Phân lập tuyển chọn Bacillus spp. nội sinh rễ cây lúa ứng dụng phân bón vi sinh

Chia sẻ: Bigates Bigates | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Từ rễ lúa thu thập từ Long An và Bình Thuận, phân lập được 3 chủng vi khuẩn nội sinh, nghi ngờ thuộc chi Bacillus. Các chủng thể hiện hoạt tính phân giải phosphate vô cơ khó tan, sinh IAA và kháng nấm gây bệnh đốm nâu Curvularia lunata và Curvularia geniculata trên lúa trong các thử nghiệm in vitro. Chủng B1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất được giải trình tự gene 16S rRNA và định danh là Bacillus aryabhattai.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập tuyển chọn Bacillus spp. nội sinh rễ cây lúa ứng dụng phân bón vi sinh

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN BACILLUS SPP. NỘI SINH RỄ CÂY LÚA ỨNG DỤNG PHÂN BÓN VI SINH Nguyễn Tấn Khoa*, Huỳnh Nhỏ Mai Quỳnh, Nguyễn Thu Thuý, Nguyễn Thị Mỹ Diệu * Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: TS.Nguyễn Hoài Hương TÓM TẮT Từ rễ lúa thu thập từ Long An và Bình Thuận, phân lập được 3 chủng vi khuẩn nội sinh, nghi ngờ thuộc chi Bacillus. Các chủng thể hiện hoạt tính phân giải phosphate vô cơ khó tan, sinh IAA và kháng nấm gây bệnh đốm nâu Curvularia lunata và Curvularia geniculata trên lúa trong các thử nghiệm in vitro. Chủng B1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất được giải trình tự gene 16S rRNA và định danh là Bacillus aryabhattai. Từ khóa: bacillus, bệnh đốm nâu, hỗ trợ tăng trưởng cây trồng, IAA, phosphate vô cơ khó tan, vi khuẩn nội sinh. 1 GIỚI THIỆU Việt Nam là đất nước có nền văn minh lúa nước từ bao đời nay, là niềm tự hào vô cùng lớn của ông cha ta. Để cải thiện năng suất và chất lượng lúa trong sản xuất, phòng trừ bệnh do nấm trên cây lúa như bệnh đốm nâu hay thế thuốc trừ nấm hóa học, xu hướng hiện nay là sử dụng hệ vi sinh vật nội sinh (endophytic) cây lúa, đặc biệt là vùng rễ như vi khuẩn các chi Bacillus, Enterobater, Micrococcus, Pseudomonas…Các vi khuẩn này còn thể hiện các hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng cây trồng như phân giải chất hữu cơ, lân vô cơ khó tan, tổng hợp hormone tăng trưởng thực vật IAA, trong đó vi khuẩn chi Bacillus có khả năng sinh nội bào tử, dễ dàng phân lập và sản xuất chế phẩm. Vì vậy, nghiên cứu này nhằm phân lập Bacillus nội sinh rễ cây lúa nhằm tuyển chọn những chủng tiềm năng kháng bệnh đốm nâu và hỗ trợ tăng trưởng cây trồng. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Nguồn phân lập là rễ lúa ở tỉnh Long An và Bình Thuận. Vi khuẩn đối chứng dương: chủng vi khuẩn Bacillus sp. D9 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Viện khoa học Ứng dụng Hutech Nấm chỉ thị: Curvularia lunata N35 và C.geniculata N6 được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Viện khoa học Ứng dụng Hutech. 472
2.2 Phương pháp 2.2.1 Phân lập chủng Bacillus nội sinh Lúa sau khi được lấy từ tỉnh Long An và Bình Thuận được đem đi rửa sạch bùn đất còn bám ở rễ. Sau đó được khử trùng bề mặt đến khi sạch khuẩn (kiểm tra bằng cách cấu ria trên NA), nghiền rễ và xử lý nhiệt ở 85oC trong 15 phút, sau đó phân lập trên môi trường NA. Chọn những khuẩn lạc đặc trưng có hình thái như Bacillus. 2.2.2 Khảo sát hình thái, sinh lý sinh hóa vi khuẩn phân lập Khảo sát hình thái khuẩn lạc trên môi trường Pikovskaya bổ sung bromocresol purple, quan sát hình thái tế bào bằng nhuộm Gram, nhuộm bào tử, và khảo sát khả năng di động, thử nghiệm catalase, MR, VP, khả năng biến dưỡng citrate, khả năng biến dưỡng đường glucose, mannitol, lactose, maltose, sucrose [1]. 