Nhận dạng và mô tả đặc điểm hệ Glycoprotein huyết thanh bệnh nhân hội chứng mạch vành cấp

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 151­157<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> NHẬN DẠNG VÀ MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HỆ GLYCOPROTEIN <br /> HUYẾT THANH BỆNH NHÂN HỘI CHỨNG MẠCH VÀNH CẤP<br /> <br /> Đỗ Hữu Chí1, Nguyễn Tiến Dũng1, Phạm Đức Đan1, Lê Thị Bích Thảo1, <br /> Đỗ Doãn Lợi2, Nguyễn Bích Nhi1, Phan Văn Chi1*<br /> 1<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *chi@ibt.ac.vn<br /> 2<br /> Viện Tim mạch, Bệnh viện Bạch Mai<br /> <br /> TÓM TẮT: Nhồi máu cơ  tim cấp được xem là biến chứng nguy hiểm sau cùng của hội chứng mạch  <br /> vành cấp và thường xảy ra đột ngột, nằm trong những trường hợp cấp cứu tối khẩn, có tỷ lệ  tử vong  <br /> và để lại di chứng rất cao. Vì vậy, nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị phân tử đặc hiệu hơn cho ACS để <br /> ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán rất cần thiết. Trong huyết thanh, các glycoprotein tham gia vào  <br /> nhiều quá trình sinh học và có tiềm năng làm chỉ  thị  cho chẩn đoán và điều trị. Trong nghiên cứu này,  <br /> chúng tôi tiến hành nhận dạng hệ  glycoprotein trong huyết thanh của bệnh nhân ACS và người bình  <br /> thường khỏe mạnh bằng các kỹ  thuật proteomics như  sắc ký ái lực Concanavalin A, điện di SDS­<br /> PAGE và  hệ  thống  sắc  ký lỏng  nano  đa  chiều  kết   nối  với   khối  phổ   liên  tiếp (2D­NanoLC­ESI­<br /> MS/MS). Glycoprotein được phân tích bằng các công cụ  tin sinh học gồm phần mềm PEAK v6.0 và  <br /> PANTHER. Kết quả, 133 glycoprotein  ở mẫu nhồi máu cơ  tim cấp, 162 glycoprotein  ở mẫu đau thắt <br /> ngực không  ổn định và 195 glycoprotein  ở  người bình thường khỏe mạnh đã được nhận diện. Chức  <br /> năng sinh học của các glycoprotein cũng được phân loại thành các nhóm như xúc tác, điều hoà enzyme,  <br /> thụ thể, cấu trúc, vận chuyển và liên kết. Đáng chú ý, trong dữ liệu phân tích phổ  của chúng tôi phát  <br /> hiện cả  ba chuỗi của Fibrinogen (alpha, beta, gamma) trong huyết thanh b ệnh nhân nhồi máu cơ  tim <br /> cấp và đau thắt ngực không ổn định mà không được phát hiện ở người bình thường khỏe mạnh.<br /> Từ khóa: Hội chứng mạch vành cấp, glycoprotein, proteomics, NanoLC­MS/MS.<br /> <br /> MỞ ĐẦU thư. Trong đó, một số protein trước đây đã mô <br /> tả  như   ứng viên chỉ  thị  tiềm năng cho bệnh <br /> Glycosyl hóa làm tăng sự  đa dạng của hệ <br /> ung   thư   phổi   trong   huyết   thanh   như <br /> protein tới một mức độ  không một biến đổi <br /> haptoglobin   (HP),   inter­alpha­trypsin   inhibitor <br /> sau dịch mã nào sánh kịp. Vai trò quan trọng  <br /> heavy   chain   4   (ITI­H4),   complement   C3 <br /> của glycosyl hóa đã được đề cập từ các nghiên <br /> precursor   và   leucine­rich   alpha­2­glycoprotein <br /> cứu   về   cấu   trúc   protein,   vị   trí   glycosyl   hóa, <br /> cũng   được   phát   hiện   [5].   Với   phương   pháp <br /> tính tan protein, tính kháng nguyên và hoạt tính <br /> tiếp cận tương tự, hệ glycoprotein trong nước  <br /> chức năng của protein, thời gian bán hủy (half­<br /> tiểu bệnh nhân ung thư  bàng quang cũng đã <br /> life)   của   thuốc   cũng   như   tương   tác   giữa   tế <br /> được xác định [18]. Rõ ràng, việc xác lập mối <br /> bào­tế   bào   [11].   