Phân biệt sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và H.pumilio với các loại sán lá khác sử dụng chỉ thị ITS-2 (internal transcribed spacer)

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

94
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sán lá ruột nhỏ (Haplorchis spp.) thuộc họ Heterophyidae th-ờng ký sinh trong ruột non của ng-ời, gia súc và gia cầm (Yamaguti, 1958; Pear, 1964; Cheng, 1974; Pearson, 1982). Ng-ời và các động vật trên cạn nhiễm loài sán này do ăn gỏi, ăn lẩu hoặc ăn cá sống có chứa ấu trùng metacercariae. Ng-ời và động vật trên cạn nhiễm sán lá ruột nhỏ với số l-ợng lớn th-ờng có biểu hiện đau đầu, buồn nôn, viêm ruột và ỉa chảy. Tác hại trực tiếp của loài sán này đối với ng-ời và động vật không lớn nh-ng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân biệt sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui và H.pumilio với các loại sán lá khác sử dụng chỉ thị ITS-2 (internal transcribed spacer)

Ph©n biÖt s¸n l¸ ruét nhá Haplorchis taichui vµ H. pumilio víi c¸c loµi s¸n l¸ kh¸c sö dông chØ thÞ ITS-2 (Internal Transcribed Spacer) Discrimination of tiny trenmatodes (Haplorchis taichui and H. pumilio) to other species using ITS-2 (Internal Transcribed Spacer) markers Kim V¨n V¹n1,3, Lª Thanh Hßa2, NguyÔn ThÞ BÝch Nga2, NguyÔn ThÞ TuyÕt Nhung2 v Anders Dalgaard3 SUMMARY Haplorchis spp are tiny trematodes can be found in the small intestines of various definitive hosts such as human, birds, cats, dogs and rats. Human and other definitive hosts are infected by eating raw freshwater fishes containing encysted metacercariae. Haplorchis spp. is not easy to discriminate from other trematodes due to their minute size, similar morphology of eggs, cercaria, metacercaria and adult worm. A molecular method, for the first time in Vietnam, was applied to identify H. pumilio and H. taichui based on amplification of ITS-2 using forward primer, 3SF: 5’-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3’ and reverse primer BD2R: 5'- TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3-BD2R) with annealing at 50oC in the polymerase chain reaction (PCR) and sequencing for analyzing the nucleotide composition. Samples including adult worm and metacercariae were collected on human and fish in NamDinh province, Vietnam and Bangkok, Thailand. The length of ITS-2 specific for H. taichui is 446bp; and for H. pumilio is 290bp. ITS-2 sequence in H. taichui was found longer than that in H. pumilio, due to the insertion of 154 nucleotides between nucleotide 198 and 352. There was high identity rate (99- 100%) of nucleotides in the ITS-2 gene in H. taichui and H. pumilii of Vietnamese and Thai collected sample, respectively. Key words: Haplorchis spp, H. taichui, H. pumilio, PCR, identity. 1. §Æt vÊn ®Ò x©m nhËp v o c¬ thÓ. Haplorchis spp. l lo¹i ký sinh trïng g©y ra bÖnh truyÒn l©y gi÷a S¸n l¸ ruét nhá (Haplorchis spp.) thuéc ®éng vËt d−íi n−íc (c¸) v ®éng vËt trªn c¹n hä Heterophyidae th−êng ký sinh trong ruét (Fish-born parasites, FZP). Khi c¸ nhiÔm c¸c non cña ng−êi, gia sóc v gia cÇm (Yamaguti, lo¹i Êu trïng n y th−êng bÞ gi¶m chÊt l−îng 1958; Pear, 1964; Cheng, 1974; Pearson, s¶n phÈm v gi¶m gi¸ trÞ h ng ho¸, ®Æc biÖt 1982). Ng−êi v c¸c ®éng vËt trªn c¹n nhiÔm khi s¶n phÈm thñy s¶n ®−îc xuÊt khÈu sang lo i s¸n n y do ¨n gái, ¨n lÈu hoÆc ¨n c¸ sèng c¸c thÞ tr−êng khã tÝnh nh− ch©u ¢u, Mü v cã chøa Êu trïng metacercariae. Ng−êi v NhËt B¶n. ®éng vËt trªn c¹n nhiÔm s¸n l¸ ruét nhá víi sè l−îng lín th−êng cã biÓu hiÖn ®au ®Çu, Trong mét tÕ b o cña c¬ thÓ ®éng vËt buån n«n, viªm ruét v Øa ch¶y. T¸c h¹i trùc lu«n tån t¹i 2 hÖ gen: hÖ gen nh©n tÕ b o v hÖ tiÕp cña lo i s¸n n y ®èi víi ng−êi v ®éng gen ty thÓ, hai hÖ gen n y ho¹t ®éng cã tÝnh vËt kh«ng lín nh−ng khi s¸n ký sinh t¹o c¸c chÊt võa ®éc lËp võa t−¬ng t¸c v hÖ gen ty thÓ vÕt loÐt l cöa ngâ cho c¸c t¸c nh©n kh¸c chÞu ¶nh h−ëng ®iÒu hßa cña hÖ gen nh©n tÕ 1 Khoa Ch¨n nu«i - Thuû s¶n, Tr−êng §H N«ng nghiÖp I 2 ViÖn C«ng nghÖ sinh häc, ViÖn Khoa häc v C«ng nghÖ ViÖt Nam 3 Khoa BÖnh häc Thó Y, Tr−êng §H Thó Y v N«ng nghiÖp §an M¹ch.
