Nghiên cứu ứng dụng protease ngoại bào của Bacillus subtilis B26 cho quá trình tách chiết chondroitin sulfate từ sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii ) và cá nhám (Carcharhinus sorrah )

Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 1/2013<br /> <br /> KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PROTEASE NGOẠI BÀO CỦA BACILLUS<br /> SUBTILIS B-26 CHO QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT CHONDROITIN SULFATE<br /> TỪ SỤN CÁ ĐUỐI (Dasyatis kuhlii ) VÀ CÁ NHÁM (Carcharhinus sorrah )<br /> EXTRACTION OF CHONDROITIN SULFATE FROM DASYATIS KUHLII AND<br /> CARCHARHINUS SORRAH BY BACILLUS SUBTILIS B-26 PROTEASE APPLICATION<br /> Vũ Thị Thanh Tâm1, Võ Hoài Bắc2<br /> Ngày nhận bài: 13/8/2012; Ngày phản biện thông qua: 26/11/2012; Ngày duyệt đăng: 15/3/2013<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được các điều kiện thủy phân tối ưu của enzym protease ngoại bào từ<br /> chủng Bacillus subtilis B-26 trên cơ chất xương sụn cá: tỷ lệ 0,4ml (0,17 UI/ml) enzym/1g xương sụn cá, thời gian thủy<br /> phân là 12giờ, pH 8,5 và nhiệt độ 500C. Thời gian nuôi cấy chủng B26 cho hoạt tính enzym cao nhất là 72 giờ.<br /> Kết quả so sánh khả năng chiết rút chondroitin sulfate (CS) từ sụn cá nhám và cá đuối của papain, bromelain và<br /> protease ngoại bào từ chủng B26 cho thấy protease ngoại bào từ chủng B26 là nguồn enzym có hoạt tính thủy phân mạnh<br /> như các chế phẩm enzym khác nhưng giá thành rẻ. Nghiên cứu này cũng đánh giá được độ an toàn của chế phẩm protease<br /> trên động vật thực nghiệm. Vì vậy chế phẩm protease ngoại bào từ chủng B26 có thể thay thế papain trong quá trình tách<br /> chiết CS.<br /> Từ khóa: chondroitin sulfate, 1,9-dimethylmethylene blue (DMMB), protease, sụn cá<br /> <br /> ABSTRACT<br /> This study was conducted to evaluate whether chondroitin sulfate could be isolated from cartilage of Vietnam shark<br /> (Carcharhinus sorrah) and ray (Dasyatis kuhlii) by Bacillus subtilis B-26 protease. The optimal conditions of hydrolysing<br /> the cartilage of produced B-26 proteases were 0,4ml (0,17UI/ml) enzym/1 gram of cartilage, 12h, pH 8,5 at 500C.<br /> Incubation time 72h achieved the highest activity of protease for Bacillus subtilis B-26.<br /> Hydrolyzing cartilage of B-26 protease is the same papain and bromelain, but the cost of B-26 protease is cheap.<br /> Bacillus subtilis B-26 protease can replace papain for hydrolyzing cartilage of shark and ray.<br /> Key words: cartilage of shark and ray, chondroitin sulfate, 1,9-dimethylmethylene blue (DMMB), protease<br /> <br /> I.ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Chondroitin sulfate thường gắn với các protein<br /> bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan<br /> (PG). Phân tử PG của mô sụn (chứa khoảng<br /> 80 - 100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid<br /> hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học<br /> vững chắc. Vì thế CS được chiết rút từ sụn động<br /> vật bằng phương pháp sinh học nhờ sự thủy phân<br /> protein liên kết bởi các exogenous protease (như<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> <br /> papain) [10; 6; 4]<br /> Cấu trúc phân tử CS rất đa dạng và phức tạp<br /> nên chưa thu nhận CS được bằng con đường tổng<br /> hợp hóa học, cho đến nay mới chỉ tổng hợp được<br /> các mạch oligosaccharide ngắn có trình tự giống<br /> một đoạn mạch CS như một số CS tetrasaccharide<br /> (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát<br /> triển và phân hóa của neron thần kinh [11] còn phân<br /> tử disaccharide thì không có tác dụng trên.