Nghiên cứu Vi sinh vật sinh học cơ sở (Tập II - Tái bản lần thứ nhất): Phần 2

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:140

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nối tiếp nội dung phần 1, phần 2 cuốn ""Cơ sở sinh học vi sinh vật (Tập II)" trình bày các nội dung: Di truyền và biến dị ở vi sinh vật; đại cương về quá trình nhiễm khuẩn và miễn dịch. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu Vi sinh vật sinh học cơ sở (Tập II - Tái bản lần thứ nhất): Phần 2

Chương VIỈI DI TRUYỀN VÀ BIỂN DỊ ở VI SINH VẬT 1. TỪ KHÓA - Axit nucleic: các polym ere mạch thang của các nucleotite (xem thêm sự khác n h au của các loại axit nucleic). - T.ADN m ột đoạn plasmideT, của A grobacterium được chuyến vào thực vật. - Plasm ide Ti: một loại plasm ile tiếp hợp được có ở trong tê bào vi k h u ẩn A grobaderium tum efaciens có thể chuyển gen vào thực vật. - Sao m ã (phiên mã) (transcription): một cơ chế chuyển thông tin di truyền từ ADN sang ARN, bằng cách tổng hợp m ột p hân tử ARN theo nguyên tắc bố sung của một trong 2 mạch của p h ân tử ADN xoắn kép (mạch mẫu). - Tải nạp (transduction): chuyển thông tin di tru y ền của cơ th ể cho sang cơ thể n h ận nhờ các virus (phage). - Biến n ạp (Transform ation): chuyền thông tin di tru y ền b ằn g các đoạn ADN tự do. - G iải m ã (dịch mã) (Translation): cơ ch ế chuyên đổi thông tin di truyền từ ARN thông tin sang protein. - Các yếu tố di tru y ề n vận động T ra n sp o so n (gene mobile): một đoạn ADN có th ể di chuyền trê n genom e. Khi có sự th êm vào h ay bổt đi vào các gen th ì gây r a sự di chuyên vị trí, đồng th ờ i có th e kéo theo các gen khác. - Viroid: một ph ân tử ARN nhỏ có đặc tín h giống virus. 147
- Virion: một h ạ t v irus ò ngoài tế bào, sau chu kỳ n h á n lẽn CUÍ^ virus được giải phóng ra và có th ể xâm nhiễm vào tê bào mối. - Sao mã ngược (Reverse transcription): một cơ ch ế sao m ã thông tin di truyền từ ARN sang ADN. - ADN tái tổ hợp (ADN recom binant): m ột p h ân tử ADN' gồm ADN có nguồn gốc từ hai hoặc nhiều nguồn ADN khốc nh au . - Sự tái tố hợp (Recombination): một quá trìn h dung hợp các yếu tô’ di truyền từ hai hệ gen (genome) khác nhau vào một hệ gen tro n g một tế bào hay một cơ thể. - N hân đôi ADN (Replication, duplication): sự biến đôi m ột p h ân tử ADN hai m ạch th à n h hai phân tủ ADN hai m ạch giống h ệ t n h au . Hiện tượng nh ân đôi ADN là hiện tượng bốn bảo tồn, có n g h ĩa là tro n g mỗi phân tử ADN được hình th à n h có một m ạch là m ạch gốc và m ạch kia là m ạch mới. - Plasm id: m ột yếu tố di tru y ền ngoài nhiễm sắc thể, không nhất th iế t cần cho sự sinh trưỏng, nhưng có thế tự n h â n lên độc lập với nhiễm sắc thê và m ang cho tê bào những tín h ch ấ t th ích nghi mới. - P hân bào giảm nhiễm (meiosis): trong cơ th ể n h â n ch u ẩn , sự phân bào giảm nhiễm làm biến đôi tê bào lưỡng bội th à n h tê bào đơn bội. Sự p hân bào này dẫn đến hình th à n h các tê bào giới tín h . Q uá trìn h được thực hiện theo hai lần ph ân chia nh ân liên tiếp (giảm nhiễm I và giảm nhiễm II) m à chỉ có một lần th ể nhiễm sắc được n h â n lên. Mỗi lần phân chia có thê được chia th à n h 4 pha: prophase, m etap h ase, an a p la se và telophase, tương tự n h ư sự ph ân bào có tơ (mitose). - T rao đổi ch ấ t (m etabolism ): toàn bộ các p hản ứng sinh hóa trong tế bào kể cả những p h ản ứng tổng hợp (anabolic reaction) và p h ản ứng phân giải (Catabolic reaction). Các hợp ch ấ t được h ìn h th à n h , trong đó có các hợp ch ấ t tru n g gian gọi là các ch ấ t trao đổi (m etabolite), có th ể là chất trao đổi sơ cấp (prim ary m etabolite - hợp ch ấ t được h ìn h th àn h trong ph a sinh trưởng) hoặc là ch ấ t trao đổi th ứ cấp (secondary m etabolite sả n phẩm được hìn h th à n h ố cuối ph a sinh trư ở ng hay ở pha cân bằng động). 148