T¹p chÝ KHKT N«ng nghiÖp 2007: TËp V, Sè 1: 36-42 §¹i häc N«ng nghiÖp I b o. HÖ gen nh©n tÕ b o cã hÖ sè ®ét biÕn thÊp thùc hiÖn x¸c ®Þnh, thÈm ®Þnh lo i v ph©n h¬n hÖ gen ty thÓ. BÊt kÓ sù thay ®æi n o cña biÖt chóng víi c¸c lo i s¸n l¸ kh¸c. c¸c gen còng cã thÓ dÉn ®Õn sù biÕn ®æi hÖ Trong b i b¸o n y, chóng t«i chñ yÕu tËp gen cã tÝnh chÊt ®Æc tr−ng cña lo i. HÖ gen trung nghiªn cøu gen ITS-2 nh»m môc ®Ých nh©n chiÒu h−íng b¶o tån rÊt cao v cã gi¸ trÞ gi¸m ®Þnh ph©n tö 2 lo i s¸n l¸ ruét nhá nãi trong gi¸m ®Þnh. Trong nh©n tÕ b o cã mét nhãm gen quan träng l 5,8S; 18S; 28S v trªn, so s¸nh ®Æc ®iÓm cña gen n y trong c¸c vïng nucleotide nèi gi÷a c¸c gen ®ã l ITS-1 lo i s¸n l¸ truyÒn l©y gi÷a c¸ - ®éng vËt trªn v ITS-2 (Internal transcribed spacer) ®−îc c¹n v x©y dùng c©y ph¶ hÖ t×m mèi liªn quan dïng trong ph©n tÝch ph©n lo¹i (Lª Thanh gi÷a s¸n l¸ ruét nhá Haplorchis víi c¸c lo i Hßa, 2002) (H×nh 1). s¸n l¸ truyÒn l©y kh¸c. Haplorchis l mét lo i s¸n l¸ ruét nhá ®Ó 2. Nguyªn liÖu v ph−¬ng ph¸p ho n th nh vßng ®êi chóng ph¶i tr¶i qua nhiÒu lo i vËt chñ phøc t¹p (vËt chñ chÝnh, vËt chñ nghiªn cøu trung gian) nªn th−êng Ýt ®−îc quan t©m (kÓ 2.1. MÉu v nguån gèc mÉu c¶ y tÕ, thó y, ng− y). Do kÝch th−íc rÊt nhá, h×nh d¹ng cña trøng, Êu trïng (cecaria, MÉu s¸n l¸ ruét nhá tr−ëng th nh v Êu metacercaria) v kÓ c¶ d¹ng tr−ëng th nh rÊt trïng (metacercariae) cña Haplorchis ®−îc gièng víi h×nh d¹ng cña mét sè lo i s¸n l¸ c¸c ®èi t¸c tham gia dù ¸n FIBOZOPA cung kh¸c nªn rÊt dÔ chÈn ®o¸n nhÇm (Tesana v cÊp: ViÖn Sèt rÐt-Ký sinh trïng-C«n trïng cs., 1991). Nghiªn cøu øng dông sinh häc trung −¬ng (NIMPE), ViÖn Nghiªn cøu Nu«i ph©n tö ®èi víi c¸c bÖnh ký sinh trïng truyÒn trång Thñy s¶n 1 (RIA1). Nguån mÉu n y l©y nh»m kh¾c phôc nh÷ng tån t¹i cña c¸c ®−îc thu tõ ng−êi nhiÔm s¸n l¸ ruét nhá v c¸ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu cæ truyÒn l h−íng nhiÔm Êu trïng s¸n l¸ ruét nhá vïng Nam míi ®−îc quan t©m trong nhiÒu n¨m qua ë §Þnh (b¶ng 1). n−íc ta. MÆc dï cã nhiÒu nghiªn cøu sinh häc MÉu s¸n (c¶ Êu trïng v s¸n tr−ëng th nh ph©n tö trong gi¸m ®Þnh ph©n lo¹i ph¶ hÖ v cña s¸n l¸ ruét nhá Haplorchis taichui v H. dÞch tÔ häc ph©n tö mét sè s¸n l¸, s¸n d©y ë pumilio) ® ®−îc x¸c ®Þnh h×nh th¸i chuÈn do ViÖt Nam, nh−ng cho ®Õn nay ®èi víi Khoa Ký sinh trïng, Tr−êng §¹i häc Mahidol, Haplorchis, rÊt Ýt nghiªn cøu ®Ò cËp ®Õn. Víi B¨ng Cèc, Th¸i Lan cung cÊp. sù gióp ®ì cña dù ¸n FIBOZOPA (Fishborne Zoonotic Parasites: dù ¸n ký sinh trïng truyÒn MÉu s¸n v Êu trïng s¸n ®−îc l−u gi÷ l©y gi÷a ®éng vËt thñy sinh, ®éng vËt trªn c¹n trong cån 70o v b¶o qu¶n l¹nh cho ®Õn khi kÓ c¶ ng−êi) ® t¹o ®iÒu kiÖn cho chóng t«i sö dông. Intergenic spacer (IGS) ITS-2 28S 18S 18S 11 5.8S 2 1 5.8S 28S 18S 18S Internal transcribed spacer (ITS) External transcribed spacer (ETS) H×nh 1. Vïng gen ribosom cña hÖ gen nh©n tÕ b o (18S-5,8S-28S) v ®iÓm b¸m måi (3SF-BD2R) nh©n ®o¹n gen ITS-2
