Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn tính dự kiến ghép thận

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019<br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẤP PHỤ MIỄN DỊCH<br /> VI HẠT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ<br /> KHÁNG HLA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN SUY THẬN<br /> MẠN TÍNH DỰ KIẾN GHÉP THẬN<br /> <br /> Đỗ Khắc Đại1; Nguyễn Ngọc Tuấn1<br /> Hoàng Trung Kiên1; Nguyễn Đặng Dũng1<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân nhận thận<br /> ghép bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang và đánh giá hiệu quả định<br /> danh kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn dự kiến ghép thận bằng<br /> kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang. Đối tượng và phương pháp: sử dụng<br /> 2 bộ kít sàng lọc và định danh kháng thể kháng HLA trên 55 mẫu huyết thanh được thu thập từ<br /> 55 bệnh nhân suy thận và phân tích bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh<br /> quang trên hệ thống Luminex 200 tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y. Kết quả: 27/55 mẫu<br /> huyết thanh (49,09%) có kháng thể kháng HLA dương tính, trong đó dương tính với lớp I + lớp<br /> II chiếm tỷ lệ cao nhất (44.44%). Định danh được 17 loại kháng thể kháng HLA-A; 31 loại kháng<br /> thể kháng HLA-B và 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II. Kết luận: đã ứng dụng thành công kỹ<br /> thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang trong xét nghiệm sàng lọc và định danh<br /> kháng thể kháng HLA trong huyết thanh của bệnh nhân suy thận mạn tính dự kiến ghép thận.<br /> * Từ khoá: Suy thận mạn tính (dự kiến ghép thận); Phát hiện kháng thể kháng HLA; Kỹ thuật<br /> hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang.<br /> <br /> <br /> Application of Fluorescence Covalent Microbead Immunosorbent<br /> Assay in Detection of Anti-HLA Antibodies in Recipient Candidates<br /> for Kidney Transplant<br /> Summary<br /> Objectives: Anti-HLA antibodies in serum of kidney transplant recipients may significantly be<br /> involved in antibody-mediated graft rejection. Identification of the antibodies before kidney<br /> transplant in these patients, therefore, helps clinicians to better manage the patients both<br /> pre-and post-transplant. The aims of the present study are to screen and to identify anti-HLA<br /> antibodies in serum of recipient candidates for kidney transplant at 103 Military Hospital.<br /> Subjects and methods: A fluorescence covalent microbead immunosorbent assay test kit, along<br /> with Luminex 200 analyzer, were adopted in the study which allowed screening and identifying<br /> anti-HLA antibodies present in 55 serum samples from 55 recipient candidates for kidney transplant.<br /> <br /> 1. Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 21/12/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/01/2019<br /> Ngày bài báo được đăng: 28/02/2019.<br /> <br /> 5<br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019<br /> <br /> Results: 27 (out of 55) serum samples (49.09%) were reactive to anti-HLA antibodies; samples<br /> simultaneously reactive to anti-HLA class I and class II accounted for 44.4% of total number<br /> of reactive samples. HLA class I antibodies identified include 17 anti-HLA-A and 31 anti-HLA-B;<br /> for HLA class II antibodies, 22 anti-HLA-DR antibodies were identified. Conclusions: Fluorescence<br /> covalent microbead immunosorbent assay with Luminex 200 analyzer were effective in screening<br /> and identification of anti-HLA antibodies in kidney transplant recipients.