- Mutagen: một tác nhân đột biến như một sô tia bức xạ hay hóa chất - Đột biến (M utation): một sự biến đổi ADN làm th ay đổi thông tin di truyền của cơ thể. - Yếu tô’ gia nhập (IS.insertion sequence; IS elem ents): một loại đơn giản n h ấ t của yếu tố vận động. Sự gia nhập đoạn ADN ngoại lai vào phân tử ADN có trước (insertion). Yếu tố gia n hập chỉ bao hàm những gen trong những đoạn ADN vận động (transposition). - Intron: gen “lì”, tậ p hợp những nucleotite không m ả hóa thông tin di truyền, ngược lại với exon là những nucleotite mã hóa các protein, exon là các gon hoạt dộng. - Công nghệ di truyền (Genetic engineering): s ử dụng kĩ th u ậ t invitro trong việc tách lập, nhân lên, tái tô hợp và biêu đạt các phân tủ ADN. - Tiếp hợp (Conjugation): ớ tê bào nhân sơ. chuyển vận thông tin di truyền từ tê bào cho (donor cell) sang tê bào n h ận (recipient cell) thông qua cầu tiếp hợp nhờ sự tiếp xúc giữa 2 tế bào. - T ế bào hoặc cơ th ê lưỡng bội (Diploid) ỏ cơ th ể n h ân chuẩn, một cơ thê hoặc một tê bào có 2 tô hợp nhiễm sắc thế, mỗi tô hợp có nguồn gôc từ một (gam ete) giao tử riêng biệt. - Bioíìlm: k h u ẩ n lạc vi k h u ẩn được bao bọc bởi m àng dính (m àng nhày), thường là loại ch ấ t polysaccharide và đính trê n bề m ặt. - Công nghệ sinh học (Biotechnology): khoa học sử dụng các qui lu ậ t của cơ thế sống và công nghệ vào sản x uất công nghiệp các sản phẩm nhu cầu và xử lí cơ chất. - Dòng (tê bào) (clone): một tập hợp tế bào được sin h ra từ m ột tế bào do sinh sả n vô tính. Clone cũng được dùng đôi với /YDN là một sô bản sao ADN th u được từ một ADN gia nhập của phage hay plasm id. - K huân lạc (colomy): một quần thè trông thấy được cua nhũng tê bào sinh trưởng trê n môi trường đặc. do sự p h ân chia vô tín h từ một tê bào lian đau. - PCR (Polym erase chain reaction): phán ứng chuỗi trù n g hợp các axit nucleic. Một kĩ th u ậ t cho phép nh ân đôi cốc đoạn ADN mong muốn, 149
kĩ th u ậ t đã sử dụng ADN polym eraza bền n hiệt, một enzym được chiết từ một loại vi sinh v ật cổ sống ở n h iệt độ cao, kĩ th u ậ t sử d ụ n g 2 đoạn mới có tr ậ t tự nucleotit bô sung với 2 đầu của 2 m ạch của chuỗi ADN mong muốn nh ân lên. Chu kỳ nhân đôi khoảng 2 p h ú t, ở 95°c đẽ tách 2 m ạch của chuỗi xoắn kép ADN, 50°c để ghép các đoạn mồi và 72°c để tổng hợp các m ạch mâi theo đoạn mồi. * Một sô giai đoạn chủ yếu của sự ph á t triển công nghệ tái tó hợp ADN: -1869: M iescher lần đầu tiên đã tách lập AND. - 1944: Avery đã chứng m inh ADN chứ không p h ải pro tein mang thông tin di truyền trong quá trìn h biên nạp ở vi kh u ẩn . - 1953: W atson và C nck đã đề x u ất mô h ìn h chuỗi xoắn kép cấu trúc của ADN, dựa trê n kết quả nghiên cứu b ằng tia X của F ra n k lin và Wilkins. - 1957: K ornberg p h át hiện ADN polym eraza. - 1961: M am ur và Doty p h át hiện sự phục hồi trạ n g th á i tự nhiên của ADN. Do đó th iế t lập tính đặc hiệu và tín h k h ả th i củ a các phản ứng lai axit nucleic. - 1962: A rber lần đầu tiên chứng m inh sự tồn tạ i của các enzym giới hạn (enzyme de restriction) của ADN; điều đó cho phép N ath a n s và H. S m ith làm tin h k h iế t ADN và sử dụng chúng để xác đ ịn h tr ậ t tự nucleotit của ADN. - 1966: N irenberg, Ochoa và K horana th u y ế t m in h m ã di truyền. - 1967: G eliert p h á t hiện ADN - ligaza, m ột enzym được sử dụng để gắn các đoạn ADN. 1972-1973: Các kĩ th u ậ t tạo dòng ADN đã được th iế t lập tạ i các phòng th í nghiệm Boyer, Cohen, Berg và các cộng sự tạ i các trường đại học Stanford và đại học Sanfrancisco. 1975: Kĩ th u ậ t S o uthern p h át triển lai sau k hi chuyển dịch của gel để kiểm tr a tr ậ t tự các ADN đặc trưng. 1975-1977: S anger và Barrell. M axam và G ilbert p h á t triể n các phương pháp xác định n h an h tr ậ t tự nucleotit của ADN. 150