B¶ng 1. Danh s¸ch mÉu, nguån gèc cña mÉu trong nghiªn cøu v nguån gen tham kh¶o Lo i s¸n Ký hiÖu mÉu Lo¹i mÉu (ADN) Nguån mÉu Ký chñ Nguån gen ITS-2 H.pumilio Hpu (TL1) S¸n tr−ëng th nh Th¸i Lan Ng−êi Ando v cs., 2001 H.pumilio HpM (TL) Metacercaria Th¸i Lan C¸ Nghiªn cøu n y Haplorchis sp. HspMND (VN) Metacercaria ViÖt Nam C¸ Nghiªn cøu n y H. pumilio Hpu (AY245706) Dzikowski v cs., 2004; AY245706 Haplorchis sp. HspND (VN) S¸n tr−ëng th nh ViÖt Nam Ng−êi Nghiªn cøu n y Haplorchis sp. HspNDV (VN) S¸n tr−ëng th nh ViÖt Nam Ng−êi Nghiªn cøu n y H. taichui Hta (TL1) S¸n tr−ëng th nh Th¸i Lan Ng−êi Ando v cs., 2001 Haplorchis sp. HspMND2 (VN) Metacercaria ViÖt Nam C¸ Nghiªn cøu n y H. taichui Hta (AY245705) Dzikowski v cs., 2004; AY245705 O. viverrini Ovi (AY584735) Sanath v cs., 2004; AY584735 O. viverrini Ovi (TL1) S¸n + Êu trïng Th¸i Lan Ng−êi Ando v cs., 2001 C. sinensis Csi (SKR) Lee v cs., 1999; AF217095 2.2. Ph©n tÝch ITS-2 Ph¶n øng PCR tiÕn h nh víi dung tÝch l 50 ml (25 ml PCR master mix, 2 ml primer Qu¸ tr×nh ph©n tÝch sinh häc ph©n tö ®−îc (10 pmol/ml), 4 ml khu«n v 17 ml n−íc) v thùc hiÖn t¹i Phßng thÝ nghiÖm MiÔn dÞch häc, kiÓm tra s¶n phÈm trªn th¹ch agarose 1%. ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Khoa häc v C«ng nghÖ ViÖt Nam (H Néi). S¶n phÈm PCR ®−îc tinh s¹ch b»ng bé QIAquick Purification kit (QIAGEN Inc.) v MÉu s¸n l¸ ruét nhá tr−ëng th nh v Êu ®−îc dßng hãa v o vector pCR2.1TOPO (TA- trïng s¸n ®−îc t¸ch chiÕt ADN tæng sè b»ng QIAamp DNA kit (QIAGEN Inc., USA). cloning kit, h ng Invitrogen). Sau khi t¸ch dßng, ADN plasmid t¸i tæ hîp ®−îc gi¶i tr×nh Sau khi thu ®−îc ADN tæng sè, tiÕn h nh tr×nh tù trªn m¸y ABI-3100 Avant Genetic thùc hiÖn ph¶n øng PCR víi chu tr×nh nhiÖt: Analyzer t¹i ViÖn C«ng nghÖ sinh häc. Chuçi NhiÖt ®é ®Ó bung liªn kÕt l 94oC trong 1 phót, nucleotide ®−îc xö lý b»ng ch−¬ng tr×nh nhiÖt ®é b¸m måi l 50oC trong 1 phót, nhiÖt SeqEd1.03, sau ®ã so s¸nh sö dông ch−¬ng ®é cung cÊp cho qu¸ tr×nh tæng hîp chuçi ADN l 72oC trong vßng 2 phót. To n bé qu¸ tr×nh AssemblyLIGN v1.9c v MacVector8.2 tr×nh thùc hiÖn ph¶n øng PCR l 35 chu kú (Lª (Accelrys Inc.) trªn m¸y tÝnh Macintosh. So Thanh Hßa v cs., 2002). s¸nh tr×nh tù chuçi ITS-2 cña mÉu nghiªn cøu víi tr×nh tù gen ITS-2 cña H. taichui v H. Måi ®Ó thùc hiÖn ph¶n øng: måi xu«i 3SF pumilio tõ Ng©n h ng gen, tõ t i liÖu tham (5’-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG- 3') v måi ng−îc BD2R (5'- kh¶o (Ando v cs., 2001) v so s¸nh víi gen TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3'). §©y l ITS-2 cña mét sè lo¹i s¸n l¸ truyÒn l©y kh¸c måi chung cho ph©n tÝch gen ITS-2 cña c¸c (b¶ng 1). C¸c ch−¬ng tr×nh GENEDOC2.5 v lo i s¸n l¸ (Bowles v cs., 1995). S¬ ®å hÖ gen MEGA3.1 ®−îc sö dông ®Ó ph©n tÝch v so nh©n, ®iÓm b¸m måi v måi dïng ®−îc m« s¸nh vÒ th nh phÇn nucleotide (Nicholas v pháng ë h×nh 1. Nicholas, 1999; Kumar v cs., 2004).
3. KÕt qu¶ v th¶o luËn C¸c mÉu s¸n ruét nhá v Êu trïng cña chóng thu ®−îc tõ ng−êi v c¸ ë ViÖt Nam bao gåm 3.1. S¶n phÈm PCR vïng ITS-2 mÉu HspMND2(VN) cã ®é d i gen ITS-2 l 446 bp, t−¬ng ®−¬ng ITS-2 cña H. taichui; v M 1 2 3 4 5 mÉu HspMND(VN) cã ®é d i gen ITS-2 l 290 bp, t−¬ng ®−¬ng gen ITS-2 cña H. pumilio. 