<br /> * Keywords: Kidney transplant; Recipient candidates for kidney transplant; Anti-HLA antibody;<br /> Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay.<br /> <br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ quang (FCMIA). Trong đó, kỹ thuật FCMIA<br /> là kỹ thuật mới với nhiều ưu điểm nổi bật<br /> Kể từ khi ca ghép thận đầu tiên trên<br /> như có độ nhạy và độ chính xác cao trong<br /> thế giới thành công năm 1954, ghép thận<br /> việc phát hiện kháng thể kháng lại kháng<br /> đã trở thành phương pháp điều trị tối ưu<br /> nguyên HLA so với kỹ thuật CDC và ELISA.<br /> nhất đối với bệnh nhân (BN) suy thận<br /> Tại Học viện Quân y, việc triển khai<br /> mạn (STM) giai đoạn cuối. Tại Việt Nam,<br /> thành công kỹ thuật này có ý nghĩa thực<br /> ca ghép thận đầu tiên được thực hiện<br /> thành công tại Bệnh viện Quân y 103 vào tiễn rất quan trọng, góp phần hạn chế tối<br /> tháng 6 - 1992. Từ đó đến nay, đã có đa phản ứng đào thải mô ghép trong<br /> hàng ngàn BN được ghép thận thành ghép thận, cũng như theo dõi xuất hiện<br /> công tại các trung tâm y tế lớn trên toàn của kháng thể kháng HLA sau ghép<br /> quốc. Một trong những vấn đề quan trọng nhằm nâng cao hiệu quả trong chẩn<br /> nhất trong ghép thận đó là tình trạng đào đoán và điều trị cho BN nhận thận ghép.<br /> thải thận ghép, nguyên nhân do đáp ứng Xuất phát từ những phân tích trên, nhóm<br /> miễn dịch của cơ thể túc chủ chống lại nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm<br /> mô ghép khác gen. Trong đó, phản ứng mục tiêu: Sàng lọc phát hiện kháng thể<br /> đào thải thận ghép tối cấp, cấp tính và kháng HLA trong huyết thanh bằng kỹ<br /> mạn tính qua trung gian kháng thể được thuật FCMIA và hiệu quả định danh<br /> nhiều tác giả công bố [1]. kháng thể kháng HLA ở BN STM tính dự<br /> Nhiều phương pháp xét nghiệm phát kiến ghép thận.<br /> hiện kháng thể kháng - kháng nguyên HLA<br /> trước ghép (xét nghiệm tiền mẫn cảm) ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> được ứng dụng trên lâm sàng nhằm hạn NGHIÊN CỨU<br /> chế phản ứng đào thải thận ghép tối cấp 1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu.<br /> và cấp tính qua trung gian kháng thể như * Đối tượng nghiên cứu: 55 mẫu huyết<br /> kỹ thuật gây độc tế bào phụ thuộc bổ thanh được thu thập từ 55 BN STM tính<br /> thể (CDC); kỹ thuật ELISA và kỹ thuật dự kiến ghép thận và có chỉ định ghép<br /> hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh thận tại Bệnh viện Quân y 103.<br /> <br /> 6<br />  T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019<br /> <br /> * Vật liệu nghiên cứu: * Phương pháp xét nghiệm sàng lọc<br /> - 2 kít xét nghiệm: phát hiện kháng thể kháng HLA bằng kỹ<br /> thuật FCMIA:<br /> + Kít xét nghiệm sàng lọc phát hiện<br /> kháng thể kháng HLA (LMX) (Hãng - Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết thanh<br /> Immucor, Mỹ). + 5 µl hỗn hợp hạt từ mang kháng<br /> nguyên HLA (LMX bead) được lấy từ kít<br /> + Kít xét nghiệm định danh kháng thể<br /> LMX vào các giếng xét nghiệm tương ứng.<br /> kháng HLA (ID1 và ID2) (Hãng Immucor, Mỹ).