Trong   huyết   thanh, <br /> liên quan giữa cấu trúc polysaccharide và chức <br /> glycoprotein tham gia vào nhiều quá trình sinh <br /> năng của các glycoprotein, tìm kiếm các chỉ thị <br /> học và có giá trị lâm sàng cho bệnh nhân trong  <br /> sinh học (biomarker) cho chẩn đoán và điều trị <br /> chuẩn đoán và điều trị [5]. Từ lâu, người ta đã <br /> và cơ  chế  phân tử  mà quá trình glycosyl hóa <br /> biết rằng sự  thay  đổi của quá trình glycosyl <br /> protein  ảnh hưởng  đến cơ  chế  bệnh sinh là <br /> hóa trong tế  bào liên quan đến cơ  chế  bệnh  <br /> những lĩnh vực nghiên cứu quan trọng [3]. Để <br /> sinh và quá trình tiến triển tự  nhiên của ung <br /> đạt được những mục tiêu này, sự  phát triển  <br /> thư  (oncogenesis) [1]. Sử  dụng phương pháp <br /> của các kỹ thuật có độ nhạy cao cho phân tích <br /> tiếp   cận   bằng   sắc   ký   ái   lực   và   NanoLC­<br /> glycoprotein là hết sức cần thiết. <br /> MS/MS, Heo (2007) [5] đã nhận dạng và chọn <br /> lọc được 38 protein có liên quan đến bệnh ung <br /> <br /> <br /> 151<br />  Do Huu Chi et al.<br /> <br /> Hội chứng mạch vành cấp (Acute coronary  điều   kiện   cho   những   nghiên   cứu   về <br /> syndrome,   ACS)   là   một   thuật   ngữ   được   sử  proteome/subproteome   nhằm   khai   thác,   tìm <br /> dụng khi xảy ra trạng thái lưu lượng máu cung  kiếm   các   chỉ   thị   liên   quan   bệnh   lý.   Trong  <br /> cấp cho tim giảm đột ngột, trong đó bao gồm  nghiên   cứu   này,   chúng   tôi   nhận   dạng   hệ <br /> nhồi   máu   cơ   tim   cấp  (Acute   Myocardial  glycoprotein trong huyết thanh của bệnh nhân <br /> Infarction,   AMI)  ST   chênh  lên  (ST:   segment­ ACS và người bình thường khỏe mạnh bằng <br /> đoạn), nhồi máu cơ tim không ST chênh lên và  sắc  ký  ái  lực  Concanavalin  A,  điện  di  SDS­<br /> đau thắt ngực không ổn định (Unstable Angina,  PAGE và xác định protein bằng hệ  thống sắc <br /> UA)  [10]. ACS hiện nay vẫn là nguyên nhân  ký lỏng nano đa chiều kết nối với khối phổ <br /> gây tử vong hàng đầu và gia tăng nhanh chóng  liên tiếp (2D­NanoLC­ESI­MS/MS). Ngoài ra, <br /> tại   các   nước   phát   triển   cũng   như   đang   phát   đặc   điểm   về   chức   năng   sinh   học   của  <br /> triển, thậm chí đang có xu hướng dần trẻ hóa  glycoprotein được phân loại dựa trên cơ sở dữ <br /> độ  tuổi người mắc căn bệnh nguy hiểm này.  liệu PANTHER của Viện Tin sinh học châu <br /> Bất chấp những nỗ lực nghiên cứu ngày càng  Âu.<br /> được thúc đẩy mạnh mẽ  thì chỉ  thị  sớm cho  VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> ngăn   ngừa,   chẩn   đoán   và   điều   trị   ACS   vẫn  <br /> đang còn thiếu [2] và giá trị  tiên lượng giúp  Huyết   thanh   của   30   người   bình   thường <br /> phát   hiện  sớm   các  triệu  chứng   vẫn  chưa   rõ  khỏe   mạnh,   30   bệnh   nhân   đau   thắt   ngực  <br /> ràng. Mức biểu hiện thay đổi của các chỉ  thị  không  ổn định và 30 bệnh nhân nhồi máu cơ <br /> gây viêm như  C reactive protein (CRP), serum   tim được cung cấp bởi Viện Tim mạch, Bệnh <br /> amyloid A, myeloperoxidase and interleukin­6  viện Bạch mai, Hà Nội đã được khẳng định là <br /> (IL­6) được phát hiện thay đổi đáng kể ở bệnh   bình thường hay bệnh lý thông qua các chỉ  số <br /> nhân ACS [2].  xét   nghiệm   huyết   học   (glucose,   cholesterol,  <br /> triglyceride,   HDL­C,   LDL­C,   CK­MB, <br /> Trong   những   năm   qua,   hướng   dẫn   chẩn <br /> Troponin  hs­cTnT,   BNP,   SGOT,   SGPT…)   và <br /> đoán và điều trị  nhồi máu cơ  tim cấp của Tổ <br /> các   chẩn   đoán   hình   ảnh   liên   quan   bệnh   tim  <br /> chức Y tế  Thế  giới, của Hội Tim mạch Hoa  <br /> mạch như X­quang tim phổi, điện tâm đồ, siêu <br /> Kỳ, của Hội Tim mạch châu Âu... được cập <br /> âm   tim   và   chụp   động   mạch   vành.   Các   mẫu <br /> nhật không ngừng mà các chỉ  thị  sinh học là <br /> được   lựa   chọn   cho   nghiên   cứu   đều   có   sự <br /> nền  tảng của  những   thay  đổi   đó.   