Nghiên cứu trình tự đoạn DNA chỉ thị trên gen ribosome 18s của một số loài hải miên tại khu bảo tồn biển đảo Cồn Cỏ, tỉnh Quảng Trị

TAP CHI SINH HOC 2014, 36(1): 65-72<br /> Nghiên DOI:<br /> cứu trình<br /> tự ñoạn DNA chỉ thị<br /> 10.15625/0866-7160/v36n1.4519<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ ĐOẠN DNA CHỈ THỊ TRÊN GEN RIBOSOME 18S<br /> CỦA MỘT SỐ LOÀI HẢI MIÊN (Porifera: Demospongiae) TẠI KHU BẢO TỒN<br /> BIỂN ĐẢO CỒN CỎ, TỈNH QUẢNG TRỊ<br /> Trần Mỹ Linh1*, Nguyễn Chi Mai2, Lê Quang Trung2, Vũ Hương Giang1, Lê Quỳnh Liên1,<br /> Lê Thành Long2, Phan Minh Tuấn2, Nguyễn Tường Vân3, Ninh Khắc Bản1<br /> 1<br /> <br /> Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *tmlinh@imbc.vast.vn<br /> 2<br /> Trung tâm Phát triển công nghệ cao, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam<br /> 3<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam<br /> <br /> TÓM TẮT: Rất ít công trình nghiên cứu về hải miên ở vùng biển Việt Nam liên quan tới thành<br /> phần loài, phân bố và tiềm năng sử dụng, ñặc biệt, chưa có nghiên cứu nào ở mức ñộ sinh học phân<br /> tử. Các chỉ thị phân tử như gen ribosome 18S và 28S ñã ñược lựa chọn ñể phân tích sự phát sinh<br /> chủng loại, phân loại và ña dạng sinh học của hải miên. Trong nghiên cứu này, ñoạn DNA kích<br /> thước 559-561 bp trên gen ribosome 18S ñược phân lập từ 6 mẫu hải miên Biemna variantia,<br /> Niphates sp., Erylus sp., Mycale laevis, Dictyonella pelligera và Hyrtios erectus thu thập tại khu<br /> bảo tồn biển Đảo Cồn Cỏ. Kết quả phân tích trình tự nucleotide của các ñoạn rDNA 18S cho thấy 6<br /> mẫu hải miên có ñộ tương ñồng từ 88,2-96,8% và từ 99,3-100% giữa mẫu hải miên với trình tự<br /> thuộc loài tương ứng ñã ñăng ký trên Ngân hàng Gen quốc tế, ñồng thời thể hiện sự ña hình<br /> nucleotide giữa các loài nghiên cứu với 96 ñiểm sai khác.<br /> Từ khóa: Hải miên, chỉ thị phân tử, rDNA 18S, ñảo Cồn Cỏ.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> Ngành ñộng vật Thân lỗ (Porifera), hay<br /> thường gọi là hải miên, là một trong những loài<br /> ñộng vật biển có sự ña dạng cao [12]. Hải miên<br /> cũng là nhóm sinh vật biển rất có giá trị do chứa<br /> nhiều hợp chất mới mang các hoạt tính sinh học<br /> liên quan tới y-dược như hoạt tính kháng sinh,<br /> ức chế thần kinh hay miễn dịch, giảm ñau,<br /> kháng u và kháng virus [4]. Van et al. (2013)<br /> [12] ñã ghi nhận khoảng hơn 8.400 loài hải<br /> miên, chia thành 4 lớp, trong ñó, lớp<br /> Demospongiae (Sollas, 1885) là lớp ña dạng<br /> nhất, chiếm tới 80% số loài hải miên ñược biết<br /> cho tới nay.<br /> Phần lớn hệ thống phân loại hải miên ñược<br /> xây dựng dựa vào ñặc ñiểm hình thái bộ khung<br /> skeleton trên cơ sở các công trình ñược xuất bản<br /> từ những thế kỷ trước [6]. Tuy nhiên, do hải<br /> miên có cấu trúc ñơn giản nhưng rất ña dạng,<br /> thậm chí một loài có thể có nhiều dạng hình thái<br /> tùy theo môi trường sống, vì vậy, việc ñịnh loại<br /> theo hình thái vẫn gặp nhiều khó khăn. Gần ñây,<br /> các nhà khoa học ñã kết hợp các ñặc ñiểm sinh<br /> học khác vào hệ thống phân loại hải miên như<br /> ñặc ñiểm sinh