1981-1982: P alm iter và B rin ster tạo ra các dòng chuột chuyển gen; Spradling và Rubin tạo ra các giống ruồi dấm chuyển thông tin di truyền. 1985: M ullis và cộng sự p h át m inh chuỗi trù n g hợp ADN (PCR) - S outhern blot: kĩ th u ậ t lai mạch đơn của ax it nucleic (ADN hay ARN) vào đoạn ADN b ấ t động trên m àng bọc. - N orthern blot: kĩ th u ậ t lai mạch đơn của ax it nucleic (ADN hay ARN) vào đoạn ARN b ất động trê n m àng lọc (xem S ou th ern blot và w estern blot). 2. MỘT SỐ KHÁI NIỆM CHUNG - Di truyền học vi sinh v ật nghiên cứu hệ gen (genome) của vi sinh vật, bao gồm sự sắp xếp các gen, sự biến đổi kiểu gen và sự biểu hiện ra kiểu hình. Sự biến đổi kiểu gen bao gồm sự đột biến diễn ra trong q uần th ể vi sinh vật làm x u ất hiện các tế bào khác biệt (về tín h trạ n g h ìn h thái, sinh lí trao đổi chất, kiểu dinh dưỡng nuôi cấy...) so với các tế bào ban đầu (hay tế bào hoang dại) bởi một hoặc nhiều tín h trạn g , m à người ta gọi chúng là các thề' đột biến. - Sự tá i tô hợp làm th ay đổi vật chất di tru y ền sau khi chuyển v ật chất di truyền từ tế bào này (tế bào A) sang tế bào khác (tế bào B) nhò: 1- Biến nạp (Transform ation): vật chất di tru y ền của A sau khi tách chiết ở trạ n g th á i vô bào, xâm nhập vào tê bào B. 2- Tải nạp (Transduction): sự vận chuyển v ật ch ấ t di tru y ền được thực hiện nhờ phage tải nạp (Bacteriophage). 3- Tiếp hợp (conjugaison): sự vận chuyên p h ân tử ADN từ A sang B qua cầu tiếp hợp nối giữa hai tế bào này. - T ính đa h ìn h (Polym orphism e hay Pléomorphism e): sự khác n hau về hình th á i vi sin h v ậ t ở trong nội bộ một quần thể, giữa các cá th ể có cùng một nguồn gốc. T ính đa hình ở vi sinh v ật k há phổ biến đặc biệt 151
khi nuôi cấy trên các môi trường giàu nitơ hữ u cơ. M ột số loài vi k huẩn có các giai đoạn h ìn h th á i khác n h au trong chu trìn h sống của m ình. Về lí thuyết, ngược lại với tính đa h ìn h là tín h đơn hình (monomorphisme) được Koch và P a ste u r nêu lên, n h ằm k h ẳn g đ ịnh một m ầm chỉ gây m ột loại bệnh, một tác nh ân vi sinh v ậ t chỉ gây ra m ột quá trìn h lên men n h ất định... Trong những năm gần đây, nhờ công nghệ di tru y ền m à người ta có thế mở rộng khái niệm tái tố hợp dí truyền bằng cách thực hiện sự lắp ghép khác nh au của ADN giữa các loài có nguồn gôc ch ủ n g loại phát sinh r ấ t xa n h au (ví dụ giữa một loài vi k h u ân và một loài động vật). • Sự biến dị ở vi sinh vật đã được N atson (G.A.Nadson. 1931) chia th à n h 3 loại: 1- Biến dị- biểu hiện khi có th ay đổi các giai đoạn sông, tức là theo mức độ p h át triển và sự già của giống cấy m à th a y đổi kích thước, dôi khi cả hình dạng nữa. gọi là sự biến dị p h át triể n cá thể. 2- Ở vi khuẩn, cõng như ở các cơ th ể bậc cao. không th ể có h ai cá thể tuyệt đô'i hoàn toàn giống nhau, các cá th ể của m ột loài có th ổ khác nh au ít nhiều về hìn h dạng, độ lớn tê bào và về tín h c h ấ t sin h hóa, đó là biến dị cá thể. 3- Biến dị hàn g loạt cá thể của quần th ể khi sống trê n môi trường n h ấ t định gọi lả thường biến, các tìn h trạ n g có được hoặc m ấ t đi có thể được lưu giữ trong m ột thời gian tương đối dài ở các th ế hệ cấy truyền (thường biến kéo dài) hay r ấ t ngán (thưòng biến n h ấ t thòi). - Các tính trạng ở vi sinh vật thường được chia th à n h các nhóm chính: 1- Các đặc điếm hình th á i ở từng cá th ể như h ình dạng, kích thước tế bào, ở từ ng k h u ẩ n lạc p h át triến từ một tế bào. sự h ìn h th à n h màng nhày, hình thức p h ân chia, cách ph ân bốcơ q uan chuyên động... 2- Các đặc đicm sin h hóa như th à n h p h ần th à n h tê bào. tý lệ các bazơ nitơ trong ADN. tr ậ t tự nucleotit trong rARN, sắc tố. c h ấ t trao đổi... 152
3- Các đặc điểm nuôi cấy như kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng, phản ứng với các tác n h ân v ật lí của môi trường, bền vững với các phage... 4- Các đặc điểm m iễn dịch như tính kháng nguyên, đặc điểm huyết thanh, k h ả năn g gây bệnh... 3. VẬT CHẤT THÕNG TIN DI TRUYỀN ỏ VI SINH VẬT 3.1. Tổ chức vật chất di truyển Tố chức v ật ch ấ t dí tru y ền ỏ vi k h u ẩn lúc sắp p h ân chia chỉ là một phân tử vòng ADN m à người ta gọi là thế nhiễm sắc tr ầ n của vi k h u ẩn dài khoảng lm m , vối khối lượng phân tử khoảng 3.10” daltons, chứa khoảng 4.500.000 bp (4500 kilobase paires-Kb). Nó bao gồm hai mạch polynucleotit có 2 cực ngược chiều nhau. Ngoài ra, ph ần lớn vi k huân còn m ang các yếu tô ADN di truyền ngoài nh ân m à người ta gọi là các plasm id, hay các ADN của virus từ các phage chuyển