Cuối   năm  <br /> tương đồng về  giới tính, độ  tuổi. Tất cả  các <br /> 2011, các xét nghiệm Troponin của tổn thương  <br /> đối   tượng   cung   cấp   mẫu   đều   tự   nguyện, <br /> cơ   tim   có   độ   nhạy   cao   (High­Sensitive <br /> không mắc các bệnh truyền nhiễm, có đầy đủ <br /> Troponin) đã được sử dụng để chẩn đoán sớm <br /> hồ sơ và bệnh án rõ ràng. Mẫu được bảo quản  <br /> nhồi máu cơ  tim cấp không có ST chênh lên <br /> tại phòng nghiên cứu  ở  ­80oC trước khi phân <br /> [16]. Tuy nhiên, Troponin tim cũng tăng trong <br /> tích.<br /> một số  bệnh lý khác ngoài cơn nhồi máu cơ <br /> tim như  suy thận mạn, thuyên tắc phổi cấp,   Các hóa chất sử dụng đều có độ tinh sạch <br /> viêm màng ngoài tim cấp, sốc nhiễm trùng… cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử  và <br /> Vì vậy, cần có chỉ  thị  phân tử  mới đặc hiệu  được mua từ các hãng nổi tiếng trên thế  giới: <br /> hơn cho ACS để ứng dụng rộng rãi trong chẩn  Acrylamide, bis­acrylamide, urea, glycine, Tris, <br /> đoán   lâm   sàng.   Chính   vì   thành   phần   protein  sodium dodecyl sulfate (SDS) từ  công ty Bio­<br /> trong huyết thanh phức tạp và bắt nguồn từ  Rad   (Bio­Rad   Laboratories,   Hercules,   CA, <br /> nhiều   nguồn   gốc   mà   việc   nghiên   cứu   hệ  USA). Concanavalin A Sepharose™ 4B từ công <br /> glycoprotein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại   ty  GE  Healthcare  Bio­Sciences  AB  (Sweden). <br /> nhiều thông tin bổ ích.  Enzyme trypsin (proteomics sequencing grade), <br /> methyl  α­D­glycopyranoside từ  Sigma­Aldrich <br /> Trong những năm gần đây, sự  phát triển <br /> (St.   Louis,   MO,   USA).   Coomassie   Brilliant <br /> vượt bậc của các kỹ  thuật proteomics đã tạo <br /> <br /> <br /> 152<br /> Blue   R250   từ   MP   Biomedicals   (MP   liên tiếp dựa trên công bố trước đây của tác giả <br /> Biomedicals, Eschwege, Germany). Trần Thế Thành và nnk. (2008) [15].<br /> Hệ   sắc   ký   lỏng   nano   đa   chiều   (LC  Nhận   diện   và   mô   tả   đặc   điểm   hệ <br /> Packings,   Dionex,   Netherlands)   kết   nối   hệ  glycoprotein<br /> thống   khối   phổ   QSTAR®  XL   (Applied <br /> Các dữ  liệu khối phổ  được phân tích bằng <br /> Biosystems, MDS Sciex, Ontario, Canada) liên <br /> phần   mềm   PEAKS   v6.0  (Bioinformatics <br /> tiếp có độ nhạy cao cùng với các trang thiết bị <br /> Solutions   Inc., Waterloo, Canada)  và   sử   dụng <br /> khác của Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công <br /> phần   mềm   tin   sinh   online  PANTHER <br /> nghệ   Gen,   Viện   Công   nghệ   sinh   học,   Viện <br /> (http://pantherdb.org)   để   phân   loại   chức   năng <br /> Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.<br /> sinh học các glycoprotein huyết thanh.<br /> Chuẩn bị mẫu huyết thanh và cột sắc ký ái <br /> lực CoA KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Glycoprotein   huyết   thanh   được   thu   nhận  Hệ   glycoprotein   huyết   thanh   bệnh   nhân <br /> bằng kỹ thuật sắc ký ái lực với chất giá ConA   ACS <br /> theo nghiên cứu trước đây của Vũ Minh Thiết <br /> Trong nghiên cứu này, Concavanilin A (con <br /> và nnk. (2006) [14]. Nồng độ glycoprotein bám <br /> A), một lectin có nguồn gốc từ đậu Convanalia <br /> cột   được   xác   định   bằng   phương   pháp <br /> ensiformis  được  sử  dụng làm chất ái lực với  <br /> Bradford. Sau đó, các dung dịch thôi ra được cô <br /> gốc   đường   mano   hoặc   glycosyl   của  <br /> đặc, loại đường và muối bằng phương pháp <br /> polysaccharide  hoặc  glycoprotein  để  thu nhận <br /> tủa với acetone lạnh theo tỷ lệ protein: acetone  <br /> glycoprotein   trong   huyết   thanh   người.  Việc <br /> là 1:4 (v:v) và được bảo quản ở ­20oC.