học phân tử, hóa sinh... trong ñó,<br /> <br /> các chỉ thị sinh học phân tử (DNA markers) ñã<br /> ñược sử dụng ở các mức ñộ khác nhau ñể tìm<br /> hiểu quá trình phát sinh chủng loại, nghiên cứu<br /> mối quan hệ trong và giữa các loài. Chỉ thị phân<br /> tử ñã có nhiều ñóng góp quan trọng trong việc<br /> phát hiện những loài mới, loài khó phân biệt về<br /> hình thái cũng như làm sáng tỏ mối quan hệ<br /> chủng loại của hải miên [11]. Nhìn chung, có ba<br /> nhóm chỉ thị phân tử như sau: i) trình tự trên<br /> ribosome DNA: 18S, 28S, vùng nối thứ nhất và<br /> thứ hai: ITS-1 và ITS-2 (internal transcribed<br /> spacer) giữa các gen 18S; 5,8 S và 28S rRNA;<br /> ii) trình tự DNA ty thể gồm gen COI<br /> (cytochrome oxidase subunit I) và toàn bộ hệ<br /> gen ti thể và iii) trình tự các gen giữ nhà<br /> (nuclear housekeeping genes) [8, 9].<br /> Những nghiên cứu về hải miên ở biển Việt<br /> Nam còn rất ít. Cho ñến nay, chỉ có một số công<br /> trình mô tả về thành phần loài hải miên khảo sát<br /> tại khu vực biển, ñảo thuộc vịnh Hạ Long và<br /> vịnh Nha Trang [1-3]. Hooper et al. (2000) [5]<br /> ñã xác ñịnh có khoảng 161 loài hải miên ở bờ<br /> biển của Việt Nam, trong ñó, có 106 loài ñược<br /> xác ñịnh tên khoa học ở mức ñộ loài. Dựa trên<br /> cơ sở các tài liệu ñã công bố từ năm 1952 ñến<br /> nay, Thai Minh Quang (2013) [7] ñã thống kê<br /> 65<br /> <br /> Tran My Linh et al.<br /> <br /> tổng cộng 299 loài hải miên thuộc 124 giống,<br /> 65 họ, 18 bộ và 4 lớp ñược ghi nhận có mặt tại<br /> Việt Nam, chủ yếu khảo sát ở khu vực biển vịnh<br /> Hạ Long và vịnh Nha Trang. Lớp<br /> Demospongiae chiếm 94% với 281 loài thuộc<br /> 46 họ, 12 bộ, trong ñó 181 loài ñược ñịnh tên<br /> khoa học ở mức ñộ loài [7].<br /> Vùng biển xung quanh Đảo Cồn Cỏ (tỉnh<br /> Quảng Trị), với hệ sinh thái ñiển hình của vùng<br /> biển nhiệt ñới với các rạn san hô ñược ñánh giá<br /> là một trong những vùng có mức ñộ ña sinh học<br /> cao của Việt Nam. Trong nghiên cứu này, 6 loài<br /> hải miên phân tích ñã ñược thu thập ở khu vực<br /> biển Đảo Cồn Cỏ, xác ñịnh thuộc 6 giống (họ),<br /> 5 bộ và ñều thuộc lớp Demospongiae. Đoạn<br /> DNA trên gen ribosome 18S (rDNA18S) của 6<br /> mẫu hải miên ñược phân lập, xác ñịnh trình tự<br /> nucleotide và so sánh mức ñộ ña hình. Đây cũng<br /> là nghiên cứu ñầu tiên về sinh học phân tử ñối<br /> với hải miên tại khu vực biển ñảo Cồn Cỏ và ở<br /> Việt Nam. Kết quả nghiên cứu góp phần ñánh<br /> <br /> giá ña dạng sinh học hải miên tại khu biển Đảo<br /> Cồn Cỏ và tạo cơ sở ñể ñịnh loại hải miên bằng<br /> chỉ thị phân tử tại Việt Nam.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Mẫu hải miên nghiên cứu<br /> Các mẫu hải miên ñược thu thập sử dụng hệ<br /> thiết bị lặn SCUBA ở ñộ sâu từ 5-8 m vào tháng<br /> 5/2012 tại khu bảo tồn biển Đảo Cồn Cỏ, tỉnh<br /> Quảng Trị. Các mẫu nghiên cứu ñược các<br /> chuyên gia thuộc Viện Tài nguyên và Môi<br /> trường biển, Viện Hải dương học Nha Trang,<br /> Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam<br /> xác ñịnh tên khoa học dựa vào phân tích hình<br /> thái; các tiêu bản ñược lưu giữ tại Viện Hóa sinh<br /> biển, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam. Danh<br /> sách các mẫu nghiên cứu và tọa ñộ nơi khảo sát<br /> thu mẫu ñược liệt kê ở bảng 1. Các mẫu ñược rửa<br /> sạch với nước cất và bảo quản trong ñá lạnh trên<br /> tàu, sau ñó bảo quản lâu dài ở -80oC.