<br /> <br /> Vũ Thị Thanh Tâm: Lớp Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2009 - Trường Đại học Nha Trang<br /> TS. Võ Hoài Bắc: Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam<br /> <br /> 150 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> Vì thế hiện nay nguyên liệu CS thô mới chỉ<br /> được thu nhận duy nhất từ các nguồn tự nhiên nhờ<br /> chiết xuất CS từ các loại mô động vật. Sụn cá mập<br /> (xương sọ, xương sống, vây...) là nguồn nguyên<br /> liệu CS phổ biến nhất trong các chế phẩm thuốc<br /> và chế phẩm bổ sung dinh dưỡng CS trong mô<br /> động vật liên kết chặt với protein trong dạng phức<br /> proteoglycan. Cho nên việc đầu tiên là phải tách CS<br /> ra khỏi protein nhờ việc làm yếu mối liên kết giữa<br /> CS-protein và phân hủy protein để giải phóng các<br /> phân tử CS.<br /> Quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ xương<br /> sụn có thể được thực hiện bằng phương pháp hoá<br /> học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzym) để<br /> thủy phân sụn.<br /> Trong phương pháp hóa học mô sụn được<br /> xử lý bằng nước nóng, dung dịch muối, kiềm<br /> (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH...) để tách<br /> glycosaminoglycan (GAG) khỏi các phân tử khác<br /> (protein, hyaluronic acid...). Phương pháp này đã áp<br /> dụng để thu CS từ sụn gà [6], sụn bò [7], tuy nhiên<br /> đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết glycoside của<br /> CS khi thu nhận CS.<br /> Phương pháp sinh học dùng enzym để thủy<br /> phân mô sụn là phương pháp có hiệu quả để thu<br /> nhận CS không bị biến đổi về cấu trúc, giữ được<br /> hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô<br /> nhiễm môi trường do các hóa chất (muối, kiềm,<br /> acid...) gây nên. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các<br /> enzym protease (papain, actinase, pronase...) để<br /> thủy phân sụn giải phóng GAG khỏi các protein liên<br /> kết. Sau khi loại bỏ protein thì CS được tách ra và<br /> tinh sạch. Phương pháp này đã được dùng để thu<br /> nhận GAG của sụn từ da cá Labeo rohita [12], sụn<br /> cá mập [8], cá sấu, cá đuối... Việc khảo sát và sàng<br /> lọc protease từ các nguồn nguyên liệu khác nhau<br /> (vi sinh vật, thực vật và động vật) có khả năng thủy<br /> phân protein gắn kết với CS trong sụn nhằm hạ giá<br /> thành sản xuất và giảm thiểu tác động môi trường<br /> là rất cần thiết.<br /> II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Nguyên liệu: Xương sụn cá đuối (Dasyatis<br /> kuhlii), cá nhám (Carcharhinus sorrah) được thu<br /> thập từ vùng biển Hải Phòng, do Phòng Sau thu<br /> hoạch, Viện Nghiên cứu Hải sản cung cấp.<br /> Hóa chất, thiết bị thí nghiệm: Các hóa chất phân<br /> <br /> Soá 1/2013<br /> tích đều đạt độ tinh khiết cao của các hãng Sigma,<br /> Invitrogen, Merk, Prolabo, Bio-Canada: casein, folin,<br /> albumin huyết thanh bò (BSA), glucose, tyrosine,<br /> 1,9-dimethylmethylene blue...<br /> Xác định hoạt độ protease: Theo phương pháp<br /> Anson cải tiến [9].<br /> Xác định hàm lượng protein: Theo phương<br /> pháp Lowry [5].