vào. Các yếu tô" ADN th ê nhiễm sắc hay là ngoài th ể nhiễm sắc dưối dạng vòng có khá năn g nh ân đôi độc lập và tách ly trong quá trìn h nhân dôi của vi k h uẩn, người ta gọi chúng là các bản sao (replicon). Các bản sao thè nhiễm sắc khác với các bản sao plasm id hoặc bản sao ADN của phage chủ yếu là về kích thước. Đặc biệt, các yếu tô’ di truyền ngoài thế nhiễm sắc đôi khi có th ê không được nh ân lên và không được p hân bố sang 2 tê bào con trong quá trìn h tế bào phán chia. N hư vậy kiêu gen (genotype) của vi sinh vật là hệ thông ADN có kh ả n ăng tự tá i sin h của tế bào, bao gồm hệ gen (genom) tức là các gen nằm trên thê nhiễm sắc. các gen nằm trong c h ấ t nguyên sinh (plasmom) và trong các lạp thể (plastidom ) nếu có. T rong khi đó tô chức di tru y ền ỏ vi rú t (Acaryote) chỉ là những phân tử trù n g hợp axit nuclcic (ADN hoặc ARN, một mạch hoặc hai mạch). Kiêu hình (phenotvpe) ở vi sinh v ật là tập hợp cụ thế của tấ t cả các tính trạ n g của v i sinh vật trong những điều kiện xác định cùa môi U ườníỊ. Ớ vi khuẩn người ta thấy chỉ có khoảng 10% số gen của th ế nhiễm sác bị ức chế. còn đại bộ phạn các gen có thố được biếu hiện khi có cơ hội. 153
Vi sinh v ật vổi cấu tạo tê bào tương đối đơn giản, p h ầ n lớn chúng là những cơ thê đơn bội hay ph ần chủ yếu trong chu trìn h sống là cơ thể đơn bội, số lượng gen tương đối ít, ph ần lốn n hững biến dị kiểu h ìn h ở vi sinh v ật m ang đặc điểm thích nghi. T ất cả n hữ ng k iểu h ìn h của cơ thể có thể có được qui định bởi một kiểu gen lập th à n h mức p h ản ứng. T h u ật ngữ đột biến (m utation) đã được D evrie dùng năm 1901 khi nghiên cứu tín h di tru y ền và biến dị ở thực vật, th u ậ t ngữ này đã được B eijerinsk dùng trê n vi k h u ẩn để chỉ những biến đổi có tín h nhảy vọt của các tín h trạ n g có k h ả năng di tru y ền (ví dụ m ẫn cảm hay chống chịu vởi k h án g sinh, n h u cầu đối với tác n h ân sin h trưởng...). So sán h một sô' tín h chất của hệ gen (genom) của vi k h u ẩ n và cơ thể nh ân chuẩn được nêu dưới đây: Tính chát Vi khuẩn Tế bào nhân chuẩn 1. Genom có mànq boc Khỏnq Có 2. Đô dài của qenom - 1 mm - 1m 3. Trật tự nucleotit không làm Không (hoặc có rất ít) có nhiều chức nănq (intron) 4. Bàn chất cùa vặt chất thể Phân tử duy nhất vòng khép kin Rắt nhiéu phân tử, nhiễm sắc (khi sắp trưc phân) khònq vònq 5. Tổ hợp ADN với histon Không, có prõtẽin gần với Có histon (ví du HU) 6. ADN ngoài thể nhiễm sắc Nhiều (có thể chiếm tới 20% số ít (chủ yếu ở ti thể) qenom) 7. Tính chất ARNm Polycistron Monocistron. 3.2. Sự tôn thương và sửa chữa T ính ch ấ t di tru y ền p hụ thuộc vào sô lượng và tr ậ t tự các nuleotid trong chuỗi xoắn kép ADN, phân tử ADN trong khi n h ân đôi p h ụ thuộc khá nhiều vào các tác n h ân lí - hóa của môi trường các tác n h â n này có thế làm biến đối, sai lệch các p h ân tử m ang thông tin di tru y ề n của cơ 154
thể. Để sửa chữa những tổn thương đó, tế bào đã huy động m ột hệ thống enzym sửa chữa. Có 3 cơ c h ế hiện biết là: - Sửa chữa bằng cách loại bỏ trong khi n h ân đôi AND; - Sửa chữa bằng cách tái tổ hợp các phân tử AND; - Sửa chữa k h ẩn cấp SOS (xem thêm di tru y ền học đại cương). 3.3. Đột biến "ngẫu nhiên" hay "tự phát” ỏ vi sinh vật Trong quần thê vi sinh vật, tê bào đột biến chỉ chiếm một tỷ lệ rấ t nhỏ (1 0 7 hoặc 10 s). T ần số đột biến có thế tăn g lên dưới tác dụng của các tác nh ân gây đột biến. Có th ể nêu tóm tắ t ba th í nghiệm dưới đây chứng m inh đột biến ở vi sinh vật có tính tự phát, "ngẫu nhiên". 