<br /> <br /> Bảng 1. Danh sách mẫu hải miên nghiên cứu và tọa ñộ thu mẫu<br /> STT<br /> Tọa ñộ thu mẫu<br /> Tên và ký hiệu mẫu<br /> 1<br /> 17°09'07"N-107°19'35"E<br /> Mycale laevis (CC12), Erylus formolus (CC48)<br /> 2<br /> 17°09'29"N-107°20'53"E<br /> Biemna sp. (CC13)<br /> Hyrtios eretus (CC34), Niphates sp. (CC46),<br /> 3<br /> 17°09'04"N-107°20'39"E<br /> Dictyonella pelligera (CC40)<br /> Phương pháp tách chiết DNA<br /> Phương pháp tách chiết DNA ñược tiến<br /> hành theo Tran et al. (2013) [10]. Chất lượng<br /> DNA tổng số ñược kiểm tra bằng ñiện di trên<br /> gel agarose 0,8%.<br /> Phương pháp nhân bản ñoạn DNA ñích và<br /> xác ñịnh trình tự DNA<br /> Nhân bản vùng DNA ñích trên 18S rDNA<br /> bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi thiết kế trên cơ<br /> sở trình tự 18S rDNA của các loài nghiên cứu<br /> ñã ñược ñăng ký trên ngân hàng Gen quốc tế.<br /> Thành phần phản ứng PCR như sau: 2 µl (ca.<br /> 10-20 ng) DNA tổng số; 2,5 mM MgCl2, 1 mM<br /> dNTPs, 10 pmol mồi mỗi loại và 1 Unit Taq<br /> DNA polymerase, tổng thể tích 25 µl. Chu kỳ<br /> nhiệt: 94°C/3 phút; 30 chu kỳ (94°C/30 giây,<br /> 55°C/30 giây và 72°C/1 phút); 72°C/8 phút. Sản<br /> phẩm PCR ñược ñiện di kiểm tra trên gel<br /> <br /> 66<br /> <br /> agarose 1,5%, tinh sạch sử dụng QIAquick PCR<br /> Purification Kit (Qiagen, CHLB Đức) và ñược<br /> xác ñịnh trình tự hai chiều xuôi/ngược<br /> (Macrogen Inc., Hàn Quốc).<br /> Phân tích trình tự<br /> Các trình tự ñoạn DNA nghiên cứu ñược<br /> phân tích và so sánh với các trình tự rDNA 18S<br /> của hải miên ñã công bố trên ngân hàng gen<br /> quốc tế (GenBank) bằng công cụ BLAST, xác<br /> ñịnh mức ñộ tương ñồng (%) bằng phần mềm<br /> Lasergene 7.0 và DNAMAN 4.1.5 (Lynnon<br /> BioSoft, Hoa Kỳ).<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Phân lập và xác ñịnh trình tự ñoạn DNA trên<br /> gen ribosome 18S của các mẫu hải miên<br /> nghiên cứu<br /> Dựa vào cơ sở dữ liệu về trình tự nucleotide<br /> trên GenBank, cặp mồi 18S-F (5’-GGCAGC<br /> <br /> Nghiên cứu trình tự ñoạn DNA chỉ thị<br /> <br /> AGGCGCGCAAATTAC-3’)/18S-R (5’-AACT<br /> TTCGTTCTTGATTAAT G-3’) ñã ñược thiết<br /> kế ñặc hiệu ñể nhân bản ñoạn DNA có kích<br /> thước khoảng 560 bp trên gen ribosome 18S ở<br /> hải miên. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR cho<br /> thấy, các băng DNA ñều có ñộ ñặc hiệu và có<br /> kích thước khoảng hơn 500 bp, tương tự như<br /> tính toán lý thuyết (hình 1). Như vậy, các ñoạn<br /> DNA ñích trên gen ribosome 18S của 6 mẫu hải<br /> miên ñã ñược nhân bản thành công. Sau khi tinh<br /> sạch và xác ñịnh trình tự nucleotide, các ñoạn<br /> DNA nhân bản có kích thước 559 bp hoặc 561<br /> bp và có ñộ tương ñồng từ 88,2% ñến 96,8%<br /> (bảng 2).