của các [8]. Trong khi đó, phôi bò giai đoạn phôi dâu<br /> enzyme như alkaline phosphatase và telomerase được sử dụng cho việc phân lập tế bào gốc phôi<br /> cũng như gene đặc trưng cho tính đa tiềm năng có hiệu quả hình thành các quần thể từ 60-70%<br /> như Oct4 và Nanog [1]. Hơn nữa, chúng có khả [17,18]. Cho đến nay, các dòng tế bào gốc phôi<br /> năng biệt hoá in vivo thành khối u quái bò vẫn chưa được thiết lập một cách bền vững<br /> (teratomas), các khối u này chứa các tế bào có và một số đặc điểm hình thái của quần thể tế<br /> đặc điểm giống như các tế bào trong ba lớp bào gốc phôi bò chưa được đánh giá một cách<br /> mầm phôi: nội bì, trung bì, ngoại bì và chúng có đầy đủ. Do đó, trong công trình này, chúng tôi<br /> khả năng biệt hóa in vitro trực tiếp thành 200 bước đầu nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế<br /> loại tế bào khác nhau trong cơ thể trưởng thành bào gốc phôi bò Việt Nam ở một số giai đoạn<br /> [12]. Các dòng tế bào gốc phôi đã được phân khác nhau, đồng thời đánh giá khả năng tăng<br /> lập thành công từ phôi nang của chuột, khỉ và sinh cũng như đặc điểm hình thái của một số<br /> người, hơn nữa việc thu nhận còn có thể được quần thể tế bào gốc phôi bò.<br /> thực hiện từ phôi ở giai đoạn trước khi compact<br /> [4, 3, 18]. Hầu hết những cố gắng phân lập và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> <br /> <br /> 277<br />  Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son<br /> <br /> Nuôi chín trứng bò chứa tế bào nuôi dưỡng bị bất hoạt bởi<br /> Trứng bò được thu nhận từ lò mổ sau đó mitomycin C. Phôi nguyên sẽ được nuôi cấy<br /> được chuyển về phòng thí nghiệm. Phức hợp trong môi trường tế bào gốc phôi Knock-out<br /> trứng-cumulus (Cumulus - Oocyte complex) DMEM (Gibco) chứa 20% Knock-out Serum<br /> được thu nhận bằng phương pháp chọc hút. Replacement (Gibco), 1% pen/strep (Gibco), 200<br /> Phức hợp trứng-cumulus được nuôi trong môi µM mercaptoethanol (Sigma), 1% L-glutamine<br /> trường TCM199 (Sigma) bổ sung 20% FBS (Gibco), 1000 IU/ml LIF, 1% Non-essencial<br /> (Gibco), 1% Pen/Strep (Gibco), 2 µg/ml β- amino acid (Gibco), 1% nucleoside (0,73 g/L<br /> estradiol (Sigma), 10IU FSH (Sigma) và 10IU cytidine, 0,85 g/L guanosine, 0,73 g/L Uridine,<br /> LH (Sigma) ở 38,5oC, 5% CO2 trong vòng 22- 0,8 g/L adenosine, 0,24 g/L thymidine).<br /> 24 giờ. Cấy chuyền tế bào gốc phôi bò<br /> Thụ tinh in vitro trứng bò Quần thể tế bào gốc phôi được thu nhận<br /> Trứng sau khi được nuôi chín sẽ được sử bằng ống mao quản, sau đó được chuyển vào<br /> dụng cho thụ tinh in vitro. Tinh trùng được đĩa 96 giếng chứa Trypsin-EDTA 0,25%<br /> swim-up trong môi trường TALP-HEPES (chứa (Gibco). Khi tách rời hoàn toàn, các tế bào sẽ<br /> 2 mM sodium pyruvate, 1% pen/strep và được chuyển vào đĩa nuôi mới chửa lớp tế bào<br /> 3mg/ml BSA) trong 1 giờ ở 38,5oC. Trứng được nuôi dưỡng bị bất hoạt bởi mitomycin C. Tế bào<br /> thụ tinh với tinh trùng trong vi giọt thụ tinh với được nuôi trong môi trường nuôi tế bào gốc<br /> mật độ 1 × 106 tinh trùng/ml. Quá trình thụ tinh phôi ở 38,5oC, 5% CO2.