<br /> Phương pháp sinh học tách chiết chondroitin<br /> sunfate:<br /> - Chuẩn bị mẫu: Nghiền nhỏ 10g hỗn hợp<br /> xương sụn cá đuối và cá nhám theo tỷ lệ 1:1, thêm<br /> vào 40ml nước khử ion, 1ml azid natri (0,02%).<br /> - Sử dụng phương pháp thủy phân sụn cá đuối,<br /> cá nhám theo Garnjanagoonchorn và cộng sự [4].<br /> Định tính và định lượng CS bằng 1,9-dimethylmethylene<br /> blue (DMMB): Xác định CS của dung dịch theo<br /> Farndale và cộng sự [3].<br /> Xác định độ sạch của chế phẩm CS: Bằng sắc<br /> ký khối phổ (LC/MS), sắc ký lỏng HPLC.<br /> Kiểm tra độ độc của enzym: Bằng phương pháp<br /> xác định LD50.<br /> III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 1. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease từ<br /> chủng Bacillus subtilis B-26 để thủy phân sụn cá<br /> Dựa vào kết quả nghiên cứu sàng lọc các chủng<br /> vi sinh vật sinh protease ngoại bào có khả năng<br /> thủy phân sụn cá đuối và cá nhám đã công bố [2]<br /> Chúng tôi lựa chọn chủng B26 để nghiên cứu ứng<br /> dụng thủy phân sụn cá và so sánh với các nguồn<br /> protease khác.<br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease<br /> của chủng B26<br /> <br /> Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc<br /> vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, thời gian, nồng<br /> độ enzym... tối thích cho phản ứng. Để nghiên cứu<br /> ảnh hưởng của pH lên hoạt độ protease, phản ứng<br /> enzym được thực hiện ở cùng một thời gian, nhiệt<br /> độ 400C trong đệm Na-acetat (pH: 4,5; 5,5) và đệm<br /> <br /> TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 151<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 1/2013<br /> <br /> phosphate (pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5). Kết quả ở hình 1<br /> cho thấy protease ngoại bào của chủng B26 có hoạt<br /> tính cao nhất tại pH 8,5.<br /> Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng<br /> ảnh hưởng đến hoạt độ của enzym. Sử dụng pH tối<br /> thích đã được khảo sát ở trên cho phản ứng của<br /> enzyme protease của chủng B26 và thay đổi nhiệt<br /> độ của phản ứng thủy phân từ 30 - 700C. Kết quả<br /> trên hình 2 cho thấy protease của chủng B26 có<br /> hoạt độ cao nhất ở 500C.<br /> <br /> Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ protease của chủng B26<br /> lên quá trình thủy phân sụn cá<br /> <br /> Kết quả trên hình 4 cho thấy hoạt tính thủy phân<br /> sụn cá của nồng độ protease ngoại bào từ chủng<br /> B26 cao nhất với tỷ lệ 4 ml dịch enzym/10gam sụn<br /> (enzym có hoạt độ là: 0,17UI/ml enzym) trong các<br /> Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease<br /> của chủng B26<br /> <br /> điều kiện pH (8,5), nhiệt độ tối ưu (500C) và thời gian<br /> thủy phân là 48giờ.<br /> Để giảm giá thành khi thu nhận protease ngoại<br /> bào của chủng B26 chúng tôi chỉ tiến hành nuôi<br /> cấy chủng vi khuẩn ở nhiệt độ thường 280C và<br /> tiến hành xác định thời gian nuôi cấy cho hoạt tính<br /> enzym cao nhất.<br /> Hình 5a và 5b cho thấy sau 72 giờ nuôi cấy<br /> chủng B26, protease ngoại bào thô thu được<br /> có hoạt tính đạt tối đa so với hoạt tính protease<br /> ngoại bào thu được tại các thời điểm nuôi cấy<br /> <br /> Hình 3. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân<br /> sụn cá<br /> <br /> khác nhau.