<br /> phân tích đồng thời nhiều protein có mặt trong  <br /> Điện   di   SDS­PAGE   và   thủy   phân   protein  các mẫu sinh học phức tạp như  huyết thanh  <br /> trong gel  đang là thách thức lớn  đối với các nhà khoa <br /> Glycoprotein huyết thanh bệnh nhân ACS  học trong lĩnh vực nghiên cứu proteomics. Sự <br /> và người bình thường khỏe mạnh được tra vào  phức tạp của mẫu không chỉ  do số lượng các <br /> các   giếng   của   gel   polyacrylamide   12,6%   protein có mặt và những biến đổi của chúng <br /> (khoảng 25 microgam protein/giếng). Quá trình  mà còn do sự chênh lệch rất lớn về hàm lượng  <br /> điện  di   được  thực  hiện dưới  hiệu  điện  thế  protein.   Khoảng 85%  protein  hàm   lượng  cao <br /> không đổi 110 Volt. Kết thúc điện di, gel được  (albumin,   immunoglobulin,   transferrin, <br /> nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue G­250.   lipoprotein…)   có   mặt   trong   huyết   thanh   [2,  <br /> Sau khoảng 1 giờ, rửa bằng nước cất 2 lần đã  12].   Đa   số   các   protein   hàm   lượng   thấp <br /> loại ion. Các glycoprotein biểu hiện trên bản  (cytokine, hormone…) lại  có vai trò  rất  quan <br /> điện   di   được   cắt   ra   từ   gel   polyacrylamide  trọng   trong   hoạt   động   sống   của   cơ   thể.   Vì <br /> thành 8 băng, mỗi băng lại được cắt rất nhỏ  vậy,   việc   phân   đoạn   protein,   loại   bỏ   các <br /> và  chuyển vào  ống  Eppendorf 1.5 ml đã khử  protein   có   hàm   lượng   cao   là   việc   làm   cần <br /> trùng. Protein được thủy phân bằng trypsin theo  thiết.   Kết   quả   phân   tích   bằng   điện   di   một  <br /> quy trình đã được mô tả bởi Vũ Minh Thiết và  chiều   SDS­PAGE   cho   thấy   các   băng <br /> nnk. (2006) [14]. glycoprotein được phân tách khá rõ ràng. Các <br /> protein   chiếm   hàm   lượng   cao   trong   huyết  <br /> Phương pháp tiếp cận sắc ký lỏng nano đa  thanh   như   albumin,   imunoglobulin   đã   được <br /> chiều kết nối với khối phổ  liên tiếp (2D­ loại bỏ  do không được glycosyl hóa. Sự  xuất  <br /> NanoLC­ESI­MS/MS) nhận diện protein hiện với số  lượng nhiều các băng này phản <br /> Quy trình nhận diện protein trên hệ  thống  ảnh   sự   đa   dạng   về   thành   phần   của   hệ <br /> sắc ký lỏng Nano đa chiều kết nối khối phổ  glycoprotein trong huyết thanh. <br /> Nhận dạng hệ glycoprotein huyết thanh <br /> <br /> <br /> 153<br />  Do Huu Chi et al.<br /> <br /> Solutions Inc., Waterloo, Canada). Trong đó, chỉ <br /> những protein có điểm số  ion peptide lớn hơn <br /> 20 mới được chấp nhận, phổ MS/MS của mỗi <br /> peptide có ít nhất 3 vị  trí amino acid liên tiếp  <br /> nhau   được   xác   định.   Các   protein   nhận  dạng <br /> được trong kết quả tìm kiếm được xác định là <br /> glycoprotein khi so sánh với ngân hàng cơ  sở <br /> dữ   liệu   SwissProt   (http://us.expasy.org/sprot). <br /> Kết quả, bằng sắc ký ái lực con A đã thu giữ <br /> Hình 1. Biểu đồ  Venn minh họa mối tương  <br /> được  133, 162 và  195 loại  glycoprotein khác <br /> quan   các   loại   glycoprotein  giữa  người   bệnh <br /> nhau từ  huyết thanh bệnh nhân nhồi máu cơ <br /> nhồi   máu   cơ   tim   cấp   (AMI),   đau   thắt   ngực <br /> tim   cấp,   đau   thắt   ngực   không   ổn   đinh   và <br /> không   ổn   định   (UA)   và   người   bình   thường <br /> người   bình   thường   khỏe   mạnh   (hình   1)   bao <br /> (Healthy)   tương   ứng   với   133,   162   và   195 <br /> gồm   các   loại   immunoglobin,   các   thành  phần <br /> glycoprotein.   Đáng   chú   ý   chỉ   81  glycoprotein <br /> bổ  thể, các protein liên kết, enzyme, thụ thể... <br /> được phát hiện trong cả  hai thể  bệnh và đối <br /> Phân tích chi tiết, chúng tôi đã xác định được <br /> chứng.