Nghiên cứu toàn bộ trình tự gen pagA trên một số chủng Bacillus anthracis phân lập ở miền Bắc Việt Nam

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TOÀN BỘ TRÌNH TỰ GEN PAGA TRÊN MỘT SỐ<br /> CHỦNG BACILLUS ATHRACIS PHÂN LẬP<br /> Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM<br /> Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nghiên cứu trình tự đầy đủ gen pagA (protective antigen gene) mã hóa kháng<br /> nguyên bảo vệ PA (protein quan trọng tham gia tạo độc tố bệnh than) trên một số chủng<br /> Bacillus anthracis có độc lực phân lập ở miền Bắc Việt Nam. Vật liệu và phương pháp: 3 chủng<br /> B. anthracis do Viện Y học Dự phòng Quân đội cung cấp. Tách chiết và khuếch đại chính xác<br /> ADN tổng số từ dịch nuôi cấy sau khi đã bất hoạt bằng nhiệt sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Toàn<br /> bộ gen pagA được tách dòng trong vector pJET1.2/blunt, lựa chọn các plasmid tái tổ hợp mang<br /> gen mong muốn và phân tích trình tự. Kết quả và kết luận: đã tách dòng và giải trình tự toàn bộ<br /> gen pagA của 3 chủng B. anthracis có độc lực. Xác định được 3 đột biến điểm (TC), gồm 1<br /> đột biến đồng nghĩa (TC)195 và 2 đột biến sai nghĩa (TC)1693, (TC)1799 khi so sánh với trình<br /> tự tham chiếu B. anthracis Vollum-USA. Đột biến (TC)1693 xuất hiện trên cả 3/3 chủng B.<br /> anthracis nghiên cứu. Còn 2 đột biến là (TC)195 và (TC)1799 tìm thấy ở cả 2 chủng 4NS,<br /> 1C3. Gen pagA rất bền vững, không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng B. anthracis<br /> nghiên cứu ở Việt Nam và thế giới.<br /> *<br /> <br /> Từ khóa: Gen pagA (protective antigen gene); Tách dòng gen; Độc lực; Bacillus anthracis;<br /> Việt Nam.<br /> <br /> Study of Complete Sequence of Protective Antigen Gene of<br /> Bacillus Anthrasis Strains Isolated in Northern Vietnam<br /> Summary<br /> Objectives: Study of the entire sequences of pagA gene encoding protective antigen of<br /> Bacillus anthracis strains isolated in Northern Vietnam. Materials and methods: Three B.<br /> anthracis strains were provided by the Military Institute of Preventive Medicine. Total DNA of<br /> heat inactived cultures were extracted and amplified PCR high fidelity using specific primer<br /> pairs for complete pagA gene. The amplified pagA gene from B. anthracis strains were cloned<br /> in pJET1.2/blunt by conventional recombinant methods and analysed recombinants plasmid by<br /> restriction enzyme. PagA gene was sequenced from both ends by extension from vector<br /> specific priming sites (pJET1.2_F and pJET1.2_R) and by primer walking.<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 08/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/02/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 02/03/2015<br /> <br /> 135<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> Results and conclusions: The pagA gene complete sequences were cloned, analysed of 3 B.<br /> anthracis strains VCM1168, 4NS, 1C3 isolated in Northern Vietnam and this is the first<br /> publication in Vietnam. Three point mutations (TC) were identified, one synonymous mutation<br /> (TC)195 and two missense mutations (TC)1693 (Serine  Proline) and (TC)1799 (Valine<br /> Alanine) when compared with B. anthracis strain Vollum-USA. The results demonstrate that<br /> pagA gene of B. anthracis strains is very conservative, there is no sequenced significant<br /> difference between the studied B. anthracis strains in Vietnam and the world. The entire pagA<br /> gene sequences of 3 B. anthracis strains VCM1168, 4NS and 1C3 were submitted in Genbank<br /> with accession number KP213102, KP213103 and KP213104, respectively.