<br /> - Bước 2: ủ ở nhiệt độ phòng trên máy<br /> - Hoá chất và sinh phẩm xét nghiệm:<br /> lắc 30 phút (trong buồng tối). Sau thời<br /> + Hỗn hợp với số lượng bằng nhau gian ủ tiến hành rửa plate 3 lần bằng<br /> các loại hạt từ khác nhau, mỗi loại hạt từ cách cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào<br /> huỳnh quang được gắn lên bề mặt một mỗi giếng. Hút cạn dịch trong giếng xét<br /> hoặc một số loại kháng nguyên HLA. nghiệm bằng hệ thống bơm hút chuyên<br /> dụng.<br /> + Hỗn hợp kháng thể phát hiện đã gắn<br /> - Bước 3: tra vào mỗi giếng xét nghiệm<br /> phức hợp huỳnh quang PE.<br /> 50 µl kháng thể phát hiện đã gắn chất<br /> + Dung dịch pha mẫu, dung dịch pha huỳnh quang PE.<br /> sinh phẩm, dung dịch rửa (Hãng Immucor,<br /> - Bước 4: ủ và rửa plate theo chi tiết<br /> Mỹ sản xuất và cung cấp). mô tả tại bước 2.<br /> + Hệ thống Luminex 200 và phần mềm - Bước 5: tra vào mỗi giếng xét nghiệm<br /> điều khiển đi kèm (Hãng Luminex, Mỹ chế 150 µl dung dịch rửa, trộn đều trên máy<br /> tạo và cài đặt). lắc 30 giây.<br /> - Vật liệu và thiết bị labô phụ trợ khác - Bước 6: đọc và phân tích kết quả trên<br /> như máy lắc, máy hút chân không, các loại hệ thống Luminex 200.<br /> pipét, đầu pipét, giấy bạc, giấy thấm, nước * Phương pháp xét nghiệm định danh<br /> cất, ống nghiệm đạt tiêu chuẩn quốc tế kháng thể kháng HLA bằng kỹ thuật<br /> được chính hãng sản xuất cung cấp. FCMIA:<br /> - Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết thanh<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> + 5 µl hỗn hợp hạt từ mang kháng<br /> * Phương pháp tách huyết thanh từ nguyên HLA (ID1 và ID2 bead) được lấy<br /> máu toàn phần: từ kít ID1 và ID2 vào các giếng xét nghiệm<br /> Lấy máu toàn phần số lượng 2 ml cho tương ứng.<br /> vào ống không có chất chống đông, đặt - Bước 2: ủ ở nhiệt độ phòng trên máy<br /> trong tủ ấm 30 phút ở nhiệt độ 370C để co lắc 30 phút (trong buồng tối). Sau thời<br /> cục máu tự nhiên. Ly tâm với tốc độ gian ủ, tiến hành rửa plate 3 lần bằng cách<br /> 2.500 rpm trong 20 phút, hút 0,5 ml dịch cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào mỗi<br /> nổi màu vàng cho vào ống eppendorf loại giếng. Hút cạn dịch trong giếng xét nghiệm<br /> 1,5 ml và tiến hành xét nghiệm ngay. bằng hệ thống bơm hút chuyên dụng.<br /> <br /> 7<br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019<br /> <br /> - Bước 3: tra vào mỗi giếng xét nghiệm dương tính với cả 2 lớp (lớp I + lớp II)<br /> 50 µl kháng thể phát hiện đã gắn chất chiếm tỷ lệ cao nhất (44.44%), cao hơn<br /> huỳnh quang PE. trường hợp chỉ dương tính với 1 lớp. Kết<br /> - Bước 4: ủ và rửa plate theo chi tiết quả này có thể giúp các nhà lâm sàng<br /> mô tả tại bước 2. theo dõi điều trị BN sau ghép thận tốt hơn.<br /> Trường hợp kháng thể kháng HLA dương<br /> - Bước 5: tra vào mỗi giếng xét nghiệm<br /> tính với cả 2 lớp, tiên lượng xấu hơn<br /> 150 µl dung dịch rửa, trộn đều trên máy<br /> dương tính với 1 lớp.<br /> lắc 30 giây.<br /> - Bước 6: đọc và phân tích kết quả trên Bảng 1: Kết quả định danh kháng thể<br /> hệ thống Luminex 200. kháng HLA-A.<br /> Số thứ Kháng thể Tần suất Tỷ lệ<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ tự kháng HLA-A xuất hiện (%)<br /> BÀN LUẬN 1 A*01 6 7,32<br /> * Kết quả sàng lọc phát hiện kháng thể 2 A*02 7 8,54<br /> kháng HLA (n = 55): 3 A*03 6 7,32<br /> Dương tính: 27 BN (49,09%); âm tính: 4 A*11 6 7,32<br /> 28 BN (50,91%). Theo Bùi Văn Mạnh và<br /> 5 A*23 4 4,88<br /> CS (2009), tỷ lệ này là 69,2% [2], của<br /> 6 A*24 2 2,44<br /> Yamamoto và CS (2014) là 39,4% [3].