<br /> 107 glycoprotein trong cả  người bình thường <br /> và  bệnh  nhân  đau thắt  ngực   không  ổn  định,  <br /> Mục   đích   chính   của   nghiên   cứu   này   là <br /> trong khi  ở  người bình thường và bệnh nhân <br /> nhận   diện   tất   cả   glycoprotein   có   mặt   trong <br /> nhồi máu cơ  tim cấp là 93 glycoprotein và 88  <br /> huyết thanh bệnh nhân ACS gồm nhồi máu cơ <br /> glycoprotein  ở  cả  bệnh nhân nhồi máu cơ  tim <br /> tim cấp và đau thắt ngực không  ổn định. Các <br /> cấp và đau thắt ngực không ổn định, chỉ có 81  <br /> phân đoạn protein thu được bằng sắc ký ái lực  <br /> glycoprotein xác định được trong cả  ba nhóm. <br /> với   con   A   được   thủy   phân   bằng   trypsin   và <br /> Đây là những cơ sở dữ liệu toàn diện đầu tiên <br /> được phân tích bằng sắc ký lỏng ngược pha <br /> về   hệ   glycoprotein   (glycoproteome)   trong <br /> kết nối khối phổ. Dữ liệu phổ được tìm kiếm  <br /> huyết thanh bệnh nhân mắc hội chứng mạch <br /> bằng phần mềm PEAKS v6.0  (Bioinformatics <br /> vành cấp Việt Nam (hình 2).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Phân loại chức năng glycoprotein huyết thanh người bệnh ACS và người bình thường. <br /> Trục X: biểu thị chức năng tham gia trong các quá trình sinh học của glycoprotein.Trục Y: biểu <br /> thị số lượng glycoprotein. (BT: bình thường, ĐT: đau thắt, NM: nhồi máu).<br /> <br /> 154<br />  Việc   nhận   dạng   và   nghiên   cứu   các  gắn vào amino acid Asn trong trình tự Asn­X­<br /> glycoprotein và quá trình glycosyl hóa đóng vai  Ser/Thr (trong đó X có thể  là các amino acid <br /> trò   quan   trọng   trong   nghiên   cứu   các   cơ   chế  khác   trừ   Pro  và   (2)   O­link,   khi   cấu   trúc   các  <br /> phân tử của nhiều quá trình sinh lý và bệnh lý.  phân tử  glycan gắn với nhóm  Ser  hoặc Thr. <br /> Tuy nhiên, công việc này gặp nhiều trở  ngại   Những glycoprotein bình thường cũng như các <br /> do   một   đặc   điểm   quan   trọng   của   các  loại   glycoprotein   bị   biến   đối   bất   thường   từ <br /> glycoprotein là tính chất dị hình. Đặc điểm này  các cơ  quan, mô và tế  bào có thể  đi vào trong <br /> được thể hiện qua sự khác biệt về thành phần   hệ  thống tuần hoàn và trở  thành các chất lưu <br /> cấu trúc giữa các glycoprotein và giữa các phân  chuyển   trong   huyết   thanh,   đồng   thời <br /> tử   đường   trên   cùng   một   loại   glycoprotein   glycoprotein cũng được biết đến là một chất <br /> (glycoform).   Để   khắc   phục,   một   số   tác   giả  chỉ thị tốt cho những tác động của môi trường  <br /> cũng  đã sử  dụng kết hợp con A với các loại  lên các hoạt động nội bào. Vì lý do này, các <br /> lectin   khác   như   agglutinin   từ   mầm   củ   cải  glycoprotein huyết thanh trở  thành đối tượng  <br /> đường   (WGA­Wheat   Germ   Lectin),   Jacalin,   lý thú được sử  dụng trong cả  nghiên cứu và <br /> Lentil lectin (LCA), và lectin dứa (PNA). Tuy   chẩn   đoán   bệnh   [5].   Trong   nghiên   cứu   này, <br /> vậy, cũng chỉ  có rất ít các glycoprotein khác  chúng   tôi   đã   phân   loại   glycoprotein   huyết  <br /> được phát hiện  [8;13]. Wang et al (2006)  đã  thanh bệnh nhân mắc hội chứng mạch vành <br /> nhận diện được 225 protein trong nước tiểu  cấp và người bình thường theo chức năng sinh <br /> người, trong đó 150 protein được chú thích là  học của các glycoprotein bằng cơ  sở  dữ  liệu <br /> glycoprotein trên cơ  sở  dữ  liệu Swiss­Prot và  PANTHER   Version   9.0   (cập   nhật   đến   ngày <br /> 43   protein   dự   đoán   là   glycoprotein   của  20/1/2014)   bao   gồm   7180   họ   proteins   chia  <br /> NetNGlyc 1.0 [17]. Trong một nghiên cứu khác  thành 52768 phân họ  có chức năng riêng biệt. <br /> của Ghosh et al. (2003) [4] sử  dụng sắc ký ái  Như  trên hình 3, chức năng của glycoprotein <br /> lực với chất giá lectin là con A hoặc agglutinin   huyết thanh được chia thành 9 nhóm. Trong đó, <br /> mầm lúa mì để  xác định tỷ trọng glycoprotein  nhóm glycoprotein tham gia vào hoạt động xúc <br /> màng của các dòng tế bào K562. Trong nghiên  tác chiếm tỷ  lệ  cao nhất   AMI (45/133), UA  <br /> cứu   của   chúng   tôi,   biểu   đồ   Venn   được   sử  (60/162) và Healthy (57/195). Tiếp đến, nhóm <br /> dụng để  phân loại các glycoprotein khác biệt  tham gia vào các chức năng: liên kết, điều hòa <br /> chỉ  xuất hiện  ở  bệnh nhân nhồi máu cơ  tim   enzyme,   hoạt   động   của   thụ   thể   (receptor),  <br /> cấp (33 glycoprotein), đau thắt ngực không  ổn  hoạt động vận chuyển, protein cấu trúc, yếu <br /> định (48 glycoprotein) và  người  bình thường  tố  liên kết sao chép ADN và yếu tố  liên kết <br /> (76 glycoprotein). Kết hợp các kết quả  nghiên  phiên   mã   protein   có   tỷ   lệ   thấp   nhất:   AMI <br /> cứu   đã   chỉ   ra   sự   biểu   hiện   của   hàng   chục   (2/133), UA (1/162) và Healthy (2/195).<br /> protein  ở người bệnh có sự  khác biệt đáng kể  Hội chứng mạch vành cấp đã và đang là <br /> so với người thường. Một điểm rất đáng chú  một   trong   những   nguyên   nhân   gây   tử   vong <br /> ý, ở trường hợp bệnh lý sự biểu hiện của hầu   hàng đầu trên toàn thế giới. Do vậy, phát triển <br /> hết các glycoprotein này bị giảm đi đáng kể so  các nghiên cứu tìm kiếm chỉ thị trong giai đoạn <br /> với bình thường [9]. đầu vừa mang tính cấp thiết, vừa mang tính <br /> Mô tả chức năng của hệ glycoprotein chiến lược lâu dài. Khoa học proteomics ngày <br /> Glycosyl hóa là một trong các cải biến sau  nay cho phép phân tích và nhận dạng toàn bộ <br /> phiên mã phổ  biến trong quá trình hiểu hiện  mức độ  biểu hiện của các protein trong bệnh  <br /> protein,   đảm   bảo   protein   có   cấu   trúc   hoàn  tim mạch và sẽ cung cấp những hiểu biết mới  <br /> chỉnh   và   hoạt   tính   đầy   đủ.   Có   hai   dạng  về  cơ  chế  điều hòa tế  bào liên quan đến rối <br /> glycosyl hóa (1) N­link, cấu trúc glycan được  loạn chức năng trong bệnh tim [6, 9]. <br /> <br /> <br /> 155<br />  Do Huu Chi et al.<br /> <br /> Trong nghiên cứu, chúng tôi phát hiện một  Lời cảm  ơn: Công trình này được hoàn thành <br /> số  glycoprotein có mặt trong huyết thanh cả  với   sự   hỗ   trợ   về   kinh   phí   của   đề   tài <br /> bệnh nhân nhồi máu cơ  tim cấp và đau thắt   KC04/2011/PTNTĐ/HĐ­ĐTĐL   (2011­2014): <br /> ngực không ổn định, trong khi không xuất hiện  “Tìm kiếm các chỉ  thị  sinh học liên quan hội <br /> trong huyết thanh người bình thường bao gồm  chứng   mạch   vành   cấp   bằng   các   kỹ   thuật <br /> các protein: Uncharacterized protein C18orf63,  proteomics” và đề  tài cấp Viện Hàn lâm Khoa <br /> Fibrinogen alpha chain, Fibrinogen beta chain,  học và Công nghệ  Việt Nam VAST02.01/14­<br /> Fibrinogen gamma chain, Ig gamma­3 chain C  15: “Nghiên cứu đa hình gen/protein MMP­9 và <br /> region, Killer cell immunoglobulin­like receptor  đánh giá khả năng ứng dụng trong chuẩn đoán <br /> 3DL3,   Ig   lambda   chain   V­I   region   WAH,  sớm hội chứng mạch vành cấp”. <br /> Membrane   frizzled­related   protein,   Multidrug <br /> resistance­associated   protein   7,   Zinc­alpha­2­ TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> glycoprotein. 1. Butler   M.,   Quelhas   D.,   Critchley   A.   J., <br /> Các nghiên cứu quan sát tiên lượng cùng  Carchon H., Hebestreit H. F., Hibbert R. G., <br /> với các nghiên cứu dịch tễ học đã chứng minh  Vilarinho L., Teles E., Matthijs G., Schollen <br /> rằng nồng độ  Fibrinogen có thể  tiên đoán về  E., Argibay P., Harvey D. J., Dwek R. A., <br /> nguy cơ của bệnh động mạch vành [7]. Protein  Jaeken J., and Rudd P. M., 2003. Detailed <br /> này đóng vai  trò quan trọng trong nhiều quá  glycan   analysis   of   serum   glycoproteins   of <br /> trình sinh học như  hoạt hóa tiểu cầu, quyết   patients   with   congenital   disorders   of <br /> định độ  nhớt của huyết tương và hình thành  glycosylation   indicates   the   specific <br /> sợi fibrin trong quá trình đông máu (yếu tố I).   