<br /> * Key words: PagA gene (protective antigen gene); Cloning; Virulence; Bacillus anthracis;<br /> Vietnam.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> B. anthracis là trực khuẩn Gram<br /> dương, sinh bào tử gây bệnh than nguy<br /> hiểm ở người và động vật. Khả năng gây<br /> bệnh của B. anthracis chủ yếu nhờ sự có<br /> mặt của các gen nằm trên 2 plasmid lớn<br /> là pXO1 (182 kb) và pXO2 (95 kb) - được<br /> gọi là plasmid độc tố. pXO1 chứa các gen<br /> sản xuất độc tố, trong khi pXO2 chứa gen<br /> liên quan đến quá trình tổng hợp vỏ polyD-glutamic axít [5, 8]. Chỉ những chủng<br /> có đầy đủ 2 plasmid này mới có khả năng<br /> gây bệnh nguy hiểm. Những chủng thiếu<br /> 1 trong 2 plasmid (pXO1+, pXO2-); (pXO1, pXO2+) hoặc thiếu cả 2 plasmid (pXO1-,<br /> pXO2-) sẽ bị giảm hẳn độc lực hoặc<br /> không còn khả năng gây bệnh [7, 8]. Trên<br /> plasmid pXO1, có 3 gen quan trọng nhất<br /> lần lượt là gen lef mã hóa cho yếu tố gây<br /> chết lethal factor (LF), gen cya mã hóa là<br /> yếu tố gây phù nề (edema factor, EF) một adenylyl cyclase dẫn đến phù nề da<br /> trong những cá thể nhiễm bệnh và gen<br /> pagA mã hóa cho kháng nguyên bảo vệ<br /> PA - protein quan trọng tham gia tạo độc<br /> tố bệnh than (Anthrax) [6]. Trong đó, gen<br /> pagA với kháng nguyên PA đóng vai trò<br /> quyết định độc tính của vi khuẩn (VK)<br /> 136<br /> <br /> than. Bản thân PA không gây độc, nhưng<br /> khi khi kết hợp với yếu tố LF hay EF cho<br /> phép tạo độc tố gây chết hay phù thũng<br /> trong tế bào chủ nhiễm bệnh. Ngoài ra,<br /> PA còn có khả năng gây đáp ứng miễn<br /> dịch chống bệnh than [3, 8, 9].<br /> Trên thế giới, đã có một số công trình<br /> nghiên cứu về gen pagA cũng như<br /> nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của<br /> kháng nguyên bảo vệ PA. Price và CS<br /> nghiên cứu về gen pagA từ 26 mẫu đa<br /> dạng về nguồn gốc để xác định sự biến<br /> đổi tự nhiên trong gen này, giúp hiểu<br /> thêm sự tiến hóa của B. anthracis [9]. Ở<br /> Việt Nam, bệnh than vẫn còn xuất hiện rải<br /> rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Sơn<br /> La, Điện Biên, Lai Châu... [1]. Gần đây,<br /> (10 - 2014) ở Mèo Vạc, Hà Giang đã ghi<br /> nhận 09 ca nhiễm bệnh than do ăn thịt gia<br /> súc chết mắc bệnh than. Việc xuất hiện<br /> trở lại của VK than một lần nữa cảnh báo<br /> mầm bệnh nguy hiểm này cần được quan<br /> tâm đúng mức và có phương án phòng<br /> chống hiệu quả, tránh để xảy ra bùng<br /> phát dịch. Hiện nay, nghiên cứu phân tử<br /> về VK than phân lập ở Việt Nam, đặc biệt<br /> về gen pagA còn hạn chế, chưa có<br /> nghiên cứu phân tích trình tự toàn bộ<br /> chiều dài gen pagA [1, 2]. Với phạm vi bài<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> báo này, chúng tôi công bố những kết<br /> quả đạt được trong nghiên cứu tách dòng<br /> và phân tích trình tự toàn bộ gen pagA từ<br /> 3 chủng B. anthracis có độc lực được<br /> phân lập ở miền Bắc Việt Nam làm tiền<br /> đề cho việc nghiên cứu chẩn đoán phân<br /> tử VK than có độc lực.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Chủng VK B. anthracis và tách<br /> chiết ADN.<br /> Chủng B. anthracis VCM1168, 4NS và<br /> 1C3 có độc lực do Viện Y học Dự phòng<br /> Quân đội cung cấp (hợp tác nghiên cứu<br /> giữa Học viện Quân y và Cục Quân y).