<br /> được diễn ra ở 38,5oC, 5% CO2 trong 8 giờ. Sau Thử nghiệm biệt hoá in vitro<br /> đó trứng thụ tinh sẽ được loại bỏ tinh trùng và Quần thể tế bào gốc phôi được tách bằng<br /> được nuôi cấy trong môi trường nuôi phôi sofa Trypsin-EDTA 0,25% thành tế bào đơn, sau đó<br /> ở 38,5oC, 5% CO2. các tế bào này được nuôi cấy trong đĩa petri với<br /> Chuẩn bị lớp tế bào nuôi dưỡng môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi không<br /> Tế bào nuôi dưỡng (nuôi dưỡng cells) được chứa LIF. Thể phôi có cấu trúc hình cầu sẽ xuất<br /> sử dụng trong nghiên cứu này là nguyên bào sợi hiện sau 1-2 tuần nuôi cấy.<br /> phôi chuột được phân lập và nuôi cấy từ thai<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> chuột nhắt trắng 12,5-13,5E. Nguyên bào sợi<br /> phôi chuột ở lần cấy chuyển thứ 2 sẽ được sử Đánh giá hiệu quả loại bò màng zona bằng<br /> dụng làm tế bào nuôi dưỡng. Nguyên bào sợi pronase và acid tyrode<br /> phôi chuột được bất hoạt bằng mitomycin C 10 Trong việc tạo phôi bằng phương pháp thụ<br /> µg/ml trong vòng 2,5 giờ. Sau đó nguyên bào tinh trong ống nghiệm, chỉ những phôi không có<br /> sợi phôi chuột được rửa lại bằng môi trường sự phân mảnh được chọn lọc cho quá trình nuôi<br /> nuôi cấy tế bào gốc phôi 2 lần mỗi lần 10 phút. phôi. Những phôi bị phân mảnh bị loại bỏ. Quá<br /> Loại bỏ màng zona trình phân mảnh của phôi là một đặc điểm hình<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử thái của quá trình apoptosis và quá trình này ảnh<br /> nghiệm loại bỏ màng zona của phôi bò bằng hai hưởng lớn tới sự phát triển của phôi cũng như<br /> yếu tố là enzyme pronase (Sigma) và acid việc thiết lập các dòng tế bào gốc phôi.<br /> tyrode pH 2,5 (Gibco). Phôi bò giai đoạn 8-16 Để nuôi cấy tế bào gốc phôi, việc loại bỏ<br /> tế bào sẽ được dùng cho khảo sát nồng độ màng zona rất quan trọng cho việc thu nhận<br /> enzyme pronase cũng như acid tyrode trong phôi ở các giai đoạn khác nhau [15]. Các cách<br /> việc loại bỏ màng zona. phổ biết nhất hiện nay để loại bỏ màng zona của<br /> Nuôi cấy phôi nguyên phôi là sử dụng acid tyrode, sử dụng enzyme<br /> hoặc sử dụng hệ thống hỗ trợ laser. Tuy nhiên, ở<br /> Phôi bò giai đoạn morula và giai đoạn đối tượng gia súc đặc biệt là ở bò, phương pháp<br /> blastocyst sớm được xử lý loại bỏ màng zona. phổ biến nhất để loại bỏ màng zona là sử dụng<br /> Phôi đã loại bỏ màng zona được chuyển lên đĩa enzyme pronase.<br /> <br /> <br /> 278<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284<br /> <br /> Trong bài báo này, enzyme pronase được sử nhận và nuôi cấy tế bào gốc phôi từ hai đối<br /> dụng ở các nồng độ khác nhau để kiểm tra khả tượng này, acid tyrode là hóa chất được sử dụng<br /> năng loại bỏ màng zona của phôi bò. Chúng tôi phổ biến nhất [13]. Trong nghiên cứu này, acid<br /> sử phôi phôi bò ở giai đoạn 8 tế bào đến 16 tế tyrode cũng được sử dụng để thử nghiệm loại<br /> bào để kiểm tra khả năng này của enzyme bỏ màng zona của phôi bò. Tuy nhiên, sau khi<br /> pronase. Kết quả xử lý loại bỏ màng được trình xử lý với acid tyrode 30 phút, cấu trúc và hình<br /> bày trong bảng 1. thái màng zona gần như không biến đổi (hình<br /> Kết quả xử lý cho thấy, ở nồng độ 10 1D, 1D1). Điều đó cho thấy, acid tyrode không<br /> mg/ml, màng zona của phôi bò bị loại bỏ nhanh hiệu quả trong việc loại bỏ màng zona của phôi<br /> chỉ sau 1 phút. Tuy nhiên, màng zona chỉ bị loại bò. Hơn nữa, thời gian sử lý với acid tyrode rất<br /> bỏ một nửa đủ để phôi thoát ra ngoài. Quá trình lâu nên nó có thể ảnh hưởng tới chất lượng và<br /> loại bỏ màng zona ở nồng độ 10 mg/ml diễn ra sự phát triển của phôi bò.