defective   glycan   processing   step   and <br /> Fibrinogen còn là một chất phản ứng giai đoạn  provides   an   insight   into   pathogenesis. <br /> cấp  tính,   có nghĩa  là   nồng  độ   Fibrinogen  có  Glycobiology, 13: 601­622.<br /> thể  tăng mạnh trong bất kỳ  nguyên nhân gây <br /> 2. Cubedo   J.,   Padró   T.,   García   M.,   Xavier., <br /> viêm hoặc tổn thương mô. Trong nghiên của <br /> Pintó   X.,  Cinca   J.,   Badimon   L.,   2011. <br /> chúng tôi phát hiện cả ba chuỗi của Fibrinogen <br /> Serum   proteome   in   acute   myocardial <br /> (alpha, beta, gamma chains) trong huyết thanh <br /> infarction.   Publicado   en.   Clin.   Invest <br /> bệnh nhân nhồi máu cơ  tim cấp và đau thắt  <br /> Arterioscl, 23(4): 147­154.<br /> ngực không ổn định mà không được phát hiện <br /> ở  người bình thường khỏe mạnh. Khi lượng  3. Dennis   J.   W.,   Nabi   I.   R.,   Demetriou   M., <br /> Fibrinogen trong huyết thanh tăng cao thì nguy  2009. Metabolism, cell surface organization, <br /> cơ   phát   triển   một   cục   máu   đông   của   một  and disease. Cell, 139: 1229­1241. <br /> người có thể  tăng lên và theo thời gian nó có   4. Ghosh D., Krokhin O., Antonovici M., Ens <br /> thể góp phần làm tăng nguy cơ phát triển bệnh  W., Standing K. G., Beavis R. C., Wilkins J. <br /> hội chứng mạch vành cấp. A., 2004.  Lectin Affinity as an Approach to <br /> the   Proteomic   Analysis   of   Membrane <br /> KẾT LUẬN<br /> Glycoproteins. J. Proteome Res, 3(4): 841­<br /> Sử dụng các kỹ thuật proteomics, chúng tôi  850.<br /> đã   nhận  diện   được   133   glycoprotein  ở   mẫu   5. Heo S. H., Lee S. J., Ryoo H. M., Park J. Y., <br /> nhồi máu cơ  tim cấp, 162 glycoprotein  ở mẫu   Cho J. Y.,  2007.  Identification of putative <br /> đau   thắt   ngực   không   ổn   định   và   195  serum   glycoprotein   biomarkers   for   human <br /> glycoprotein   người   bình   thường   khỏe   mạnh.   lung   adenocarcinoma   by   multi­lectin <br /> Các glycoprotein này được phân nhóm và xây  affinity   chromatography   and   LC­MS/MS. <br /> dựng cơ sở dữ liệu. Đáng lưu ý, Fibrinogen có  Proteomics, 7(23): 4292­4302.<br /> thể  là protein chỉ  thị  tiềm năng cho bệnh hội <br /> chứng mạch vành cấp. 6. Huillet C., Adrait A., Lebert D., Picard G., <br /> Trauchessec M.,  Louwagie M., Dupuis A., <br /> <br /> 156<br />  Hittinger   L.,   Ghaleh   B.,   Corvoisier   P.   L.,  X.,   Zhang   W.   W   and   Smith   R.   D.,   2008. <br /> Jaquinod M., Garin J., Bruley C., and Brun  Enhanced   Detection   of   Low   Abundance <br /> V.,   2012.  Accurate   Quantification   of  Human   Plasma   Proteins   Using   a   Tandem <br /> Cardiovascular Biomarkers in Serum Using  IgY12­SuperMix   Immunoaffinity <br /> Protein   Standard   Absolute   Quantification  Separation Strategy. Mol. Cell Proteomics, <br /> (PSAQ™)   and   Selected   Reaction  7: 1963­1973.<br /> Monitoring.   Mol.   Cell   Proteomics,  13. Tang J., Liu Y., Yin P.,  Yao G., Yan G., <br /> 11(2):M111.008235.  Deng C., Zhang X., 2010. Concanavalin A­<br /> 7. Lovely R. S., Kazmierczak S. C., Massaro J.  immobilized   magnetic   nanoparticles   for <br /> M., D'Agostino R. B. Sr., O'Donnell C. J.,  selective   enrichment   of   glycoproteins   and <br /> Farrell   D.   H.,   2010.   Gama′   fibrinogen:   application   to   glycoproteomics   in <br /> evaluation   of   a   new   assay   for   study   of  hepatocelluar   carcinoma   cell   line. <br /> associations   with   cardiovascular   disease.  Proteomics, 10(10): 2000­2014.<br /> Clin. Chem, 56(5): 781­788.  14. Vũ Minh Thiết, Trần Thế Thành, Nguyễn <br /> 8. McDonald C. A., Yang J. Y., Marathe V.,  Thị   Minh   Phương,   Phan   Văn   Chi.   2006. <br /> Yen T. Y., Macher B. A ., 2009. Combining  Phân   tích   các   glycoprotein   trong   huyết <br /> Results   from   Lectin   Affinity  thanh người. Tạp chí Công nghệ sinh học,  <br /> Chromatography   and   Glycocapture  4(1):13­22.