<br /> Phân lập các chủng VK này từ BN và đất<br /> nơi gia súc chết bị bệnh than, định danh<br /> bằng thanh API50CH, PCR xác định gen<br /> đặc trưng của VK than, thử nghiệm trên<br /> động vật thí nghiệm (chuột nhắt trắng) để<br /> khảo sát khả năng gây chết hàng loạt.<br /> Tiến hành tách chiết ADN genome theo<br /> quy trình của nhà sản xuất (ADN genome<br /> QIAGen minikit) sau khi bất hoạt chủng ở<br /> điều kiện 121oC/20 phút.<br /> 2. PCR.<br /> Dựa trên trình tự gen pagA của các<br /> chủng VK than đã được công bố trên<br /> Ngân hàng gen (CP007665, AE011190,<br /> CP001216...), chúng tôi thiết kế cặp mồi<br /> đặc hiệu (bảng 1) nhằm nhân toàn bộ gen<br /> pagA và đặt tổng hợp bởi IDT (Mỹ). Thiết<br /> kế cặp mồi tách dòng gen pagA ở hai đầu<br /> vùng nối là đầu 5’ và đầu 3’ của gen<br /> pagA, cách trình tự start codon và stop<br /> 137<br /> <br /> codon khoảng > 20 nucleotid đảm bảo<br /> nhân trọn vẹn gen này. Thực hiện phản<br /> ứng PCR high fidelity trên máy PCR<br /> Eppendorf Master proS (Đức), sử dụng<br /> hóa chất PCR high fidelity (Thermo<br /> scientific). Phản ứng PCR 20 l gồm các<br /> thành phần: Phusion Master Mix 1X với<br /> HF Buffer (F-531S Thermo scientific);<br /> 0,25 M mồi xuôi, mồi ngược; ~ 10 ng<br /> ADN khuôn; điều chỉnh H2O đủ thể tích<br /> 20 l. Chu trình nhiệt: biến tính 98oC<br /> trong 30 giây, khuếch đại 30 chu kỳ<br /> (98oC, 8 giây; 42oC, 20 giây; 72oC, 50<br /> giây), sau đó hoàn thành kéo dài chuỗi ở<br /> 72ºC trong 6 phút. Sản phẩm PCR được<br /> điện di kiểm tra trên gel agarose 1,2%<br /> TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide, tiến<br /> hành tinh sạch bằng kit GeneJet PCR<br /> purification (#K0701 Thermo scientific),<br /> điện di kiểm tra và định lượng bằng<br /> Nanodrop.<br /> 3. Tách dòng gen pagA.<br /> Tiến hành nối ghép trực tiếp sản phẩm<br /> PCR tinh sạch gen pagA với vector tách<br /> dòng pJET1.2/blunt nhờ T4-ligase<br /> (Thermo scientific). Sản phẩm nối ghép<br /> được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli<br /> DH5 (One Shot Max Efficiency DH5 Invitrogen) bằng phương pháp sốc nhiệt<br /> (42oC trong 45 giây) để tiến hành chọn<br /> lọc dòng tế bào mang vector chứa gen<br /> mong muốn. Tiến hành cắt kiểm tra<br /> plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc bằng<br /> enzym hạn chế BglII và cặp enzym hạn<br /> chế XbaI và EcoRI (FastDigest - Thermo<br /> scientific).<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> Bảng 1: Các mồi sử dụng trong nghiên cứu.<br /> TÊN MỒI<br /> <br /> MỤC ĐÍCH<br /> <br /> TRÌNH TỰ (5’-3’)<br /> <br /> KÍCH THƯỚC<br /> SẢN PHẨM (bp)<br /> <br /> pagAF/ BamHI<br /> <br /> PCR<br /> <br /> CGAGGATCCAAAGGAGAACGTATATGAA<br /> <br /> 2323<br /> <br /> pagAR/XhoI<br /> <br /> PCR<br /> <br /> CA CTCGAG CACCTAGAATTACCTTATC<br /> <br /> 2323<br /> <br /> pJET1.2_F<br /> <br /> Giải trình tự<br /> <br /> CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC<br /> <br /> -<br /> <br /> pagA_F1<br /> <br /> Giải trình tự<br /> <br /> CAACGAGAAAATCCTACTGA<br /> <br /> -<br /> <br /> pagA_F2<br /> <br /> Giải trình tự<br /> <br /> GATCAATCCACACAGAATAC<br /> <br /> -<br /> <br /> pagA_F3<br /> <br /> Giải trình tự<br /> <br /> TGGAAGAGTGAGGGTGGA<br /> <br /> -<br /> <br /> pJET1.2_R<br /> <br /> Giải trình tự<br /> <br /> AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG<br /> <br /> -<br /> <br /> 4. Giải trình tự gen pagA.