3.3.1. Chủng thăng giáng hay phép thử dao động của Luria và D elbruck (1943) Khi nhiễm phage T, vào E.coli thì tấ t cả các vi k h u ẩn đều bị làm tan. N hưng nếu trộ n m ột sô’ lượng lón trực k h u ẩn đường ru ộ t này với phage 'T, và dùng que gạt, san đều hỗn dịch trên m ặt môi trường dinh dưỡng có thạch, th ì có vài vi k huẩn không bị làm ta n và p h á t triển th à n h các k h u ẩn lạc, đó là th ế hệ sau của những tế bào đột biến bền vững với phage T, đã x u ất hiện. Đế chứng m inh sự x u ất hiện các đột biến này xảy ra một cách tự phát, các ông làm th í nghiệm sau: Pha huyền phù E.coli B vào nước th ịt với nồng độ 103 tế bào trong lm l, qua kiểm tra th ấy mọi tế bào trong huyền phù đều m ẫn cảm với T,. Sau đó lấy 20ml canh th ịt chứa vi k huẩn chia đều vào 40 ông nghiệm (mỗi ống chứa 0,5ml - lô A) và 20ml canh th ịt cho vào m ột bình nón (lô B), rồi đem nuôi trong tủ ấm 36 giờ, sau đó đem 40 ông nghiệm (0,5ml trong 1 ống) cấy lên m ặ t thạch dinh dưỡng của 40 hộp P êtri và 20ml ở bình nón cấy ra 40 hộp P etri (số giọt cấy trong các trường hợp đều giống nhau), trước khi cấy vi k h u ẩn E.coli, người ta đã phủ Tj vào tấ t cả các hộp lồng. 155
Sau khi nuôi ủ lần thứ hai, người ta đếm sô lượng các k h u ẩ n lạc xuất hiện trê n m ặt th ạch (tức là sô lượng tê bào E.coli B b ền vững với Tj đã x uất hiện). Kết quả cho thấy: ở lô A sô k h u ân lạc trong các hộp P êtri r ấ t khác nhau, còn ở lô B sô tê bào đột biến trê n m ặt th ạch của các hộp P êtri gần như nhau. K ết quả ấy nói gì? Nếu đột biến là định hướng th ì số lượng tế bào bên vững với phage sẽ tăn g lên khi vi k h u ẩn tiếp xúc với Tị. như vậy thì sô’ lượng các k h u ẩ n lạc trong từng hộp lồng ớ lô A phải bàng nhau và tống sô’ của chúng phải bằng tống số k h u ẩ n lạc ó lõ B. Nhưng thực tê lại không như vậy. trong các hộp ỏ lò A sô k h u ân lạc x u ất hiện r ấ t khác nhau, có những hộp không có k h u ấn lạc. tin h th ă n g giáng ấy ở các hộp P êtri của lô A chỉ có the giải thích là vì trước khi cho tiếp xúc vối phage T,, trong các ông nghiệm của lô A tạ i các thòi điểm nuôi cấv khác nh au của lần nuôi cấy thứ n h ấ t đã x u ất hiện những tê bào đột biến bền vữnự với phage T,. 3.3.2. Thi nghiệm của New com be (1949) hay phưong p háp phàn bô lại Newcombe cấy E.coli B m ẫn cám với T, lên m ặ t th ạ ch d inh dưỡng chứa trong hộp P êtri theo tỷ lệ 107 tế bào vào m ột hộp (ví dụ cấv 100 hộp). S au 6 giờ nuôi trong tú ấm ở 30"C. trong các hộp x u ất hiện các k h u ẩn lạc nhỏ li ti. Ông lấy 50 hộp ra. dùng que g ạt san đểu trê n mặt thạch (lô A). còn 50 hộp kia dê nguyên (lô B). Sau đó cây đều một lượng huyền phù phage T\ vào tấ t cả 100 hộp và lại dặt vào tủ am mún cấy. Sau khi nuôi cây. ông đem ra đêm sô lượng k h u ẩn lạc và n h ận thấy sốlư ợng k h u ẩn lạc xuất hiện trôn m ặt thạch ỏ lô A (nơi có p h â n bố lại) nhiều hờn ỏ lô B. N êu sô lượng tủ bào.E.coli bồn vũng với T, x u ất hiện là do cảm ứng khi có phagc Tj. th ì việc phân bố lại (gạt các k h u ẩ n lạc nhỏ li ti dàn đều k h áp m ặt thạch) sẽ không ảnh hưởng gì số lượng các k h u ẩn lạc bền vững với phage. Kết quá lại không như vậy, diều đó chửng tỏ ran g những chủng đột biùn bền vung YÚi phagt' xiiât hiện mót cách tự phát, không cần sự có m ặt của T]. T hật vậy. trong thoi kỳ nuôi ủ thứ nh ất, trôn m ặt thạch (lã xuất hiện nhung tô bào bồn vữníx với phase, nhờ sự phán bô lại mà n h ữ n " vi 156
k h u ẩn đột biến này rả i khắp trên m ặt thạch ớ lô A. đến khi cho tiếp xúc với phage và nuôi ủ lần th ứ hai, những chủng đột biến bền vững vổi Tj p h át triể n th à n h k h u ẩ n lạc. 3.3.3. Phương pháp chọn gián tiếp các chủng dột biến Phương pháp hoàn hảo này dã dược L ederberg nêu ra năm 1952 và hiện nay đã được dùng rộng rãi trong các phòng th í nghiệm để tuyển chọn dòng đột biến, phương pháp này còn gọi là phương pháp dóng dấu, được nêu vắn tắ t n h ư sau: Một thỏi gỗ có đường kính gần bằng dường kính hộp P êtri, đầu thỏi gỗ bọc vải nhung, dùng thỏi bọc nhung này ấn nhẹ lên m ặt thạch cũa hộp P êtri A, trê n đó có k h u ẩn lạc vi k h uẩn p h át triển và in san g m ặt thạch của hộp p ê tri B. Sau khi nuôi cấy. trong hộp P êtri B sẽ lặp lại một cách chính xác các k h u ẩn lạc đã mọc ở hộp A (cả về sô’ lượng và vị trí), Sri đồ tóm tắ t th í nghiệm của Lederberg dược nêu trong hình dưới đây (H ình V III-1). Hình VIII-1. Sơ đỗ giói thích thi nghiệm củ a Lederberg tuyển chọn đột biến b ằ n g phưong p h áp dỏng dâu. 157