<br /> Approaches   Substantially   Improves   the  15. Tran T. T., Nguyen T. M. P., Nguyen B. N., <br /> Coverage of the Glycoproteome. Mol. Cell  Phan   V.   C.,   2008.   Changes   of   Serum <br /> Proteomics, 8(2): 287­301.  Glycoproteins   in   Lung   Cancer   Patients.   J. <br /> 9. McGregor E., Dunn M. J., 2003. Proteomics  Proteomics Bioinform, 1: 11­16.<br /> of heart disease. Hum. Mol. Genet, 12 Spec  16. Vlahou   A.,   Fountoulakis   M.,   2005. <br /> No 2: R135­144. Proteomic   approaches   in   the   search   for <br /> 10. Mendis   S.,   Puska   P.,   Norrving   B.,   2011.  disease   biomarkers.   J.   Chromatogr   B, <br /> Global   Atlas   on   cardiovascular   disease  814(1): 11­19.<br /> prevention   and   control,   ISBN   978­92­4­ 17. Wang L., Li F., Sun W., Wu S., Wang X., <br /> 156437­3. Zhang   L.,   2006.  Concanavalin   A­captured <br /> 11. Nagae  M.,   Yamaguchi   Y.,   2012.   Function  Glycoproteins   in   Healthy   Human   Urine. <br /> and   3D   Structure   of   the   N­Glycans   on  Mol. Cell Proteomics, 5(3): 560­562. <br /> Glycoproteins.   Int.   J.   Mol.   Sci,   13:   8398­ 18. Yang N., Feng S., Shedden K., Xie X., Liu <br /> 8429. Y., Rosser C. J., Lubman D. M., Goodison <br /> 12. Qian W. J., Kaleta D. T., Petritis BO., Jiang  S.,   2011.   Urinary   glycoprotein   biomarker <br /> H.,   Liu   T.,  Zhang   X.,   Mottaz   H.   M.,  discovery for bladder cancer detection using <br /> Varnum S. M., Camp D. G., Huang L., Fang  LC/MS­MS   and   label­free   quantification. <br /> Clin. Cancer Res, 17(10): 3349­3359.<br /> <br /> <br /> <br /> IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF HUMAN SERUM <br /> GLYCOPROTEIN IN ACUTE CORONARY SYNDROMES <br /> <br /> Do Huu Chi1, Nguyen Tien Dung1, Pham Duc Dan1, Le Thi Bich Thao1, <br /> Do Doan Loi2, Nguyen Bich Nhi1, Phan Van Chi1<br /> <br /> <br /> <br /> 157<br />  Do Huu Chi et al.<br /> <br /> 1<br /> Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology<br /> 2<br /> Vietnam National Heart Institute, Bach Mai Hospital<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Acute   myocardial   infarction   (AMI)   which   consider   final   dangerous   complication   of   acute   coronary <br /> syndrome,   occurs   suddenly   with   high   rate   of   mortality   and   sequel   in   the   case   of   extreme   emergency.  <br /> Therefore,   the   mining   of   biomarker   for   ACS   diagnosis   is   urgently   needed.   In   the   serum,   glycoproteins <br /> involve in many  biological processes and are potential markers for diagnosis and treatment. In this study, we  <br /> identified the serum glycoproteins in ACS patients and healthy using proteomics techniques such as affinity <br /> chromatography by Concanavalin A, SDS­PAGE and two­dimensional nano liquid chromatography coupled <br /> online   with   tandem   mass  spectrometry   (2D­NanoLC­ESI­MS/MS).   The   glycoproteins   were   characterized <br /> using bioinformatics tools including PEAKS v6.0 and online PANTHER softwares. The results showed that <br /> 133, 162 and 195 serum glycoproteins were identified in AMI, UA patients and healthy samples, respectively. <br /> Characterization   of   the   identified   glycoproteins   such   as   functions   were   categorized   into   groups   such   as <br /> catalytic, enzyme regulator, receptor, structural molecular, transporter activity and binding. It is notable that, <br /> Fibrinogen, a widely used potential biomarker of ACS was detected in all AMI and UA samples whereas not <br /> detected in healthy samples.<br /> Key words: Acute coronary syndrome, glycoprotein, proteomics, NanoLC­MS/MS.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 158<br />