3.3. So s¸nh sù t−¬ng ®ång cña nucleotide trong gen ITS-2 So s¸nh gi÷a c¸c mÉu s¸n v Êu trïng thu ®−îc ë ViÖt Nam víi H. taichui v H. pumilio cña Th¸i Lan v so s¸nh víi mét sè s¸n l¸ truyÒn l©y kh¸c nh− s¸n l¸ gan nhá (C. sinensis 0,6 kb v O. viverrini) vÒ møc ®é t−¬ng ®ång c¸c 0,4 kb nucleotide ®−îc thÓ hiÖn trong b¶ng 2. Ph©n tÝch sù t−¬ng ®ång nucleotide vïng H×nh 2. S¶n phÈm PCR vïng gen ITS-2 trªn gen ITS-2 cña c¸c mÉu nghiªn cøu v mét sè th¹ch agarose 1%. M: chØ thÞ ADN (Lamda c¾t mÉu trong ng©n h ng gen cho thÊy gi÷a mÉu b»ng HindIII); 1: Hta(TL), mÉu H. taichui cña H.pumilio ((HpuM(TL) nguån gèc tõ Th¸i Th¸i Lan; 2: HpM(TL), mÉu metacercaria H. Lan) ph©n tÝch ë nghiªn cøu n y v mÉu cña pumilio cña Th¸i Lan; 3: HspMND(VN), mÉu Ando v cs (2001) (tõ Th¸i Lan) cã sù t−¬ng metacercaria Haplorchis sp. thø nhÊt cña ViÖt ®ång nucleotide cña gen ITS-2 l 96% v gi÷a Nam; 4: HspND(VN), mÉu Haplorchis sp. cña mÉu HspMND(VN) víi mÉu H.pumilio cña ViÖt Nam; 5: HspMND2(VN), mÉu metacercaria Th¸i Lan trong nghiªn cøu n y HpuM(TL) v Haplorchis sp. thø 2 cña ViÖt Nam mÉu ph©n tÝch cña Ando (2001) cã sù t−¬ng ®ång nucleotide t−¬ng øng l 99 v 96%. KÕt qu¶ cho thÊy cã sù sai kh¸c vÒ chiÒu Trong khi ®ã sù t−¬ng ®ång nucleotide trong d i cña vïng gen ITS-2 gi÷a c¸c mÉu c¸c mÉu H.pumilio cña Th¸i Lan v c¶ mÉu Haplorchis sp. thu ®−îc ë ViÖt Nam v gi÷a HspMND(VN) so víi Hpu (AY245706) tõ mÉu H. taichui v H. pumilio cña Th¸i Lan ng©n h ng gen chØ ®¹t 94%. Møc ®é t−¬ng (mÉu ® ®−îc x¸c ®Þnh h×nh th¸i häc). §é d i ®ång nucleotide gi÷a c¸c mÉu (1-4) ®¹t tû lÖ cña vïng gen ITS-2 giíi h¹n gi÷a cÆp måi t−¬ng ®èi cao (94-99%) tû lÖ n y ph¶n ¸nh (3SF v BDR) cña H. taichui kho¶ng 0,6 kb v t−¬ng ®ång th−êng thÊy ë trong mét lo i. Nh− cña H. pumilio kho¶ng 0,4 kb. MÉu s¸n vËy cã thÓ kÕt luËn mÉu HspMND (VN) cña Haplorchis sp. cña ViÖt Nam còng cã ®é d i ViÖt Nam l H. pumilio. vïng gen ITS-2 t−¬ng tù nh− mÉu s¸n cña §èi víi mÉu H. taichui cã nguån gèc Th¸i Lan (h×nh 2). Th¸i Lan trong nghiªn cøu n y Hta (TL) víi mÉu Hta (TL1) trong nghiªn cøu cña Ando 3.2 Tr×nh tù vïng gen ITS-2 n¨m 2001 cho thÊy cã sù t−¬ng ®ång So s¸nh tr×nh tù nucleotide c¸c mÉu nucleotide l 99%. Trong khi ®ã mÉu nghiªn cøu ®−îc tr×nh b y ë h×nh 3. KÕt qu¶ HspMND2 (VN) cã sù t−¬ng ®ång rÊt cao tõ gi¶i tr×nh tù cho thÊy cã sù sai kh¸c vÒ ®é d i 99-100% so víi mÉu H. taichui cña Th¸i Lan gen ITS-2 gi÷a H. taichui v H.pumilio. §èi v cã sù t−¬ng ®ång rÊt thÊp víi c¸c mÉu H. víi H. taichui, gen ITS-2 cã ®é d i l 445-446 pumilio chØ ®¹t tõ 52-54%, v ®©y l møc ®é bp cßn ®èi víi mÉu s¸n H. pumilio l 290 bp. t−¬ng ®ång th−êng thÊy ë 2 lo i kh¸c nhau. V× Gen ITS-2 cña H. taichui d i h¬n H. pumilio vËy cã thÓ kÕt luËn mÉu HspMND2 (VN) cña do cã mét ®o¹n 154 nucleotide tõ nucleotide ViÖt Nam l H. taichui. thø 198 ®Õn nucleotide 352 ®−îc chÌn v o §èi víi mÉu ký hiÖu HspNDV (VN) khi (h×nh 3). Sù sai kh¸c nhiÒu vÒ tr×nh tù s¾p xÕp ph©n tÝch sù t−¬ng ®ång nucleotide vïng gen c¸c nucleotide gi÷a H. taichui v H. pumilio ITS-2 cho thÊy t−¬ng ®ång tuyÖt ®èi 100% so chñ yÕu x¶y ra ë c¸c vÞ trÝ sau ®o¹n chÌn, cßn víi O. viverrini tõ ng©n h ng gen. Lª Thanh c¸c vÞ trÝ tr−íc ®o¹n chÌn cã sù t−¬ng ®ång lín. Hßa v cs (2003) cho r»ng s¸n l¸ gan nhá O.