<br /> Kết quả thu được khác nhau phụ thuộc 7 A*25 1 1,23<br /> vào đối tượng nghiên cứu, cỡ mẫu 8 A*26 6 7,32<br /> nghiên cứu. Đặc biệt là phương pháp xét 9 A*29 3 3,66<br /> nghiệm phát hiện kháng thể kháng HLA.<br /> 10 A*30 5 6,10<br /> Bùi Văn Mạnh và CS nghiên cứu trên cỡ<br /> 11 A*31 6 7,32<br /> mẫu nhỏ hơn (n = 39) so với nghiên cứu<br /> của chúng tôi và Yamamoto. Chúng tôi 12 A*32 4 4,88<br /> <br /> nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn (n = 55); 13 A*33 9 10,98<br /> đối tượng nghiên cứu là BN suy thận có 14 A*34 1 1,23<br /> chỉ định ghép thận và sử dụng kỹ thuật 15 A*66 3 3,66<br /> FCMIA để phát hiện kháng thể kháng HLA.<br /> 16 A*68 10 12,20<br /> * Kết quả sàng lọc phát hiện kháng thể<br /> 17 A*74 3 3,66<br /> kháng HLA theo lớp kháng nguyên HLA:<br /> Tổng 82 100<br /> Dương tính với lớp I: 8 BN (29,63%);<br /> dương tính với lớp II: 7 BN (25,93%); Đã định danh được 17 loại kháng thể<br /> dương tính với lớp I + lớp II: 12 BN kháng HLA-A. Trong đó, chiếm tỷ lệ cao<br /> (44,44%). nhất là kháng thể kháng HLA-A*68<br /> Trên các mẫu có kháng thể kháng HLA (12,20%) và thấp nhất là kháng thể kháng<br /> dương tính, nhóm có kháng thể kháng HLA HLA-A*2534 (1,23%).<br /> <br /> 8<br />  T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019<br /> <br /> Bảng 2: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA-B.<br /> Số thứ tự Kháng thể kháng HLA-B Tần suất xuất hiện Tỷ lệ %<br /> 1 B*07 2 2,99<br /> 2 B*08 5 7,46<br /> 3 B*14 6 8,96<br /> 4 B*15 4 5,97<br /> 5 B*27 4 5,97<br /> 6 B*35 4 5,97<br /> 7 B*37 2 2,99<br /> 8 B*38 1 1,49<br /> 9 B*39 1 1,49<br /> 10 B*40 3 4,48<br /> 11 B*41 1 1,49<br /> 12 B*42 2 2,99<br /> 13 B*44 3 4,48<br /> 14 B*45 3 4,48<br /> 15 B*47 1 1,49<br /> 16 B*48 1 1,49<br /> 17 B*49 1 1,49<br /> 18 B*52 1 1,49<br /> 19 B*53 1 1,49<br /> 20 B*54 2 2,99<br /> 21 B*57 2 2,99<br /> 22 B*58 3 4,48<br /> 23 B*62 1 1,49<br /> 24 B*63 1 1,49<br /> 25 B*64 1 1,49<br /> 26 B*65 4 5,96<br /> 27 B*72 1 1,49<br /> 28 B*73 1 1,49<br /> 29 B*77 2 2,99<br /> 30 B*78 2 2,99<br /> 31 B*81 1 1,49<br /> Tổng 67 100<br /> <br /> Đã định danh được 31 loại kháng thể kháng HLA-B. Trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất<br /> là kháng thể kháng HLA-B*14 (8,96%) và B*08 (7,46%).<br /> <br /> 9<br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019<br /> <br /> Nghiên cứu đã phát hiện một số kháng thể kháng lại các kháng nguyên HLA<br /> như A*23, A*25, B*08, B*14… Theo nghiên cứu của Nguyễn Đặng Dũng và CS, những<br /> kháng nguyên trên mẫu tế bào thu nhận từ máu cuống rốn chưa thấy xuất hiện [3],<br /> chứng tỏ trong cộng đồng người Việt vẫn có người mang kháng nguyên này, nhưng để<br /> phát hiện được kháng nguyên hiếm gặp đòi hỏi phải có nghiên cứu với cỡ mẫu lớn<br /> hơn và thực hiện trên nhiều khu vực khác nhau mới có thể đưa ra kết luận chính xác.<br /> Bảng 3: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA lớp II theo phân lớp.<br /> Số TT Kháng thể kháng HLA lớp II Phân lớp Tần suất xuất hiện Tỷ lệ (%)<br /> <br /> 1 B1*01 6 10,71<br /> <br /> 2 B1*03 2 3,57<br /> <br /> 3 B1*04 1 1,79<br /> <br /> 4 B1*07 2 3,57<br /> <br /> 5 B1*08 2 3,57<br /> <br /> 6 DRB1 B1*09 3 5,36<br /> <br /> 7 B1*10 8 14,29<br /> <br /> 8 B1*11 2 3,57<br /> <br /> 9 B1*12 2 3,57<br /> <br /> 10 B1*13 2 3,57<br /> <br /> 11 B1*14 3 5,36<br /> <br /> 12 B1*16 2 3,57<br /> <br /> 13 B3*01 1 1,79<br /> DRB3<br /> 14 B3*02 2 3,57<br /> <br /> 15 B3*03 1 1,79<br /> <br /> 16 DRB4 B4*01 4 7,14<br /> <br /> 17 DRB5 B5*01 3 5,36<br /> <br /> 18 B1*02 3 5,36<br /> <br /> 19 B1*03 3 5,36<br /> DQB1<br /> 20 B1*04 1 1,79<br /> <br /> 21 B1*05 2 3,57<br /> <br /> 22 B1*06 1 1,79<br /> <br /> Tổng 56 100<br /> <br /> Đã định danh được 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II, trong đó chiếm tỷ lệ lớn<br /> nhất là HLA-DRB1*10 (14,29%).