<br /> <br /> Kết quả trên hình 3 cho thấy hàm lượng CS<br /> được giải phóng ra cao nhất sau 24 giờ thủy<br /> phân. Để thu chế phẩm CS có độ tinh sạch cao<br /> thì cần phải loại bỏ triệt để protein có trong dịch<br /> sau thủy phân. Vì vậy, tiếp tục thủy phân đến 48<br /> giờ. Hàm lượng protein của dịch sau thủy phân<br /> giảm đi rất nhiều chỉ còn gần 60% so với hàm<br /> lượng protein tối đa có trong dịch thủy phân, hàm<br /> lượng CS vẫn giữ nguyên so với thủy phân 24<br /> giờ. Do vậy lựa chọn 48 giờ là thời gian tối ưu<br /> của protease ngoại bào từ chủng B26 thủy phân<br /> sụn cá đuối và cá nhám.<br /> <br /> 152 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br /> Hình 5a. Hoạt tính protease của chủng B26 nuôi cấy theo<br /> thời gian<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> <br /> Soá 1/2013<br /> <br /> Hình 5b. Hoạt tính protease của chủng B26 nuôi cấy theo thời gian<br /> <br /> Thể tích dịch nuôi vi sinh vật cho vào mỗi giếng<br /> là: 150µl; 1: 24 giờ; 2: 48 giờ; 3: 72 giờ; 4: 96 giờ; 5:<br /> 120 giờ.<br /> 2. So sánh khả năng thủy phân xương sụn cá và<br /> chiết rút CS của protease ngoại bào từ chủng B26<br /> với papain và bromelain<br /> Hiệu quả thủy phân xương, sụn cá Đuối của<br /> protease ngoại bào từ chủng B26 cũng dễ dàng nhận<br /> ra bằng cảm quan. Các mẫu xương sụn bị thủy phân<br /> tơi ra khi bổ sung enzym protease của chủng này, dịch<br /> <br /> Hình 6. Khả năng thủy phân sụn cá đuối của enzyme ngoại<br /> bào chủng B26<br /> <br /> sau thủy phân đục so với mẫu đối chứng (hình 6). Điều này cho thấy khả năng ứng dụng của protease từ chủng<br /> B26 thay thế enzym papain cho quá trình tinh sạch chondroitin sulfat là rất khả thi.<br /> Để tìm được nguồn enzym vừa có khả năng thủy phân sụn và giải phóng CS mạnh và có giá thành rẻ nhất,<br /> chúng tôi đã so sánh khả năng thủy phân và chiết rút CS trong sụn cá của protease ngoại bào của vi khuẩn B-26<br /> với papain [4], bromelain [1]. Kết quả bảng 1 cho thấy chế phẩm ngoại bào của B.subtilis B-26 cho hiệu quả thủy<br /> phân xương sụn cá và hiệu suất chiết rút CS trong sụn mạnh như papain và bromelain.<br /> Bảng 1. Hiệu quả thuỷ phân sụn cá trong 48 giờ của các protease<br /> % CS của dịch sau<br /> thủy phân/ khối lượng<br /> sụn khô<br /> <br /> % protein hòa tan/<br /> khối lượng sụn khô<br /> sau thủy phân<br /> <br /> Giá thành enzym<br /> (VN đồng) thủy phân<br /> 100g sụn khô<br /> <br /> Papain (20mg/1g sụn);<br /> 650C; pH 7,0<br /> <br /> 15,50 ± 1,45<br /> <br /> 8,70 ± 1,73<br /> <br /> 38.000<br /> <br /> Bromelain (20mg/1g sụn); 550C; pH 6,0<br /> <br /> 15,20 ± 1,95<br /> <br /> 8,80 ± 1,84<br /> <br /> 218.000<br /> <br /> Protease ngoại bào của B.subtilis B-26<br /> tỷ lệ 0,4ml (0,17UI/ml)/1g sụn); 500C;<br /> pH 8,5<br /> <br /> 15,02 ± 1,36<br /> <br /> 12,54 ± 1,9<br /> <br /> 12.000<br /> <br /> Protease<br /> <br /> TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG ❖ 153<br /> <br /> Taïp chí Khoa hoïc - Coâng ngheä Thuûy saûn<br /> Nguồn cung cấp papain và bromelain thường<br /> khan hiếm, giá thành của papain (38 ngàn đồng/<br /> thủy phân 100g sụn), giá thành của bromelain (218<br /> ngàn đồng/100g sụn) cao hơn nhiều chế phẩm<br /> protease ngoại bào của B.subtilis B-26 (12 ngàn<br /> đồng/100g sụn). Protease của động vật hay thực<br /> vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc<br /> exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra<br /> cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính<br /> đặc hiệu cơ chất cao, chúng có khả năng thủy phân<br /> tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein.<br /> Protease ngoại bào của chủng B26 là nguồn<br /> enzym tiềm năng có giá thành khá thấp, tuy nhiên<br /> để hoàn thiện qui trình nuôi cấy để thu lượng lớn<br /> enzym, sản lượng ổn định có hoạt tính thủy phân<br /> cao đòi hỏi thời gian và kinh phí để nghiên cứu tiếp.<br /> <br /> Soá 1/2013<br /> 3. Khảo sát về độ an toàn của chủng giống và<br /> chế phẩm enzym thu được<br /> Để có thể sử dụng protease ngoại bào của<br /> chủng B26 cho việc tách chiết CS là một chế phẩm<br /> thuốc, chúng tôi đã kiểm tra độ độc của chủng và<br /> enzym.<br /> Cho chuột nhắt Swiss (trọng lượng 22gam)<br /> uống sinh khối vi sinh chứa 106 - 1010 tế bào/ml với<br /> liều 1ml/kg/ngày và chế phẩm enzym protease (dịch<br /> protease ngoại bào nuôi sau 48h) với liều 1ml/kg/ngày,<br /> xác định LD50 sau 10 ngày.<br /> Sau 10 ngày không có một con chuột nào bị<br /> chết (bảng 2), chứng tỏ chủng vi khuẩn thí nghiệm<br /> Bacillus subtilis B-26 và chế phẩm protease ngoại<br /> bào thu được từ các chủng này không chứa độc tố,<br /> bảo đảm độ an toàn khi sử dụng.<br /> <br /> Bảng 2. Kiểm tra độ độc của chế phẩm enzym protease ngoại bào của chủng Bacillus subtilis B-26<br /> LD 50<br /> <br /> Chủng giống<br /> <br /> Bio 26<br /> <br /> Vi khuẩn<br /> <br /> Chế phẩm enzym protease<br /> <br /> Không độc<br /> <br /> Không độc<br /> <br /> IV. KẾT LUẬN<br /> 1. Đã nghiên cứu được các điều kiện tối ưu cho<br /> hoạt động của chế phẩm protease ngoại bào của<br /> chủng B-26: tỷ lệ 0,4ml (0,17 UI/ml) enzym/1g sụn<br /> cá, thời gian thủy phân là 12giờ, pH 8,5 và nhiệt<br /> độ 500C. Sau 72giờ nuôi cấy chủng B26, protease<br /> ngoại bào thô thu được có hoạt tính đạt tối đa<br /> 2. Chủng vi khuẩn thí nghiệm Bacillus subtilis<br /> B-26 và chế phẩm protease ngoại bào thu được<br /> <br /> không chứa độc tố, bảo đảm độ an toàn khi sử dụng.<br /> 3. Chế phẩm protease ngoại bào của<br /> B.subtilis B-26 cho hiệu quả thủy phân xương sụn<br /> cá và hiệu suất chiết rút CS trong sụn mạnh như<br /> papain và bromelain. Giá thành sản xuất protease<br /> ngoại bào của chủng B26 thấp nên khả năng ứng<br /> dụng của protease từ chủng B26 thay thế enzyme<br /> papain cho quá trình tinh sạch chondroitin sulfat<br /> là rất khả thi.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Tiếng Việt<br /> 1.<br /> <br /> Lại Thị Ngọc Hà. (2009). Nghiên cứu tách và tạo chế phẩm bromelain từ phế phụ phẩm dứa. Tạp chí Khoa học và Phát triển.<br /> tập 7, số 2: 203-211<br /> <br /> 2.<br /> <br /> Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú, Trần Cảnh Đình, Lê Thị Oanh. (2010). Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate từ xương sụn<br /> cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) bằng công nghệ sinh học. Bản tin Viện nghiên cứu Hải sản số<br /> 16: 26-30<br /> Tiếng Anh<br /> <br /> 3.<br /> <br /> Farndale W.R, Buttle D.J, Barrett A.J. (1986). Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by<br /> use of dimethylmethylene blue. Biochim. Biophys. Acta 883. 173-177.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> Garnjanagoonchorn W, Wongekalak L, Engkagul A. (2007). Determination of chondroitin sulfate from different sources of<br /> cartilage. Chemical Engineering and Processing 46. 465-471.<br /> <br /> 154 ❖ TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG<br /> <br />