viverrini chñ yÕu ph©n bè ë vïng Nam Trung Nam §Þnh. §iÒu n y cho thÊy cÇn thiÕt cã bé v phÝa Nam, nh−ng mÉu HspNDV (VN) nghiªn cøu bæ sung vÒ nguån gèc ®Ó cã kÕt ®em ph©n tÝch ë ®©y l¹i ®−îc t×m thÊy ë vïng luËn ch¾c ch¾n h¬n. * 20 * 40 * 60 * 80 * 100 Hpu(TL1) : TTATAAACTATCACGACGCCCAAATAGTCGTGGCTTGGGTCTTGCCAGCTGGCGTGATTTC--C------TTGTGC-TAT-TGCATGGGGTGCCAGATCA : 90 HpuM(TL) : ...............G........A....................................--.------......-...-................... : 90 Hpu(AY2457 : .........G.....G........A....................................--.------......-...-C......A........... : 90 HspMND(VN) : ...............G........A....................................--.------......-...-................... : 90 HspND(VN) : .............................................................--.------......-.T.-.....A............T : 90 HspNDV(VN) : ........................A............................A.......--.------CC.C..-A..-..TG.........G....T : 90 Hta(TL1) : .............................................................--.------......-.T.-.....A............T : 90 Hta(TL) : .............................................................--.------......-.T.-.....A............T : 90 HspMND2(VN : .............................................................--.------......-.T.-.....A............T : 90 Hta(AY2457 : ........................A...............T...............G....--.------....AG-GT.-.CT...A........T..T : 90 Ovi(TL)AY5 : ........................A............................A.......--.------CC.C..-A..-..TG.........G....T : 90 Ovi(TL1) : ........................A............................A.......--.------CC.C..-A..-..TG.........G....T : 90 Csi(SKR) : ........................A............................A.......CC.ACACAA.....TG...G..TG.........G....T : 100 * 120 * 140 * 160 * 180 * 200 Hpu(TL1) : ATGGCTTCTCCCTAATGTGCCGAACGCAACCATGTCTGGGTTGA----ATGCCTGGATGAGGGGGTGGCGGCGGAGTCGTGGCTCAATTTATGTAT---- : 182 HpuM(TL) : ............................................----...........................A............--T.A.G.AT-- : 182 Hpu(AY2457 : G...........................................----.............A.....................G..........G.TT-- : 184 HspMND(VN) : ............................................----........................................--T.A.G.AT-- : 182 HspND(VN) : ............................................----C....C........AA.G......................GGT.A...AT-- : 184 HspNDV(VN) : .......T....C.........G.................C...----C.....A..................................GT...TA---- : 182 Hta(TL1) : .......T..............G..............T..C...----CG............AA........................GA.AA.-.GTCC : 185 Hta(TL) : .......T..............G..............T..C...----CG............AA........................GA.AA.-.GTCC : 185 HspMND2(VN : .......T..............G..............T..C...----CG............AA........................GA.AA.-.GTCC : 185 Hta(AY2457 : G......TC.............G..........TA.....C...TGGA.G..........ATCTA...T...................AAT.A------- : 183 Ovi(TL)AY5 : .......T....C.........G.................C...----C.....A..................................GT...TA---- : 182 Ovi(TL1) : .......T....C.........G.................C...----C.....A..................................GT...TA---- : 182 Csi(SKR) : .......T....C.........G.................C...