<br /> nhanh nhưng nó lại ảnh hưởng lớn tới các tế bào<br /> phôi bên trong. Cấu trúc phôi bị thay đổi mạnh,<br /> liên kết giữa các tế bào phôi bị cắt và các tế bào<br /> phôi này rất dễ rời nhau (hình 1A, 1A1). Ở nồng<br /> độ 0,5 mg/ml, màng zona của phôi bị loại bỏ<br /> hoàn toàn sau 7 phút. Quá trình loại bỏ này diễn<br /> ra lâu, phôi có hiện tượng bị biến dạng (hình<br /> 1C, 1C1). Điều đó cho thấy, ở nồng độ này,<br /> enzyme pronase cũng tác động lớn tới các tế<br /> bào phôi bên trong vì thời gian xử lý lâu,<br /> pronase cắt đứt các liên kết giữa các tế bào<br /> phôi, làm tách rời các tế bào phôi và phôi bị<br /> biến dạng. Ở nồng độ 5 mg/ml, màng zona của<br /> phôi bò bị loại bỏ sau 3 phút, phôi gần như vẫn<br /> giữ nguyên được cấu trúc và hình dạng giống<br /> như trước khi xử lý (hình 1B, 1B1). Các tế bào<br /> phôi gần như không tách rời nhau. Điều đó cho<br /> thấy, nồng độ pronase 5 mg/ml là thích hợp nhất<br /> cho việc loại bỏ màng zona, thời gian xử lý ở<br /> nồng độ này ngắn mà phôi gần như không bị<br /> thay đổi cấu trúc, hình dạng, tế bào phôi không Hình 1. Quá trình xử lý loại bỏ màng zona của<br /> bị tách rời, đây là những điều kiện rất quan phôi<br /> trong cho việc phân lập và nuôi cấy tế bào gốc [A, A1]. phôi bò trước và sau khi xử lý với pronase<br /> phôi bò. 10 mg/ml; [B, B1]. phôi bò trước và sau khi xử lý<br /> với pronase 5 mg/ml; [C, C1]. phôi bò trước và sau<br /> Acid tyrode pH 2,5 (Gibco) được sử dụng<br /> khi xử lý với pronase 0,5 mg/ml; [D, D1]. phôi bò<br /> rất phổ biến trong việc loại bỏ màng zona của trước và sau khi xử lý với acid tyrode pH 2,5.<br /> trứng, phôi chuột hay heo và trong việc thu<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả loại màng zona bằng pronase and acid tyrode<br /> Số phôi dùng cho<br /> Tác nhân loại màng Số phôi được loại màng zona<br /> loại màng zona<br /> Pronase 10 mg/ml 13 13<br /> Pronase 5 mg/ml 12 12<br /> Pronase 0,5 mg/ml 13 13<br /> Acid tyrode pH 2,5 11 0<br /> <br /> <br /> 279<br />  Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son<br /> <br /> Nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc phôi bò Đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào gốc<br /> Quá trình phân lập và nuôi cấy được thực phôi bò bằng cấy chuyền<br /> hiện với phôi dâu và phôi nang giai đoạn sớm. Các tế bào gốc phôi bò được nuôi cấy trên<br /> Phôi được xử lý với pronase 5 mg/ml để loại bỏ lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển trong môi<br /> màng zona. Sau đó, phôi được rửa nhiều lần trường chứa LIF 1.000 IU/ml. Sau 48 giờ nuôi<br /> bằng môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi và cấy, sáu quần thể tế bào gốc phôi bò hình thành<br /> được chuyển lên đĩa nuôi cấy có chứa tế bào và phát triển trên lớp tế bào nuôi dưỡng. Quần<br /> nuôi dưỡng đã bất hoạt bằng mitomycin C để thể tế bào gốc phôi bò trên phát triển mạnh, số<br /> nuôi cấy sơ cấp. Trong nuôi cấy sơ cấp, nhân tố lượng tế bào tăng nhanh. Tuy nhiên, một số tế<br /> ức chế bệnh bạch cầu (LIF-leukemia inhibitory bào vùng ngoài của quần thể tế bào gốc phôi bò<br /> factor) được sử dụng ở nồng độ 1.000 IU/ml biệt hoá và mọc lan trên bề mặt đĩa nuôi cấy<br /> môi trường nuôi cấy. Nồng độ LIF này được sử cũng như mọc chồng lên lớp tế bào nuôi dưỡng.