2.2.3 Khả hoạt tính sinh học củ chủng đã phân lập Khảo sát khả năng phân giải gelatin, casein, tinh bột, cellulose [1], khả năng phân giải lân vô cơ khó tan và khả năng sinh IAA của các chủng phân lập [2]. 2.2.5 Khả khả năng đối h ng nấ bệnh đốm nâu in vitro Để xác định khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn có lợi thì ta sẽ sử dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method) trên môi trường rắn[3]. Tỷ lệ ức chế (%) = (Dđối chứng – Dthí nghiệm)/ Dđối chứng, trong đó: Dđối chứng là đường kính (cm) khuẩn lạc nấm không cấy vi khuẩn, Dthí nghiệm là đường kính (cm) khuẩn lạc nấm có cấy 2 đường vi khuẩn cách mép đĩa đồng đều 1,5 cm. Đối chứng dương là thuốc trừ bệnh BEAM (hoạt chất Tricyclazole), pha nồng độ 0,625 g/L (nồng độ khuyến cáo sử dụng) thay thế vi khuẩn. Ghi nhận kết quả sau 7 ngày. 2.2.7 Định danh chủng vi khuẩn được phân lập Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn: gửi đi phòng Vi sinh TTCNSH TPHCM giải trình tự 16S rRNA bằng phương pháp Sanger và so sánh trên Gennbank NCBI, xây dựng cây phát sinh loài và bảng giá trị khoảng cách giữa các loài với nhau bằng phần mềm MEGA-X. 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng Bacillus spp. nội sinh từ rễ lúa Từ rễ lúa thu thập từ tỉnh Long An, Bình Thuận được nghiền nát sau khi khử trùng bề mặt sạch vi khuẩn bên ngoài và xử lý nhiệt 85 oC, 15 phút, ba chủng được phần lập, chủng B1 và B5 nổi sinh rễ lúa Long An, Chủng N3 nội sinh rễ lúa Bình Thuận. 3.2 Khảo sát hình thái, sinh lý – sinh hóa của các chủng phân lập vi khuẩn phân lập Các chủng vi khuẩn phân lập đều có hình thái khuẩn lạc không đồng đều, rìa không đều hoặc răng cưa, vi khuẩn gram dương, sinh bào tử nên nghi ngờ thuộc chi Bacillus. Cùng các đặc điểm sinh lý – sinh hóa được trình bày trên Bảng 1. 473
Bảng 1. Kết quả khảo sát sinh lý – sinh hóa của các chủng phân lập Đặc điểm sinh lý, sinh Chủng Đặc điểm sinh lý, sinh Chủng hóa B1 B5 N3 hóa B1 B5 N3 Hình thái tế bào Que Que Que Citrate + - + Gram + + + Lên men glucose + + + Bào tử + + + Lên men mannitol + - + Catalase + - + Lên men maltose + + + Di động + - - Lên men sucrose + + + Methyl Red + + + Lên men lactose - - - Voges Proskauer + + + 3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng phân lập Các chủng B1, B5, N3 đều sinh enzyme protease phân giải gelatin và casein, tuy nhiên không phân giải tinh bột và cellulose, thể hiện qua vòng trong suốt xung quanh giếng thạch, đường kính vòng trong suốt được trình bày trên bảng 2. 3.4 Khảo sát khả năng h a tan lân vô cơ và khả năng sinh IAA của các chủng VSV Khả năng phân giải lân vô cơ thể hiện qua vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn, khả năng sinh IAA thể hiện quan đường kính vòng màu của thuốc thử Salkowski tương tác IAA, kết quả được trình bày trong bảng 2. Bảng 2. Hoạt tính sinh học của các chủng phân lập Đường kính Đường kính Đường kính vòng vòng hòa tan Đường kính vòng phân giải Chủng phân giải gelatin (D- canxi vòng sinh IAA casein (D-d), d), mm phosphate,(D-d) (D-d), (mm) mm mm B1 11,6b ± 2,2 20,0ab ± 0,7 8,9b ± 0,8 6,6b ± 1,5 B5 15,1a ± 0,9 19,4ab ± 3,1 7,9b ± 1,3 6,7b ± 2,1 N3 14,7a ± 1,7 22,9a ± 0,8 8,8b ± 1,3 8,2ab ± 1,3 D9 11,7b ± 2,2 16,2b ± 1,3 13,3a ± 2,6 9,3a ± 1,5 *Khác biệt theo cột có ngh a thống k ở mức ngh a a=0,05 theo tr c nghiệm LSD Cả ba chủng phân lập đều có khả năng phân giải protein gelatin và casein, chủng B1 hơi yếu hơn 2 chủng B5 và N3, nhưng cũng ngang bằng chủng đối chứng D9. Khả năng hòa tan lân và sinh IAA của các chủng phân lập tương đương nhau và thấp hơn chủng đối chứng D9, chỉ đạt 60-70%. 474