----C.....A..................................GT...------ : 190 * 220 * 240 * 260 * 280 * 300 Hpu(TL1) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - HpuM(TL) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Hpu(AY2457 : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - HspMND(VN) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - HspND(VN) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - HspNDV(VN) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Hta(TL1) : GCGCGCTCCAAAGCTTAACCTCTGTCTGGGCTGACGGCTTGGATGAGGAAGTGGCGGCGGAGTCGTGGCTCAATGAAAATTGTGCGCGCTCCAAAGCTTA : 285 Hta(TL) : GCGCGCTCCAAAGCTTAACCTCTGTC-GGGCTGACGGCTTGGATGAGGAAGTGGCGGCGGAGTCGTGGCTCAATGAAAATTGTGCGCGCTCCAAAGCTTA : 284 HspMND2(VN : GCGCGCTCCAAAGCTTAACCTCTGTCTGGGCTGACGGCTTGGATGAGGAAGTGGCGGCGGAGTCGTGGCTCAATGAAAATTGTGCGCGCTCCAAAGCTTA : 285 Hta(AY2457 : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Ovi(TL)AY5 : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Ovi(TL1) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - Csi(SKR) : ---------------------------------------------------------------------------------------------------- : - * 320 * 340 * 360 * 380 * 400 Hpu(TL1) : ----------------------------------------------------TTTTTATTCATTGT--GCGCGCTCCGCTG-AAAACCTTCGTCTGTGGC : 227 HpuM(TL) : ----------------------------------------------------..............--.............-.................. : 227 Hpu(AY2457 : ----------------------------------------------------..A...........--.............--................. : 228 HspMND(VN) : ----------------------------------------------------..............--.............-.................. : 227 HspND(VN) : ----------------------------------------------------..G.GG.G-.....--.............CTT.....CT......... : 229 HspNDV(VN) : ----------------------------------------------------..G..G..GTGAA.GC..........T..TTGTT....T....T...T : 230 Hta(TL1) : ACCTCTGTCTGGGCTGACGGTTTGGATGAGGAAGCGGCGGCGGAGTCGTGGC.CAA.GAAA.....CCA........AAA.TTT.....CT.....A.-. : 384 Hta(TL) : ACCTCTGTCTGGGCTGACGGTTTGGATGAAGAAGCGGCGGCGGAGTCGTGGC.CAA.GAAA.....CCA........AAA.TTT.....CT.....A.-. : 383 HspMND2(VN : ACCTCTGTCTGGGCTGACGGTTTGGATGAGGAAGCGGCGGCGGAGTCGTGGC.CAA.GAAA.....CCA........AAA.TTT.....CT.....A.-. : 384 Hta(AY2457 : ---------------------------------------------------------G.GGC.AACGCA.........T.ATC.TTTA...A..AT.ATT : 226 Ovi(TL)AY5 : ----------------------------------------------------..G..G..GTGAA.GC..........T..TTGTT....T....T...T : 230 Ovi(TL1) : ----------------------------------------------------..G..G..GTGAA.GC..........T..TTGTT....T....T...T : 230 Csi(SKR) : -----------------------------------------------------.A..G..GTGAA.GT..........T..TTGGT....T....T...T : 237 * 420 * 440 * 460 * Hpu(TL1) : TGTGA-TGCTA-GGATGTGGCAATGCATTCGATGCAAATAA-TTGTGCACAT--ATG--TGCCATATT-TA : 290 HpuM(TL) : .....-.....-.............................-..........--...--.........-.. : 290 Hpu(AY2457 : .....-.....-.....C.....................G.-..........--...--.........-.. : 291 HspMND(VN) : .....-.....-.............................-..........--...--.........-.. : 290 HspND(VN) : ..--.-.....