<br /> <br /> 10<br />  T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 3-2019<br /> <br /> Bảng 4: Kết quả định danh kháng thể chọn người cho thận phù hợp nhất, góp<br /> kháng HLA lớp II theo các nhóm. phần làm giảm tỷ lệ đào thải thận ghép<br /> trên lâm sàng.<br /> Số Kháng thể Số<br /> Tỷ lệ %<br /> thứ tự kháng HLA lớp II lượng<br /> KẾT LUẬN<br /> 1 DRB1 14 48.28 Nghiên cứu đã ứng dụng thành công<br /> 2 DRB3 2 6.90 kỹ thuật FCMIA trong xét nghiệm sàng lọc<br /> 3 DRB4 4 13.79 và định danh kháng thể kháng HLA trong<br /> 4 DRB5 3 10,35 huyết thanh của BN nhận thận ghép<br /> như sau:<br /> 5 DQB1 6 20,68<br /> - 27/55 BN (49,09%) dương tính với<br /> Tổng 29 100<br /> kháng thể kháng HLA, trong đó dương<br /> Đã định danh được 5 nhóm kháng thể tính với HLA lớp I: 29,63%; lớp II: 25,93%;<br /> kháng HLA lớp II (HLA-DRB1; HLA-DRB3; lớp I và lớp II: 44,44%.<br /> HLA-DRB4; HLA-DRB5 và HLA-DQB1). - Đã định danh được 17 loại kháng thể<br /> Trong đó, chiếm tỷ lệ cao nhất là kháng kháng HLA-A; 31 loại kháng thể kháng<br /> HLA-B và 22 loại kháng thể kháng HLA-DR<br /> thể kháng HLA-DRB1 (48,28%), tiếp theo<br /> và DQ với tần suất xuất hiện cao nhất là<br /> là DQB1 (20,68%) và thấp nhất là kháng<br /> kháng thể kháng HLA-A*68; HLA-B*14 và<br /> thể kháng DRB3 (6,90%).<br /> HLA-DRB1*10.<br /> Bảng 5: Kết quả định danh kháng thể<br /> kháng HLA theo loại kháng thể/mẩu TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> huyết thanh. 1. Hoàng Mạnh An. Những tiến bộ trong<br /> ghép tạng ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học<br /> Loại kháng thể kháng Số Tỷ lệ (%) Công nghệ Việt Nam. 2014, số 8, tr.41-43.<br /> HLA/mẫu huyết thanh lượng<br /> 2. Bùi Văn Mạnh và CS. Nghiên cứu lâm<br /> 1 8 29,62 sàng, cận lâm sàng và một số chỉ số miễn dịch<br /> 2-3 4 14,81 ở BN sau ghép thận. Luận án Tiến sỹ Y học.<br /> Học viện Quân y. 2009.<br /> 4-6 4 14,81<br /> 3. Nguyễn Đặng Dũng và CS. Xây dựng<br /> >6 11 40,76 cơ sở dữ liệu và phần mềm tra cứu HLA của<br /> Tổng 27 100 các mẫu tế bào gốc dây rốn được hiến tặng<br /> cho Ngân hàng Tế bào gốc Mekostem. Tạp chí<br /> Số mẫu huyết thanh có > 6 loại kháng Y - Dược học Quân sự. 2007, số 7, tr.21-28.<br /> thể kháng HLA chiếm tỷ lệ cao nhất 4. Yamamoto H, Uchida N, Matsuno N,<br /> (40,76%). Kết quả này có thể do kỹ thuật Ota H, Kageyama K, Wada et al. Anti-HLA<br /> FCMIA có độ nhạy cao, có thể định danh antibodies other than against HLA-A, -B, -DRB1<br /> adversely affect engraftment and nonrelapse<br /> được nhiều loại kháng thể khác nhau<br /> mortality in HLA-mismatched single cord blood<br /> tương ứng với các allen kháng nguyên đã<br /> transplantation: Possible implications of<br /> biết gắn trên hạt từ huỳnh quang. Do vậy, unrecognized donor-specific anti-bodies.<br /> xét nghiệm tiền mẫn cảm trước ghép Biol Blood Marrow Transplant. 2014, 20 (10),<br /> bằng kỹ thuật FCMIA giúp sàng lọc và lựa pp.1634-1640. doi:10.1016/j bbmt 2014.06.024.<br /> <br /> 11<br />