<br /> dụng để bước đầu đánh giá khả năng phát triển Hình thái các quần thể tế bào gốc phôi bò ở<br /> của quần thể tế bào gốc phôi bò trong quá trình lần cấy chuyền thứ nhất cũng không trơn nhẵn<br /> nuôi cấy sơ cấp cũng như sự tăng sinh của tế như hình thái của quần thể tế bào gốc chuột, tuy<br /> bào gốc phôi bò sau các lần cấy chuyền khác nhiên, các quần thể trên đều có đường bao<br /> nhau. Kết quả nuôi cấy phôi nguyên cho thấy, quanh rất rõ. Đó là một đặc điểm phân biệt quần<br /> các blastomere của phôi dâu không thể bám và thể tế bào gốc phôi với các cụm tế bào do nhiều<br /> tăng sinh trên lớp tế bào nuôi dưỡng (bảng 2). tế bào kết cụm lại với nhau [7]. Kích thước của<br /> Ba phôi nang giai đoạn sớm được nuôi cấy trên các quần thể tế bào gốc phôi bò này dao động từ<br /> lớp tế bào nuôi dưỡng. Tuy nhiên, các tế bào 30 µm cho tới 60 µm (hình 2). Kích thước các<br /> trong 2 phôi đầu tiên không thể bám vào lớp quần thể tế bào gốc phôi ở lần cấy chuyền thứ<br /> nuôi dưỡng và bị thoái hóa sau 1 tuần nuôi cấy. nhất này không đồng đều. Điều đó chứng tỏ số<br /> Chỉ có 1 quần thể tế bào từ phôi thứ ba bám lượng tế bào gốc phôi trong mỗi quần thể khác<br /> được vào lớp tế bào nuôi dưỡng và phát triển nhau, do đó, khả năng tăng sinh của các tế bào<br /> thành quần thể tế bào gốc phôi bò sau 3 tuần gốc phôi bò trong quần thể tế bào nuôi cấy sơ<br /> nuôi cấy. Quần thể tế bào gốc phôi bò này có cấp khác nhau.<br /> đường bao quanh rõ nhưng hình thái quần thể<br /> hơi gồ ghề, không trơn nhẵn như quần thể tế Các quần thể này tiếp túc tăng sinh và phát<br /> bào gốc phôi chuột. Sau 3 tuần nuôi cấy, quần triển sau 96 giờ nuôi cấy. Kích thước của các<br /> thể tế bào gốc phôi bò này được thu nhận và các quần thể tế bào gốc phôi bò tiếp tục tăng. Kích<br /> tế bào được tách rời thành tế bào đơn cho cấy thước các quần thể dao động từ 50 µm cho tới<br /> chuyền. Các tế bào này được chuyển lên lớp tế 100 µm. Kết quả này cho thấy, các tế bào gốc<br /> bào nuôi dưỡng mới để nuôi cấy. Quá trình này phôi trong các quần thể tế bào gốc phôi ở lần<br /> được thực hiện để đánh giá khả năng tăng sinh cấy chuyền thứ nhất vẫn còn khả năng tăng sinh<br /> của quần thể tế bào gốc phôi bò. mạnh.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Sự phát triển của các quẩn thể tế bào gốc phôi bò trên lớp tế bào nuôi dưỡng ở lần cấy<br /> chuyển thứ nhất sau 48 giờ nuôi cấy. Thang chia độ 100 µm.<br /> <br /> 280<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284<br /> <br /> Sau 1 tuần nuôi cấy, các quần thể 1, 2, 3, 5 duy trì được hình thái giống quần thể tế bào gốc<br /> của lần cấy chuyền thứ nhất bị thoái hoá. phôi.<br /> Hình thái của các quần thể này chuyển từ dạng Quần thể số 4 được sử dụng cho cấy chuyền<br /> ụ (hill) sang dạng phẳng (flat), điều đó chứng tỏ và quần thể số 6 được sử dụng cho thử nghiệm<br /> các tế bào trong các quần thể này đã biệt hóa. khả năng biệt hoá của tế bào gốc phôi bò.