-...C.....................TAT.-........T.--T..--....T....--- : 288 HspNDV(VN) : ..A---G...CCA.TA.......................CGG..T.....T.TGG..CT.AA..AC..-.- : 296 Hta(TL1) : ..A-C-G....-A...............C........T.CT-........T.GA...--....T....--- : 446 Hta(TL) : ..A-C-G....-A..C............C........T.CT-........T.GA...--....T....--- : 445 HspMND2(VN : ..A-C-G....-A...............C........T.CT-........T.GA...--....T....--- : 446 Hta(AY2457 : G..TCAG...TTAT.A-...........C...A..C.G.T.-A..G.T..C.A------.C....T..G.C : 289 Ovi(TL)AY5 : ..A---G...CCA.TA.......................CGG..T.....T.TGG..CT.AA..AC..-.- : 296 Ovi(TL1) : ..A---G...CCA.TA.......................CGG..T.....T.TGG..CT.AA..AC..-.- : 296 Csi(SKR) : ..A---G...TCA.TAT......................CTG..T.....CGGTCG.--...TTA.C.-.T : 302 H×nh 3. So s¸nh tr×nh tù nucleotide gen ITS-2 cña c¸c mÉu s¸n l¸ ruét nhá Haplorchis ViÖt Nam, Th¸i Lan v s¸n l¸ gan bÐ (Clonorchis sinensis; Opisthorchis viverrini) Ghi chó: Sai kh¸c tr×nh tù cña c¸c chñng so víi Hpu(TL1) biÓu thÞ b»ng chÝnh ký hiÖu nucleotide cña chóng; dÊu (.) biÓu thÞ sù gièng nhau; dÊu (-) kh«ng cã nucleotide t−¬ng øng.
B¶ng 2. Sù t−¬ng ®ång nucleotide trong gen ITS-2 gi÷a mét sè lo i s¸n l¸ truyÒn l©y qua c¸ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 96 94 96 88 79 54 54 54 54 79 79 76 2 94 99 88 78 53 53 53 68 78 78 75 3 94 84 76 52 52 52 66 76 76 74 4 88 78 53 53 53 68 78 78 76 5 77 76 57 56 66 77 77 74 6 50 50 50 69 100 100 87 7 99 100 45 50 50 50 8 99 45 50 50 50 9 45 50 50 50 10 69 69 68 11 100 87 12 87 13 Ghi chó: 1: Hpu(TL1); 2: HpuM(TL); 3: Hpu(AY245706); 4: HspMND(VN); 5: HspND(VN); 6: HspNDV(VN); 7: Hta(TL1); 8: Hta(TL); 9: HspMND2(VN); 10: Hta(AY245705); 11: Ovi(AY584735); 12: Ovi(TL1); 13: Csi(SKR) Tr×nh tù gen ITS-2 cña Hta (AY245705) Gi÷a 2 lo i s¸n l¸ ruét nhá H. taichui v thu thËp tõ ng©n h ng gen ®em so s¸nh víi H. pumilio cã sù sau kh¸c vÒ ®é d i v trËt tù mÉu nghiªn cøu cña chóng t«i v c¸c mÉu gen ITS-2 ®−îc thÓ hiÖn ë sù chÌn ®o¹n gen tham kh¶o kh¸c cho thÊy cã tû lÖ t−¬ng ®ång 154 nucleotide, l m cho ®o¹n gen ITS-2 cña rÊt thÊp (45%) víi nhãm H. taichui v 54-68% H. taichui d i h¬n ®o¹n gen ITS-2 cña H. víi nhãm H. pumilio. VËy ch¾c ch¾n tr×nh tù pumilio. n y trong ng©n h ng gen l kh«ng ®óng víi H. Cã rÊt Ýt sù sai kh¸c vÒ tr×nh tù nucleotide taichui. trong gen ITS-2 cña H. pumilio gi÷a mÉu s¸n cña ViÖt Nam v mÉu s¸n cña Th¸i Lan trong 4. KÕt luËn nghiªn cøu n y (t−¬ng ®ång ®¹t 99%) v cã sù Hai lo i s¸n l¸ ruét nhá H. taichui v H. sai kh¸c kh«ng ®¸ng kÓ gi÷a mÉu s¸n cña Th¸i pumilio ® ®−îc gi¸m ®Þnh b»ng ph−¬ng ph¸p Lan trong nghiªn cøu n y víi mÉu s¸n Th¸i sinh häc ph©n tö dùa trªn ph©n tÝch gen ITS-2, Lan trong nghiªn cøu cña c¸c t¸c gi¶ kh¸c. tõ c¸c mÉu s¸n l¸ ruét nhá vïng Nam §Þnh Cã sù gièng nhau ho n to n vÒ tr×nh tù cña ViÖt Nam. MÉu Êu trïng s¸n ký hiÖu l s¾p xÕp nucleotide trong gen ITS-2 cña H. HspMND(VN) ®−îc x¸c ®Þnh lo i l taichui gi÷a mÉu s¸n ViÖt Nam v mÉu s¸n H.pumilio v mÉu HspMND2(VN) l H. Th¸i Lan trong nghiªn cøu n y v gièng nhau taichui. VÒ ®é d i gen ITS-2 cña H. taichui l gÇn nh− tuyÖt ®èi víi mÉu s¸n Th¸i Lan cña 446 bp v cña H. pumilio l 290 bp. Ando v cs (2001).