3.5 Khả năng kháng nấm của các chủng Thử nghiệm đối kháng Curvularia lunata N35 và C. geniculata N6 với các chủng phân lập B1, B5, N3 và chủng đối chứng D9 được tiến hành (Hình 1, 2). Hình 1. Kết quả kháng nấm C.geniculata N6 và C. lunata N35 của các chủng B1 so với thuốc hóa học BEAM (cột trái là đối chứng âm, cột giữa là đối chứng dương, cột phải là thí nghiệm, dòng trên là nấm C. geniculata, dòng dưới là nấm C.curvularia) Hình 2. Khả năng kháng nấm của các chủng phân lập so với thuốc hóa học BEAM Đối chứng dương chỉ thể hiện khả năng khảng nấm yếu in vitro. Khả năng kháng nấm của chủng B1 đạt 43.3 – 46.7% đối với 2 chủng nấm gây bệnh đốm nâu cao hơn 2 chủng còn lại. Vì vậy chủng B1 được tuyển chọn để định danh. 3.7 Định danh vi khuẩn đã phân lập Giải trình tự gene 16S rRNA thu được kêt quả đoạn gene 1134 bp. Kết quả so sánh trên genbank (NCBI) cho thấy B1 có thể là Bacillus aryabhattai, Bacillus zanthoxyli, Bacillus megaterium tỷ lệ tương đồng 100%. Tuy nhiên theo tác giả Li M, Hong CY, Yan WX, et al. (2017), Bacillus zanthoxyli là một loài mới được phân lập từ lá cây tiêu đỏ Trung Quốc (Zanthoxylum bungeanum Maxim). Loài này là vi khuẩn gram dương, di động và không sinh bào tử. Chủng B1 là chủng sinh bào tử, vì vậy có thể loại trừ B1 thuộc loài mới Bacillus zanthoxyli [4] Theo Prabhu, Dr Manik & Dong, Zhou-Yan & Liu, Guohong & Li, Li & Xiao, Min & Li, Wen-Jun. (2020), Bacillus aryabhattai (Shivaji et al. 2009) là một tên gọi khác của Bacillus megaterium (de Bary 1884) vì trùng lắp gene 16S trên 99.6%, giống nhau hầu hêt 475
các đặc điểm sinh lý sinh hóa [5]. Như vậy có thể nghi ngờ B1 thuộc loài B. aryabhattai hay còn gọi là Bacillus megaterium. Cây phát sinh loài trên Hình 3. Hình 3. Cây phát sinh loài thiết lập dựa trên trình tự gene 16S rRNA trình bày mối quan hệ phát sinh loài giữa chủng B1 và các chủng có độ tương đồng cao (Lactobacillus casei subsp. casei ATCC 393 là nhóm ngoài) 4 KẾT LUẬN Từ rễ lúa (Long An và Bình Thuận) phân lập được 3 chủng B1, B5 và N3 vi khuẩn nội sinh. Các chủng đều có hình que, gram dương, sinh bào tử, catalase dương tính, MR – VP dương tính, indol âm tính, có khả năng phân giải protein (gelatin và casein), không có khả năng phân giải tinh bột và cellulose. Các chủng phân lập đều có khả năng phân giải lân và sinh IAA tốt, đặc biệt N3 có khả năng sinh IAA vượt trội. Về khả năng kháng nấm in vitro của các chủng chọn lọc, kết quả cho thấy chủng B1 có khả năng kháng nấm gây bệnh đốm nâu C.lunata và C. geniculata cao nhất, chủng N3 cho thấy khả năng kháng trung bình, và chủng B5 cho thấy khả năng kháng yếu nhất. Định danh chủng B1 bằng cách gỉai trình tự gene 16SrRNA và so sánh trên Genbank NCBI cho thấy chủng B1 thuộc loài Bacillus aryabhattai. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (2010) Giáo trình vi sinh vật học NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [2] Ann Vande Broek, (1998) Phytostimulatory effect of Azospirillum brasilense wild type and mutant strains altered in IAA production on wheat. Plant and Soil 212: 155–164. [3] Nora, L., & Bettache, G. (2013). Antifungal activity of newly isolates of lactic acid bacteria. Innovative Romanian Food Biotechnology, (13), 80-88.Li M, Hong CY, Yan WX, Chao ZS, Gang YC, Ling DJ, Kui ZX, Qin XJ, Liang ZM, He MM. Bacillus zanthoxyli sp. nov., a novel nematicidal bacterium isolated from Chinese red pepper (Zanthoxylum bungeanum Maxim) leaves in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 2017 Sep;110(9):1179-1187. [4] Narsing Rao MP, Dong ZY, Liu GH, Li L, Xiao M, Li WJ. Reclassification of Bacillus aryabhattai Shivaji et al. 2009 as a later heterotypic synonym of Bacillus megaterium de Bary 1884 (Approved Lists 1980). FEMS Microbiol Lett. 2019 Nov 1;366(22):fnz258. doi: 10.1093/femsle/fnz258. 476