<br /> Chỉ còn lại quần thể số 4 và quần thể số 6<br /> <br /> Bảng 2. Khả năng tăng sinh của tế bào gốc phôi bò<br /> Số phôi sử dụng nuôi Số phôi Số quần thể cấy Số quần thể cấy<br /> Giai đoạn phôi<br /> cấy tế bào gốc bám chuyền lần 1 chuyền lần 2<br /> Phôi dâu 9 0 0 0<br /> Phôi nang 3 1 6 5<br /> <br /> Tế bào gốc phôi bò của quần thể thứ 4 được hơn. Tuy nhiên, về mặt hình thái, các quần thể<br /> thu nhận và cấy chuyền qua đĩa mới chứa lớp tế tế bào gốc ở lần cấy chuyền thứ hai này<br /> bào nuôi dưỡng bị bất hoạt mitomycin C. không đồng đều như các quần thể ở lần cấy<br /> Tế bào gốc phôi ở lần cấy chuyền thứ hai này chuyền thứ nhất. Tuy vẫn có đường bao quanh<br /> cũng được nuôi cấy và tăng sinh trên lớp tế bào rõ, nhưng hình thái của các quần thể tế bào gốc<br /> nuôi dưỡng được bất hoạt bởi mitomycin C và ở lần cấy chuyền thứ hai này gồ ghề hơn nhiều<br /> môi trường chứa 1.000 IU/ml LIF. Sau 96 giờ và nhiều quần thể có hình thái biến dạng<br /> nuôi cấy, năm quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần không còn tròn đều. Quần thể tế bào gốc số 2 và<br /> cấy chuyền thứ hai này hình thành và phát triển. số 5 ở lần cấy chuyền thứ 2 này có bề mặt gồ<br /> Kích thước của các quần thể này dao động từ ghề nhất, điều đó cho thấy các tế bào gốc trên<br /> 70 µm cho tới 140 µm (hình 3). Nếu so với các bề mặt cũng như tế bào xung quanh của quần<br /> quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần cấy chuyền thể này đã bắt đầu biệt hóa và không còn giữ<br /> thứ nhất, các quần thể tế bào gốc phôi bò ở được đặc tính tăng sinh mạnh của tế bào gốc<br /> lần cấy chuyền thứ hai này có kích thước lớn phôi nữa.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Sự phát triển của các quần thể tế bào gốc phôi bò trên lớp tế bào nuôi dưỡng ở lần cấy<br /> chuyền thứ hai sau 96 giờ nuôi cấy. Thang chia độ 100 µm.<br /> <br /> Cả năm quần thể tế bào gốc phôi bò ở lần thương mại hóa. Do đó, hầu hết các nhà nghiên<br /> cấy chuyền thứ 2 đều bị thoái hóa sau 1 tuần cứu sử dụng LIF người (hLIF) để bổ sung vào<br /> nuôi cấy. Môi trường được sử dụng cho nuôi môi trường nuôi cấy cho phôi bò và các quần<br /> cấy các quần thể tế bào gốc nói trên là môi thể tế bào gốc phôi bò vì chúng có trình tự<br /> trường nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột chứa tương đồng cao với trình tự LIF người. Mặc dù<br /> 1.000 IU/ml LIF. Ở bò, LIF được dòng hóa và vậy, việc sử dụng LIF người có thể ảnh hưởng<br /> sử dụng trong nuôi cấy, tuy nhiên, nó chưa được lớn tới quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi bò đặc<br /> <br /> <br /> 281<br />  Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son<br /> <br /> biệt là việc duy trì khả năng tự làm mới cũng cần thiết cho việc duy trì khả năng tự làm mới,<br /> như tính đa tiềm năng của các quần thể tế bào nó còn cần thiết cho sự biểu hiện của các<br /> gốc phôi bò. marker đa tiềm năng ở tế bào gốc phôi bò<br /> Những nghiên cứu trước đây cho thấy rằng, (Oct4, Nanog, SSEA1) cũng như duy trì đặc<br /> việc thiết lập tế bào gốc phôi bò có thể được điểm hình thái đặc trưng của quần thể tế bào<br /> thực hiện bằng môi trường nuôi cấy không chứa gốc phôi [15].