<br /> <br /> Hình 1. Kết quả ñiện di sản phẩm nhân bản ñoạn<br /> rDNA 18S từ các mẫu hải miên nghiên cứu<br /> <br /> Bảng 2. Mức ñộ tương ñồng (%) giữa trình tự nucleotide của các ñoạn rDNA 18S phân lập từ 6<br /> mẫu hải miên nghiên cứu và các trình tự tham khảo tương ứng<br /> Trình<br /> tự<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> 11<br /> 12<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> 11<br /> <br /> 12<br /> <br /> 99,8<br /> 96,2<br /> 96,2<br /> 95,7<br /> 96,1<br /> 92,5<br /> 92,5<br /> 93,2<br /> 93,6<br /> 88,9<br /> 88,2<br /> <br /> 96,1<br /> 96,1<br /> 95,5<br /> 95,9<br /> 92,3<br /> 92,3<br /> 93,0<br /> 93,4<br /> 88,9<br /> 88,2<br /> <br /> 100<br /> 96,8<br /> 96,6<br /> 93,6<br /> 93,6<br /> 95,3<br /> 95,7<br /> 90,0<br /> 89,3<br /> <br /> 96,8<br /> 96,6<br /> 93,6<br /> 93,6<br /> 95,3<br /> 95,7<br /> 90,0<br /> 89,3<br /> <br /> 99,6<br /> 91,6<br /> 91,6<br /> 93,9<br /> 94,3<br /> 89,8<br /> 89,1<br /> <br /> 91,9<br /> 91,9<br /> 93,9<br /> 94,3<br /> 89,8<br /> 89,1<br /> <br /> 100<br /> 93,4<br /> 93,4<br /> 90,7<br /> 90,0<br /> <br /> 93,4<br /> 93,4<br /> 90,7<br /> 90,0<br /> <br /> 99,6<br /> 89,3<br /> 88,6<br /> <br /> 89,3<br /> 88,6<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> Ghi chú: 1. Biemna variantia C13; 2. Biemna variantia KC901961; 3. Dictyonella pelligera CC40;<br /> 4. Dictyonella pelligera GQ466057; 5. Erylus sp. CC48; 6. Erylus formosus KC902118; 7. Hyrtios<br /> erectus CC34; 8. Hyrtios erectus KC902209; 9. Mycale laevis CC12; 10. Mycale laevis HQ709350;<br /> 11. Niphates cf. erecta KC902280; 12. Niphates sp. CC46.<br /> Phân tích trình tự ñoạn DNA nghiên cứu và<br /> các trình tự tương ứng trên Ngân hàng Gen<br /> quốc tế (GenBank)<br /> Phân tích trình tự nucleotide của ñoạn<br /> rDNA 18S phân lập từ các loài hải miên<br /> nghiên cứu cho thấy các trình tự có ñộ tương<br /> ñồng cao với trình tự tương ứng của các loài<br /> hải miên ñã ñược công bố trên Genbank (99,3-<br /> <br /> 100%), ñiều này khẳng ñịnh sự phù hợp<br /> giữa phân tích hình thái và phân tích chỉ thị<br /> phân tử là trình tự DNA trên gen ribosome 18S<br /> (bảng 2). Tổng cộng có 96 ñiểm ña hình giữa 6<br /> giống Erylus, Hyrtios, Mycale, Biemna,<br /> Niphates và Dictyonella, trong ñó, có 2 ñột<br /> biến thêm hoặc bớt nucleotide và 94 ñột biến<br /> thay thế (hình 2).<br /> <br /> 67<br /> <br /> Tran My Linh et al.<br /> <br /> Hình 2. Kết quả phân tích ña hình trình tự nucleotide của các ñoạn rDNA 18S<br /> phân lập từ các mẫu hải miên nghiên cứu với trình tự tương ứng<br /> công bố trên GenBank (tên loài và mã số trình tự kèm theo)<br /> 68<br /> <br /> Nghiên cứu trình tự ñoạn DNA chỉ thị<br /> <br /> Bảng 3. Danh sách các trình tự tham khảo trên ngân hàng GenBank<br /> STT<br /> Tên loài<br /> 1<br /> Acanthella cavernosa<br /> 2<br /> Acanthostrongylophora ingens<br /> 3<br /> Axinella rugosa<br /> 4<br /> Biemna fistulosa<br /> 5<br /> Biemna variantia<br /> 6<br /> Corallistes sp.<br /> 7<br /> Dictyonella pelligera<br /> 8<br /> Erylus formosus<br /> 9<br /> Hyrtios erectus<br /> 10<br /> Mycale alagoana<br /> 11<br /> Mycale laevis<br /> 12<br /> Neofibularia hartmani<br /> 13<br /> Neophrissospongia microstylifera<br /> 14<br /> Niphates cf. erecta<br /> 15<br /> Niphates sp.