<br /> Sau khi kiểm tra chính xác gen pagA trong vector tách dòng pJET1.2/blunt, các<br /> plasmid tái tổ hợp mang gen pagA được giải trình tự theo nguyên lý Sanger trên máy<br /> ABI 3730XL, sử dụng các mồi giải trình tự theo thiết kế (bảng 1), sử dụng phần mềm<br /> Bioedit và Geneious R7 để xử lý, nối ghép tạo trình tự toàn bộ gen pagA, so sánh và<br /> phân tích trình tự thu được với trình tự tham chiếu trên Ngân hàng Gen.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Khuếch đại gen pagA từ các chủng VK than có độc lực.<br /> Theo tính toán, nếu như nhân thành công toàn bộ gen pagA với cặp mồi đã thiết kế,<br /> sản phẩm PCR sẽ cho band ADN có kích thước 2.323 bp. Enzym sử dụng cho phản<br /> ứng khuếch đại gen pagA là Phusion High-Fidelity ADN polymerase. Đây là enzym có<br /> hiệu suất khuếch đại lớn, ngay cả trên những mẫu khuôn dài với độ chính xác và tốc<br /> độ cao.<br /> <br /> Hình 1: Kết quả kiểm tra sản phẩm tổng<br /> hợp gen pagA trên gel agarose 1,2%.<br /> M: Thang ADN chuẩn 1 kb (Thermo<br /> Scientific); 1: Sản phẩm PCR của chủng<br /> B. anthracis VCM1168.<br /> <br /> Sản phẩm khuếch đại gen pagA từ chủng VK than VCM1168 bằng cặp mồi<br /> pagAF/BamHI và pagAR/XhoI là 1 band rõ nét, đặc hiệu có kích thước tương đương<br /> với kích thước mong muốn. Do đó, sản phẩm PCR được tinh sạch chuẩn bị cho các<br /> bước tiếp theo.<br /> 138<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> 2. Tách dòng toàn bộ gen pagA.<br /> Tiến hành phản ứng nối ghép trực tiếp<br /> sản phẩm PCR gen pagA sau tinh sạch<br /> với vector pJET1.2/blunt, biến nạp vào tế<br /> bào E. coli DH5α. Để kiểm tra sự có mặt<br /> của gen pagA trong plasmid tái tổ hợp<br /> (được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc),<br /> chúng tôi tiến hành cắt kiểm tra bằng<br /> enzym hạn chế là cặp enzym XbaI và<br /> EcoRI cùng với enzym BglII.<br /> Với cặp enzym XbaI và EcoRI, một<br /> trình tự nhận biết của XbaI được sử dụng<br /> <br /> là điểm cắt nằm trên vùng đa điểm cắt và<br /> một vị trí cắt của enzym EcoRI nằm trong<br /> trình tự của gen pagA. Còn với enzym<br /> hạn chế BglII, 2 vị trí cắt của enzym này<br /> nằm trên vùng đa điểm cắt, ở 2 đầu của<br /> đoạn gen cài xen vào. Dựa vào tính toán<br /> lý thuyết, đã chọn được các dòng tế bào<br /> mang plasmid chứa gen pagA cho sản<br /> phẩm cắt có kích thước khoảng 4,0 và<br /> 1,2 kb, được cắt kiểm tra bằng cặp<br /> enzym XbaI và EcoRI. Đối với enzym<br /> BglII là khoảng 2,8 và 2,4 kb.<br /> <br /> Hình 2: Kết quả cắt kiểm tra ADN plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên gel<br /> agarose 1,2%.<br /> M: Thang ADN 1 kb (Thermo Scientific); 1 - 4: Sản phẩm cắt bằng cặp enzym hạn chế XbaI và<br /> EcoRI với các dòng khuẩn lạc 1 - 4; 5 - 7: Sản phẩm cắt bằng enzym hạn chế BglII với các<br /> dòng khuẩn lạc 1, 2, 4 (chủng B. anthracis VCM1168)<br /> <br /> Với cặp enzym hạn chế XbaI và<br /> EcoRI, đường chạy số 2, 4 là 2 dòng<br /> plasmid tái tổ hợp có mang gen ngoại<br /> lai. Sản phẩm cắt bao gồm 2 band ADN<br /> có kích thước tương đương tính toán lý<br /> thuyết. Còn với enzym hạn chế BglII,<br /> đường chạy số 6, 7 là 2 dòng plasmid<br /> tái tổ hợp có mang gen ngoại lai. Sản<br /> phẩm cắt gồm 2 band ADN có kích<br /> thước đúng như tính toán là: 2,8 và 2,4<br /> 139<br /> <br /> kb. Với kết quả này, có thể khẳng định:<br /> đã tách dòng thành công toàn bộ gen<br /> pagA của 3 chủng VK than là<br /> VCM1168, 4NS và 1C3 trong vector<br /> tách dòng pJet1.2/blunt. Chúng tôi đặt<br /> tên cho vector tách dòng chứa toàn bộ<br /> gen pagA này là pJET1-pagA1, pJET1pagA2, pJET1-pagA3, tương ứng với 3<br /> chủng nghiên cứu là B. anthracis<br /> VCM1168, 4NS và 1C3.<br /> <br />