<br /> LIF [8]. Hơn nữa, trong quá trình nuôi cấy phôi Các nghiên cứu về ảnh hưởng của LIF lên<br /> bò, hLIF không làm gia tăng [16] hay giảm quá trình nuôi cấy tế bào gốc phôi bò cho thấy,<br /> cũng như không có tác động lên ICM trong phôi cần phải có những sự khảo sát kĩ hơn về tác<br /> nang của bò [10]. Việc tăng sinh các quần thể tế động của LIF lên sự tăng sinh của các tế bào<br /> bào từ phôi bào không phụ thuộc vào việc bổ gốc phôi bò. Đặc biệt là nồng độ LIF cần cho<br /> sung LIF [20]. Dựa vào các kết quả trên, LIF nuôi cấy tế bào gốc phôi bò vì LIF ảnh hưởng<br /> dường như không đóng vai trò quan trọng trong trực tiếp đến sự tăng sinh và khả năng tự làm<br /> việc duy trì tính đa tiềm năng của tế bào gốc mới của tế bào gốc phôi bò, mà hình thái của<br /> phôi bò. các quần thể tế bào gốc phôi bò là đặc điểm đầu<br /> Tuy nhiều nghiên cứu khác lại cho rằng LIF tiên để đánh giá.<br /> cần thiết cho quá trình tăng sinh và duy trì tính Thử nghiệm khả năng biệt hóa in vitro<br /> đa tiềm năng của tế bào gốc phôi bò [11], không Tế bào gốc phôi có khả năng biệt hoá thành<br /> những vậy, LIF còn cần cho quá trình nuôi cấy nhiều loại tế bào khác nhau trong ba lớp mầm<br /> tế bào gốc phôi bò được phân lập từ phôi thụ phôi, bao gồm nội phôi bì, trung phôi bì và<br /> tinh trong ống nghiệm, phôi nhân bản vô tính ngoại phôi bì. Khả năng biệt hóa này đều diễn<br /> hay phôi trinh sản [7]. LIF không chỉ ra trong điều kiện in vitro và in vivo [19, 5, 14].<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Sự hình thành thể phôi. Các tế bào gốc phôi được tách rời và nuôi cấy<br /> trên đĩa petri chứa môi trường không chứa LIF. Hai thể phôi xuất hiện sau 2 tuần nuôi cấy.<br /> Các thể phôi có cấu trúc hình cầu (mũi tên trắng).<br /> <br /> Quần thể tế bào gốc thứ 6 ở lần cấy chuyền kích thước khác nhau điều đó chứng tỏ sự tăng<br /> thứ nhất được thu nhận và tách thành tế bào đơn sinh cũng như khả năng biệt hoá của tế bào gốc<br /> trong đĩa 96 giếng chứa Trypsin-EDTA 0,25%. phôi bò từ quần thể thu nhận là không đồng<br /> Sau đó, tế bào được chuyển qua các đĩa petri nhất. Điều đó chứng tỏ, các tế bào trong quần<br /> chứa môi trường nuôi tế bào gốc phôi bò nhưng thể được thu nhận có tính đa tiềm năng thông<br /> không chứa nhân tố ức bạch cầu (LIF). Sau hai qua việc biệt hóa thành các thể phôi trong điều<br /> tuần nuôi cấy, các thể phôi hình thành. Các thể kiện nuôi cấy in vitro.<br /> phôi này có cấu trúc hình cầu, và được hình<br /> KẾT LUẬN<br /> thành do sự tăng sinh và biệt hoá từ các tế bào<br /> gốc phôi bò. Tuy nhiên, các thể phôi này có Bước đầu chúng tôi đã phân lập và nuôi cấy<br /> <br /> <br /> 282<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 277-284<br /> <br /> thành công quần thể tế bào gốc phôi bò. Các Cell Line Derived from Precompacting<br /> quần thể này biểu hiện một số đặc điểm của Embryos. Cloning, 3: 59-67.<br /> quần thể tế bào gốc phôi và khả năng tăng sinh 9. Munoz M., A. Rodriguez, C. De Frutos, J.<br /> qua các lần cấy chuyền. N. Caamano, C. Diez, N. Facal, E. Gomez,<br /> Lời cảm ơn: Chúng tôi chân thành cảm ơn Sở 2008. Convetional pluripotence markers are<br /> Khoa học Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh unspecific for bovine embryonic derived<br /> đã hỗ trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài cell-lines. Theriogenology, 69: 1159-1164.<br /> này. 10. Rodrigues J. L., Oliveira A. T., Lopes R.