<br /> 16<br /> Petrosia sp.<br /> 17<br /> Phakellia ventilabrum<br /> 18<br /> Rhabdastrella globostellata<br /> 19<br /> Sigmaxinella sp.<br /> 20<br /> Stryphnus ponderosus<br /> 21<br /> Thorectidae sp.<br /> 22<br /> Topsentia sp.<br /> Đối với giống Mycale, ña hình trình tự của<br /> ñoạn rDNA 18S từ các loài ñã công bố thuộc<br /> giống này ñược phản ánh ở các ñiểm sai khác<br /> ñặc trưng ở mức ñộ giống và mức ñộ loài khi so<br /> sánh trình tự rDNA 18S phân lập ñược từ mẫu<br /> Mycale laevis (CC12) với 34 trình tự tương ứng<br /> phân lập từ các loài thuộc giống Mycale<br /> (Genbank). Đoạn trình tự rDNA 18S phân lập<br /> từ mẫu Mycale laevis (CC12) và trình tự tương<br /> ứng ở loài Mycale alagoana có sai khác ở vị trí<br /> nucleotide 103 (T-C) so với các loài khác trong<br /> giống Mycale và các giống khác. Trình tự của<br /> giống Mycale có 7 ñiểm sai khác ñặc trưng so<br /> với các giống Erylus, Hyrtios, Biemna,<br /> Niphates, Dictyonelia tại các vị trí 232, 249,<br /> 280, 407, 408, 422 và 511 (hình 2). Xét về ñộ<br /> tương ñồng trình tự nucleotide, mẫu Mycale<br /> laevis (CC12) gần gũi nhất với loài Mycale<br /> laevis HQ709350, với 2 ñiểm ñột biến thay thế<br /> tại các vị trí 272 (T-C) và 365 (T-C), trong ñó<br /> ñột biến thay thế ở vị trí 272 tương tự ở<br /> Mycale sp. (KC762712), vị trí 365 tương tự ở<br /> giống Hyrtios và giống Niphates. Ngoài các<br /> ñiểm ña hình ñặc trưng theo từng giống và loài,<br /> <br /> Mã số trên GenBank<br /> KC902194<br /> DQ927318<br /> KC902233<br /> FR819688<br /> KC901961<br /> AY737636<br /> GQ466057<br /> KC902118<br /> KC902209<br /> KC902177<br /> HQ709350<br /> KC901997<br /> KC902026<br /> KC902280<br /> DQ927312<br /> DQ927320<br /> KC901915<br /> KC902160<br /> KC902208<br /> KC902126<br /> KC902294<br /> KC902339<br /> <br /> các ñiểm ñột biến khác xuất hiện ở trình tự của<br /> các mẫu phân lập ñược cho thấy có sự ña dạng<br /> sinh học của loài hải miên theo vùng ñịa lý phân<br /> bố. Loài Hyrtios erectus (CC34) có trình tự gen<br /> 18S phân lập ñược tương ñồng 100% so với các<br /> loài Hyrtios erectus (KC902209), Hyrtios altus<br /> (KC902007), Fasciospongia sp. (KC901964) và<br /> Thorectidae sp. (KC902294) trong cùng họ<br /> Thorectidae. Tương tự, trình tự phân lập từ loài<br /> Dictyonella pelligera (CC40) tương ñồng 100%<br /> so với các loài Dictyonella pelligera<br /> (GQ466057), Axinella rugosa (KC902233),<br /> Acanthella cavernosa (KC902194), Phakellia<br /> ventilabrum (KC901915) trong cùng họ<br /> Dictyonellidae, ñiều này cho thấy, ñoạn rDNA<br /> 18S nghiên cứu có ñộ bảo thủ cao giữa các<br /> giống thuộc họ này. Các loài thuộc giống<br /> Hyrtios có 8 ñiểm sai khác ñặc trưng so với các<br /> giống Erylus, Mycale, Biemna, Niphates,<br /> Dictyonelia tại các vị trí 74, 215, 229, 281, 296,<br /> 359, 412 và 443 (hình 2). Tương tự, các trình tự<br /> thuộc giống Biemna có 7 ñiểm sai khác ñặc<br /> trưng so với các giống còn lại ở vị trí 69, 229,<br /> 233, 317, 339, 392 và 393. Trong 6 mẫu nghiên<br /> 69<br /> <br />