D ùng thỏi gỗ bịt nh u n g vô trù n g in lên m ặt th ạ ch hộp P ê tri dãy I, nơi mọc r ấ t nhiều vi k h u ẩ n m ẫn cảm vâi Tj, rồi ấn lên m ặ t th ạ ch hộp P êtri của dẫy II, nơi không có phage T, và ấn lên m ặ t th ạ c h hộp Pêtri của dãy III nơi có p hủ P hage Tj. S au khi nuôi ở tủ ấm , trê n m ặ t thạch của hộp ở dãy III chỉ mọc vài k h u ẩ n lạc, đây chính là n h ữ n g tế bào đột biến bền vững với T, đã p h á t triể n th à n h k h u ẩn lạc. Chọn những tế bào ỏ hộp P êtri của dãy II, ỏ vị tr í tương ứng với vị trí các k h u ẩn lạc đột biến x u ất hiện ở dãy III, đem n h â n giống ở dãy I. D ùng thỏi nhung in lên m ặt thạch của hộp P êtri này, ấn nhẹ lên mặt hộp P êtri không có phage ở dãy II và có phage ỏ dãy III. S au lầ n th ứ hai đã có nhiều k h u ẩ n lạc bền vững với phage mọc trê n hộp P ê tri của dãy III hơn lần th ứ nhất. Cứ tiếp tục làm như vậy nhiều lần, sẽ đến lúc ta có được chủng E.coli bền vững với phage T,, m à trong quá trìn h tu y ển chọn không hể có sự tiếp xúc với phage T,. Cũng bằng phương pháp này, ngày nay người ta có th ể th a y phage T, bằng một loại k h án g sinh đê tuyển chọn các chủng đột biến chống k háng sinh, k h u y ết m ột c h ấ t sinh trưởng để tu y ển chọn ch ủ n g đột biến tự dưỡng về n h â n tố sinh trưởng ấy V . V . . Ngưòi ta xác định tầ n số đột biến (chúng giao động từ 10 :i đến 10'20 ) giả th iế t tầ n số đó là 10'6, điều đó có nghĩa là tro n g q u ần th ể gồm 106 vi k h u ẩn (hay m ầm vi sinh vật), k h ả năn g x u ất hiện 1 tế bào đột biến. T ần sô' đột biến có liên quan trự c tiếp với chủng vi sin h vật. Có thể xác định tầ n sô đột biến của một chủng vi sinh v ật n ghiên cứu theo thòi gian của pha sin h trư ỏng cấp số, vẽ đồ th ị như sau: 158
Tắn số các đột M biến M/S ----= f (n) s M -Số lượng thể đột biến s -Số lượng chủng hoang dại M„/S N- Số thế hệ phân chia do đó đường dốc chì tần số đột biến Đột biến là hiện tượng gián đoạn, có ng h ĩa là "có hoặc không". T rong m ột quần th ể vi k h u ẩ n m ẫn cảm với l|ag S treptom ycine tro n g 1 ml, có x u ấ t h iện m ột vài tế bào k háng ch ấ t k h án g sin h này. T ính ch ấ t mới có được tru y ề n từ th ế này sang th ế hệ sau: chủng đột biến bền vững vối S treptom ycine cơ thế’ được nuôi ủ n hiều lần trê n môi trường không có S trephom ycine m à vẫn duy trì đặc điểm mới có, vì vậy ngưòi ta nói đột biến là hiện tượng di truyền và bền vững. T rong khi đó cũng x u ất hiện những chủng m ẫn cảm trở lại ngay tro n g q u ần th ê của các m ầm k h án g thuốc, hiện tượng này cũng hiếm n h ư khi x u ấ t hiện các chủng của các ch ủng đối kháng, người ta nói ở đó đã có đột biến trở lại (m utation inverse). Đột biến nói chung là hiện tượng đặc biệt và đơn độc của từng cá thể, tức là x u ất hiện một tế bào mới có tính ch ất tách b iệt với tín h chất của quần thế, điều này có tầm quan trọng trong trị liệu, khi sử dụng thuôc k háng sinh đê điều trị bệnh nhiễm trùng, nếu không điểu trị hợp lí sẽ tạo ra nguy cơ có dòng vi sinh v ật nhờn thuốc. C húng ta lấy ví dụ một chủng m ẫn cảm vổi hai k háng sinh A và B, khi đó tầ n sô đột biến kháng vối mỗi c h ấ t k h án g sinh theo thứ tự là 10‘7 và 10'8. BỞI vì h ai đặc tính này là độc lập với nhau, nên khả năng x u ất hiện một vi k h u ẩn đột biến kép, tức là k h án g lại với cả hai chất kháng sinh A và B sẽ là 1 0 7 X 10'8 bằng 10'15, điều đó về thực tế là không đáng kể, vì vậy trong trị liệu người ta thường phối hợp nhiều chất kháng sinh để chữa các bệnh nhiễm trùng, đặc biệt là bệnh nhiễm trù n g cấp. 159
3.4. Cơ sở hóa sinh của hiện tượng đột biến H iện tượng đột biến có th ể xảy ra một cách tự nhiên, tầ n sô” đột biên tăn g lên khi có m ặt của nhiều tác nhân v ật lí và hóa học m à nguời ta gọi là các tác n h ân gây đột biến. H iện nay chúng ta mới b iết tương đối rõ cơ chế đột biến khi làm thực nghiệm cảm ứng. Ví dụ như nuôi E.coli trên môi trường có tác n h ân đột biến, theo dõi nhiêu th ế hệ. rồi tuvển chọn trên môi trường thứ hai theo tính chất đột biến này, tầ n số đột biến được xác định sô đột biên khi có m ặt của tác n h ân gây đột biến so sánh với đột biên khi không có tác nhân nàv. Ba khả năn g chủ yếu đã được nghiên cứu kĩ: 3.4.1. Thay đổi A D N do thay thê b a z ơ n itơ Có thê có hai loại, do m ột bazơ P urin được th av đối b àng một bazơ purin khác, hoặc một bazơ pyrim idin - bằng một bazơ P y rim id in khác (chuvển dịch T ransition), một loại khác khi m ột bazơ P u n n được thay thô bằng một bazơ pvrim idin và ngược lại (chuyển dao -Transversion). (Hình VIII -2). 160