<br /> F., 2006. Gene expression and<br /> TÀI LIỆU THAM KHÀO<br /> developmental competence of<br /> 1. Byrne J. A., S. M. Mitalipov and D. P. bovine embryos produced in vitro with<br /> Wofl, 2006. Current progress with primate different serum concentrations. Reprod.<br /> Embryonic stem cell. Curr. Stem. Cell. Res. Domest. Anim., 41(2): 129-136.<br /> Ther., 1: 127-138. 11. Saito S., Sawai K., Ugai H, Moriyasu S.,<br /> 2. Cibelli J. B., S.L. Stice, P.J. Golueke, J. J. Minamihashi A., Yamamoto Y., Hirayama<br /> Kane and J. Jerry, 1998. Transgenic bovine H., Kageyama S., Pan J., Murata T.,<br /> chimeric offspring produced from somatic Kobayashi Y., Obata Y., Yokoyama K. K.,<br /> cell-derived stemlike cells. Nat. Biotechnol., 2003. Generation of cloned calves and<br /> 16: 642-646. transgenic chimeric embryos from bovine<br /> 3. Delhaise F., V. Bralion, N. Schuurbiers and embryonic stem-like cells. Biochemical and<br /> F. Dessy, 1996. Establishment of an Biophysical Research Communications,<br /> embryonic stem cell line from 8-cell stage 309: 104-113.<br /> mouse embryos. Eur. J. Morphol., 34: 237- 12. Savatier P., S. Huang, L. Szekely, K. G.<br /> 243. Wiman, J. Samarut, 1994. Constracting<br /> 4. Eistetter H. R., 1988. A mouse pluripotent patterns of retinoblastoma protein<br /> embryonal stem cell line stage-specifically expression in mouse embryonic stem cells<br /> regulates expression of homeo-box and embryonic fibroblasts. Oncogene, 9:<br /> containing DNA sequences during 809-818.<br /> differentiation in vitro. Eur. J. Cell. Biol., 13. Sayaka W., Takafusa H., Rinako S., Yuko<br /> 45: 315-321. S., Hong-Thuy Bui, Eiji M. and Teruhiko<br /> W., 2007. Efficient Establishment of Mouse<br /> 5. Evans M., Kaufman M. H., 1981.<br /> Embryonic Stem Cell Lines from Single<br /> Establishment in culture of pluripotential<br /> Blastomeres and Polar Bodies. Stem Cells,<br /> cells from mouse embryos. Nature, 292:<br /> 25: 986-993.<br /> 154-156.<br /> 14. Shamblott M. J., Axelman J., Wang S.,<br /> 6. Gjorret J. O. and P. Maddox-Hyttel, 2005. Bugg E. M., Littlefield J. W., Donovan P. J.,<br /> Attemps towards derivation and Blumenthal P. D., Huggins G. R., Gearhart<br /> establishment of bovine embryonic stem J. D., 1998. Derivation of pluripotent stem<br /> cell-like cultures. Reprod. Fertil. Dev., 17: cells from cultured human primordial germ<br /> 113-124. cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726-<br /> 7. Wang Li, Duan Enkui, Sung Li-ying, Jeong 13731.<br /> Byeong-Seon, Yang Xiangzhong, X. Cindy 15. Shanbo Cao, Fang Wang, Zhisheng Chen,<br /> Tian, 2005. Generation and Characterization Zhong Liu, Cheng Mei, Haojia Wu, Junjiu<br /> of Pluripotent Stem Cells from Cloned Huang, Chao Li, Lingjun Zhou, Lin Liu,<br /> Bovine Embryos. Biology of Reproduction, 2009. Isolation and Culture of Primary<br /> 73: 149-155. Bovine Embryonic Stem Cell Colonies by a<br /> 8. Mitalipova M., Beyhan Z., First N. L., Novel Method. Journal of Experimental<br /> 2001. Pluripotency of Bovine Embryonic Zoology, 311A: 368-376.<br /> <br /> 283<br />  Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son<br /> <br /> 16. Sirisathien S., Brackett B. G., 2003. 