Lêi c¶m ¬n C¸c t¸c gi¶ xin göi lêi c¶m ¬n Tæ chøc DANIDA v dù ¸n FIBOZOPA ® cung cÊp kinh phÝ v t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho nghiªn cøu n y. Xin c¶m ¬n PGS. TS. NguyÔn V¨n §Ò (ViÖn Sèt rÐt, Ký sinh trïng v c«n trïng Trung −¬ng), TS. Jitra Waikagul (Tr−êng §H Y Mahildol, B¨ng Cèc, Th¸i lan v KS. NguyÔn ThÞ H»ng (ViÖn Nghiªn cøu NTTS 1) ® cung cÊp mÉu cho nghiªn cøu. T i liÖu tham kh¶o viverrini collected from Phu Yen province. Proceedings of National Ando, K.; Sathithaworn, P.; Nuchjungreed, C.; Conference on Molecular Biology and Tesana, S.; Srisawangwong, T.; Biochemistry, Hanoi (22-24.10.2003). Limviroj, W. and Chinzei, Y. (2001). Nucleotide sequence of mitochondrial Le, T.H., Blair, D. and McManus, D.P. (2002). CO I and ribosomal ITS-2 genes of Mitochondrial genomes of parasitic Opisthochis viverrini in Northeast flatworms. Trends Parasitol, 18: 206-213. Thailand. Southeast Asian J Trop Med Nicholas, K.B. and H.B. Nicholas (1999). Public Health 2001; 32: 17-22. GeneDoc: a tool for editting and Bowles J, Blair D, McManus DP (1995). A annotating multiple sequence alignments. Distributed by authors. molecular phylogeny of the human schistosomes. Mol Phylogenet Evol 4: Pear, J. C. (1964). A revision of the subfamily 103-109. Haplorchinae Looss, 1899 (Trematoda: Heterophyidae). Parasitology 1964; 54: Cheng, T. C. (1974). General parasitology. 601-76. New York: Academic Press, 1974. Pearson, J. C. and C. K. Ow-Yang (1982). Dzikowski, R.; Levy, M. G.; Poore, M. F.; New species of Haplorchis from Flowers, J. R. and Paperna, I. (2004). Southeast Asia, together with keys to Use of rDNA polymorphism for the Haplorchis - group of Heterophyid identification of Heterophyidae trematodes of the region. Southeast Asia infecting freshwater fishes. Dis Aquat J. Trop. Med. Pub. Health, 13: 53-60. Org 2004; 59: 35-41. Tesana S., Srisawangwonk T., Kaekes S., Kumar, S., Tamura, K., Nei M. (2004). Sithithaworn P., Kanla P., Arunyanart MEGA3: Integrated Software for C. (1991). Eggshell morphology of the Molecular Evolutionary Genetics small eggs of human trematodes in Analysis and Sequence Alignment. Thailand. Southeast Asian J Trop Med Briefings in Bioinformatics 5, 150-163. Public Health 1991; 22: 631-6. Le T.H., N. V. Chuong, N. V. De, P. Yamaguti S. (1958). Systema Helminthum. Sithitharworn, N. B. Nga, T. N. Trung, Vol I. The dignetic trematodes of L. K. Thuan (2003). Report on vertebrates Part 1 & II. New York: Inter molecular analysis of Opisthorchis cience Publishers, 1958: 1575 pp.
T¹p chÝ KHKT N«ng nghiÖp 2007: TËp V, Sè 1: 92 §¹i häc N«ng nghiÖp I