(1 ) (3 ) (4 ) (5 ) ? \ l / t t t t t t t X A ỏ T G X X 0 T X A X G G 1 I I I I I I 1 1 1 1 1 1 ■ \ Ẳ G 0 T G X X (1) C h u y ể n d ịch G X X A X o G (T ran sitio n ) 1 1J 1 1 1 1 1 th ay th ế (S u b stitu tio n ) ft k J G c T G X X (2) Chuyển đ ảo 0 G X A X G G (T ran sv ersio n ) ....._1 _ 1 1 1 1 1 "I I n —I I — — r (3) M ất đ o ạn X A G T X X G T X A G G (D eletio n ) I I I I I I I A X Á ổ T G X >1 (4) T h êm đ o ạn G T X A X T G G (In sertio n ) 1 1 1 1 1 1 1 A 1 1 1 1 1 u X A G T G Ú (5) Biến đổi G T X A X (M o d iticatio n ) 1 1 1 1 1 1 Hình VIII-2: C ác q u á trinh đột biến 161 11- C SSH V SV - T2
Tổng kết một số biến đổi phân từ gây ra bời đột biến Kiểu đột biến Kết quả và ví dụ 1 Đột biến trực tiếp (mutation directes) . 1.1. Thay thê' chỉ một cặp bazơ: 1.1.1. Của ADN - Chuyển dịch (transition) -Thay một purin bằng một Purin khác, hay một pyrimidin bằng một pyrimidin khác: (ví dụ: AT bằng - Chuyển đảo (Transversion) GX) -Thay thế một purin bằng một pyrimidin, hoặc một 1.1 .2. Của protein pyrimidin bằng một purin (vi dụ: AT bằng XG) - Đột biến lặng - Bộ ba mã hóa thay đổi cùng mả hóa một loại axit - Đột biến trung tính amin: ví dụ AGG XGG, đểu mã hóa Arginin. - Bộ ba mã hóa thay đổi đối với một axit amin khác, nhưng hoạt động chức năng lại giống như cũ. - Đột biên sai Ví dụ: AAA (lysin) -> AGA (Arginin) - Bộ ba mã hóa thay đổi đối với một axit amin và - Đột biến không cảm thấy không hoạt động chức năng. - Bộ ba mã hóa thay đổi làm đình chỉ quá trinh giải mã Ví dụ: XAG (Glu) -> UAG (dừng). 1.2. Thêm vào hoặc bớt đi -i,Một cặp bazơ (đột biến bằng cách - Tất cả những đột biến thêm vào hoặc bớt đi một số tháo chốt - mutation par decalage hay bazơ đều dẫn đến sự thay đổi rất lớn trong đoạn ADN frameshift) và khi đọc giải mã sẽ thay đổi lớn trong protein. - Nhiều cặp bazơ II. Đột biến trở lại (mutation reverse) - Đột biến trỏ lại thực - Đột biến trở lại tương đương (Reversión equivalen) 162
0Ộ biến I Dột biến trở lại AAA(lys) -------ỉ» GAA (Glu) -------> MA (lys) Chủng hoang dại Chủng độl biến hoang dại Đột biến Đột biến trở lại UXX(Ser) -------» UGX (Sis) -------> AGX (Ser) hoang dại đột biến hoang dại Độl biến Trờ lại XGX > XXX ------- > XAX (arg.Kiém) (Pro không kiém) (His, kiém) Hoang dạì Đột biến Hoang dại giả (pseudo sauvage) III. Đột biến áp chế: (mutation suppresseurs) III. 1 Đột biến áp chê’ trong gen - XAT XAT XAT XAT XAT XAT -Thay đổi pha, thay đổi chiểu đào (+) (-) ngưọc trong cùng một gen. i ỉ -Thêm X vào trật tự dọc bộ ba mã hóa XAT XXA TAT XAT XAT XAT XAT thành XXA tiếp đó lá TXA. Sự mất y X z y y y đi của X kéo theo sự đọc cốt của XAT III. 2. Đột biến áp chế ngoái gen - Một gen mã hóa, ví dụ tARN-Tyr bị đột biến trong đối - Áp chế không cảm thấy mã - Áp tíhế sinh lí - Một sai lẩm trong con đường trao đổi chất bị áp chế bải một đột biến khác. Các bazơ nitơ của chuỗi nucleotit tồn tại dưới hai d ạng trù n g phức (tautom ere): dạng th ứ n h ấ t thường gặp là dạng xêtôn, dạng khác ít thấy là dạng ênol. Các dạng bazơ nitơ kết đôi bồ trợ n hau theo nguyên tắc bổ sung (A-T.G-X). C hính thực, tim in tồn tạ i tự nhiên dưới d ạng xêtôn kết đôi bô sung với adenin. Ngược lại, khi tim in dưới dạng ênol sẽ k ết đôi vối guanin theo sơ đồ mô tả ỏ hình VIII-3. 163