19. Thomson J. A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro<br /> Influence of postmortem delay in aspiration S. S., Waknitz M. A., Swiergiel J. J.,<br /> of oocytes on production of bovine Marshall V. S., Jones J. M., 1998.<br /> blastocysts in vitro. Vet. Rec., 153(11): 334- Embryonic stem cell lines derived from<br /> 335. human blastocysts. Science, 282: 1145-<br /> 17. Stice S. L., N. Strelchenko, C. L. Keefer, L. 1147.<br /> Matthews, 1996. Pluripotent bovine 20. Vejlsted M., Du Y., Vajta G., Maddox-<br /> embryonic stem cell lines direct embryonic Hyttel P., 2006. Post-hatching development<br /> developmet following nuclear transfer. Biol. of the porcine and bovine embryo defining<br /> Reprod., 54: 100-110. criteria for expected development in<br /> 18. Strelchenko N., 1996. Bovine pluripotent vivo and in vitro. Theriogenology, 65(1):<br /> stem cells. Theriogenology, 45: 131-140. 153-165.<br /> <br /> <br /> ISOLATION AND CULTURE OF BOVINE EMBRYONIC STEM-LIKE CELLS<br /> USING WHOLE ZONA-FREE EMBRYO CULTRUE<br /> <br /> Le Thanh Long, Doan Thi Hong Hanh, Nguyen Thi Hong Van, Hoang Nghia Son<br /> Institute of Tropical Biology, VAST<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> <br /> Zona membranes of bovine embryos were dissolved using 5 mg/ml pronase to collect zona-free embryos.<br /> Whole embryo culture was applied for bovine embryonic stem cell establishment. Bovine embryonic stem<br /> cells were isolated and cultured from bovine morula stage embryos and blastocyst stage embryos. Nine<br /> morula stage embryos were cultured on mouse embryonic fibroblast inactivated by 10 µg/ml mitomycin C.<br /> However, there was no attachment or proliferation of morula blastomere on the feeder cell layer. Whole<br /> blastocyst stage embryo culture were also used to establish embryonic stem cells. One blastocyst stage<br /> embryo attached to feeder cell layer and proliferated to embryonic stem-like cell colony in three weeks. The<br /> primary bovine embryonic-like colony were collected and passaged to passage one. Six embryonic-like<br /> colonies were formed on feeder layer in passage one. The colonies’ diameter of passage one is from 50µm to<br /> 100 µm. Four colonies were degenerated. Colony 4 and 6 proliferated continuously in one week. Colony 4<br /> was picked up and passaged to passage 2. Five embryonic-like colonies were formed on the feeder layer in<br /> passage two. The colonies’ diameter of passage two was from 70 µm to 140 µm. However, all embryonic-like<br /> colonies of passage two degenerated in one week. These colonies of passage one and two had embryonic-like<br /> morphology, and were surrounded by clear boundaries. This characteristic is very important to distinguish<br /> embryonic-like colonies from feeder cell cluster. Colony 6 of passage one was treated to Trysin-EDTA and<br /> culture in petri dish with embryonic stem cell medium without leukemia inhibitory factor. Some embryoid<br /> bodies were formed in two weeks. This result supported the pluripotent property of these embryonic stem-like<br /> cells.<br /> Keywords: bovine embryo, embryonic-like colony, embryonic stem cells, pluripotency, whole emrbyo<br /> culture.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 284<br />