T im in d ạ n g x êtô A d en in Hình VIII-3. Hai khà nâng kết đôi củ a timin a- Tìmin dưới dạng xẽtõn kết đôi với adẽnin b- Timin dưối d ạn g ênol kết đôi vói guanin Từ sự k ết đôi sai lầm của tinin dạng ênol đã d ẫn đến sai lệch trong sao chép của AJDN khi n h â n đôi về sau này, cuối cùng cặp xitozin- guanin đã th ay th ê cặp nguyên gốc adenin-tim in. Mỗi m ột trong bôn bazơ nitơ đều có th ể tồn tạ i dưới h ai d ạng trùng phức: xêtôn và ênol, n h ư vậy cũng có cơ chế tương tự trê n để d ẫn đến sai lầm khi k ết đôi. Hợp ch ấ t tương tự bazơ (như 1,5 brôm ôuraxil tương tự như tim in) và các tác n h ẵn nitrơ gây ra các đột biến chuyển dịch (transition). 3.4.2. Thay đôi ADN do thêm vào (insertion) h o ặ c b ớ t đi (deletion): các hợp- chất nhuộm m àu acridin và đặc biệt là proflavin thường được thực nghiệm nghiên cứu, chúng gây ra m ột loại đột biến đặc biệt: cho thêm vào hoặc loại bớt đi một hoặc nhiều cặp bazơ nitơ tro n g p h ân tử ADN (hình VIII-2). T hông tin di tru y ền được sao sang mARN (ARN thông tin) được đọc bằn g m ột chuỗi các bộ ba (triplets) đã bị th a y đổi so vói tr ậ t tự các bazơ trê n ADN. 164
3.4.3. Thay đổi A D N do tia tử ngoại Các ch ấ t phóng xạ, tia u v ... là những tác n h ân gây đột biến r ấ t m ạnh, m à thưòng th ì chúng ta chưa hoàn toàn sán g tỏ cơ ch ế tác động của chúng. Trong trường hợp tia tử ngoại, sự hấp th ụ m ạnh n h ấ t của ADN ở vùng 260 nm. Ở tia này phần lón vi k huẩn bị tiêu diệt, nhưng cũng có một số ít đột biến được sống sót. Sự biến đổi hóa học diễn ra trong quá trìn h chiếu xạ r ấ t phức tạp gồm nhiều giai đoạn: h ình th à n h các nhị phân (dimere) bazơ pyrim idin nhờ mối liên k ết đồng hóa trị giữa hai bazơ nitơ liền kề n h au (H ình VIII-4); thủy p hần các gốc pyrim idin ở vị trí môì liên kết 4'-5'; sự khử am in của xitôzin; h ình th à n h các dạng trùng phức... m à không p hải mọi quá trìn h đều đã được mô tả sáng tỏ. Một sô’ tác nh ân loại alkyl có tác dụng rấ t m ạnh: như các hợp ch ấ t nitơ, sylfure, oxyt êthylene, êthylêthane, và êthylm etan sulfonat... uv -A*. T_ (2 5 4n m) - Gẳ *.;X- -T .... .SU !!! A— -Tì:::::::® A :: (inactivation) -Je»»» (.!- bất hoạt •G K = œ X - Ánh sáag + enzym -A:: =:T- —G ssm X- h -G:;.: sX - u G -T : :■A - V -■ A ■ ■... ]> > ? -T -" :A ' r X Q -J x = í.;; G -03B 3 m X “ Lc u Ị - G::ả ::: X“ l (photoreactivation) Dark reactivation Quang tái hoại Tái hoạt trong tổi Hình VIII-4. Sụ biến đổi tinrán thành dimere timin và sụ quang ly dimere timin 165
Thực ra các quá trìn h đột biến tự p h át đều có nh ữ n g nguyên nhân của nó, ph ần lớn cũng là do tác nh ân gây đột biến nội bào sin h ra trong quá trìn h trao đổi ch ấ t tru n g gian (m etabolism e m term echaire) như sinh ra các chất tương tự purin, peroxyt, axit ni trơ v.v... m à chúng ta không tách chiết ra được, các chất này cũng gây ra sự chuyển dịch (transition), chuyển đảo (transversion), thêm vào (insertion) hay loại bớt (délétion). Cuối cùng, cần n h ấn m ạnh đến tầm quan trọng của môi trường trong việc hình th à n h các loại đột biến, chính môi trường sống đả làm x uất hiện các tác n h ân đột biến, chính môi trường kiểm tr a sự tổng hợp và hoạt động của các enzym hồi biên. 3.5. Đột biến hinh thái N hững đột biến làm th ay đôi hình th á i ở vi k h u ẩ n như th a y đổi tiên mao, tiêm mao, bào tử, th à n h tê bào, kích thước tê bào v.v... đã được nghiên cứu. Các tiêm mao và tiên mao có thê bị thay đổi về kích thước, độ phồng và gợn sóng hoặc là biến m ất như thường gặp ỏ các chủng đột biến L isteria. Các chủng có k h ả năng hìn h th à n h bào tử đột biến không sinh được bào tử, như P a ste u r đã mô tả hiện tượng đối vói loài B ac.anthracis. Sự biên đôi rõ rệ t n h ât là sự biến đôi hình th á i k h u ẩ n lạc vi khuẩn khi nuôi cấy chúng trê n môi trường đặc, sự th ay đổi này có th ể thấy được bằng m ắt thường, nhưng rõ n h ất khi n hìn qua k ính lúp hoặc kính hiển vi với bội giác nhỏ, sự th ay đổi này được mô tả dưới d ạng k h u ẩ n lạc s (smooth - n h ẵ n bóng), k h u ẩn lạc R (Rough - xù xì, n h ă n nheo), k h uẩn lạc M (M uquesex - nhày ướt) và k h u ẩn lạc I (in term ed iaire - trung gian). K huẩn lạc s hay n h ẵn bóng, có viền tròn, đều đặn, các k h u ẩ n lạc R có dạng h ạ t lổn nhốn, tạo mép nhăn, có nếp gấp không đều đặn, các k h u ẩn lạc M có hìn h dạng tròn vối lớp m àng d ính có cấu trú c là các polyholosiđ, còn k h u ẩ n lạc I là dạng tru n g gian giữa d ạng s và d ạng R (Hình VIII-5). 166