Phân lập, tuyển chọn chủng Streptomyces sp. và vi nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. CC1.5 gây bệnh khô cành, khô quả trên cây cà phê ở tỉnh Đắk Nông

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết "Phân lập, tuyển chọn chủng Streptomyces sp. và vi nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. CC1.5 gây bệnh khô cành, khô quả trên cây cà phê ở tỉnh Đắk Nông" được thực hiện nhằm tuyển chọn được chủng Streptomyces và Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với vi nấm Colletotrichum sp. CC1.5 gây bệnh khô cành, khô quả trên cây cà phê. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập, tuyển chọn chủng Streptomyces sp. và vi nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. CC1.5 gây bệnh khô cành, khô quả trên cây cà phê ở tỉnh Đắk Nông

Khoa học Nông nghiệp / Công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thủy sản DOI: 10.31276/VJST.64(10DB).76-80 Phân lập, tuyển chọn chủng Streptomyces sp. và vi nấm Trichoderma sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. CC1.5 gây bệnh khô cành, khô quả trên cây cà phê ở tỉnh Đắk Nông Nguyễn Bá Thọ*, Trương Minh Ngọc, Đỗ Thị Mai Trinh, Nguyễn Đào Thanh Hương, Lê Thanh Bình, Nguyễn Thị Liên, Hồ Thị Nguyệt, Lê Thị Huyền Chi nhánh Viện Ứng dụng Công nghệ tại TP Hồ Chí Minh Ngày nhận bài 4/7/2022; ngày chuyển phản biện 8/7/2022; ngày nhận phản biện 21/7/2022; ngày chấp nhận đăng 26/7/2022 Tóm tắt: Bệnh thán thư (Anthracnose) hay còn gọi là bệnh khô cành, khô quả là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng trên cây cà phê. Phòng trừ bệnh khô cành, khô quả trên cây cà phê bằng biện pháp sinh học là giải pháp cần thay thế trong việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Nghiên cứu được tiến hành nhằm tuyển chọn được chủng Streptomyces và Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh với vi nấm Colletotrichum sp. CC1.5 gây bệnh khô cành, khô quả trên cây cà phê. Kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được 1 chủng xạ khuẩn ĐR9S2 có khả năng đối kháng cao với vi nấm Colletotrichum sp. CC1.5 sau 8 ngày bằng phương pháp đối kháng trực tiếp và khuếch tán qua lỗ thạch, hiệu quả đối kháng và vòng vô khuẩn đạt lần lượt là 71,85% và 28,63 mm; 1 chủng nấm Trichoderma ĐR10T8 có hiệu quả đối kháng với nấm Colletotrichum sp. CC1.5 sau 5 ngày là 100%. Kết quả phân tích trình tự gen của chủng xạ khuẩn ĐR9S2 là Streptomyces hiroshimensis và vi nấm ĐR10T8 là Trichoderma viride. Từ khóa: bệnh thán thư, cà phê, Colletotrichum, Streptomyces, Trichoderma. Chỉ số phân loại: 4.6 Đặt vấn đề kiểm soát sinh học hiệu quả trong việc quản lý bệnh thán thư trên cây trồng do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra. Dịch môi Cà phê (Coffea spp.) là cây trồng chủ lực của Việt Nam, dù vậy trường nuôi cấy của chủng vi nấm Trichoderma pseudokoningii có sản xuất cà phê đang chịu nhiều ảnh hưởng của dịch bệnh, trong đó hiệu quả đối kháng với nấm bệnh Colletotrichum capsici (65,01%), bệnh khô cành, khô quả trên cây cà phê do nấm Colletotrichum sp. Sclerotinia sclerotiorum (62,82%), Rhizoctonia solani (50,22%) và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng của cà phê. Fusarium oxysporum (34,53%) [12]. Do đó, nghiên cứu nhằm chọn Một số nghiên cứu đã ghi nhận có nhiều loài Colletotrichum gây lựa những chủng Streptomyces và nấm Trichoderma có khả năng bệnh khô cành, khô quả trên cà phê, như: C. asianum, C. fructicola; kiểm soát mạnh với vi nấm Colletotrichum gây bệnh khô cành, khô C. siamense, C. cuscutae, C. fragariae, C. theobromicola, C. gigasporum, C. costarricense, C. queenslandicum… [1-6]. quả trên cà phê đã được thực hiện. Để hạn chế và phòng trừ bệnh do nấm Colletotrichum sp. trên Đối tượng và phương pháp nghiên cứu cây cà phê người nông dân đã sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa Đối tượng học, biện pháp này có hiệu quả nhanh trong kiểm soát bệnh, tuy vậy biện pháp này không bền vững, gây ảnh hưởng xấu đến môi Chủng vi nấm Colletotrichum sp. CC1.5 gây bệnh khô cành, trường và sức khỏe người nông dân, giảm giá trị xuất khẩu cà phê. khô quả trên cây cà phê được phân lập trên mẫu bệnh thu nhận tại Để phát triển cây cà phê bền vững, an toàn với môi trường, thì biện tỉnh Đắk Nông [13]. pháp sinh học đang được quan tâm, trong đó sử dụng vi sinh vật là Các chủng xạ khuẩn Streptomyces và nấm Trichoderma được một trong những biện pháp hiệu quả nhất. phân lập từ 18 mẫu đất thu thập từ các vườn cà phê khỏe mạnh và Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces và nấm Trichoderma đất tại khu vực rừng nguyên sinh Tà Đùng, tỉnh Đắk Nông. đối kháng với nấm bệnh rất có triển vọng do chúng đều có khả Phương pháp nghiên cứu năng tiết các sản phẩm hữu cơ kháng nấm bệnh [7, 8]. Nghiên cứu của A.C.F. Soares và cs (2006) [9] đã phân lập được chủng Phân lập và sàng lọc các chủng có khả năng là xạ khuẩn Streptomyces có khả năng đối kháng với nấm Curvularia Streptomyces: Các mẫu đất được pha loãng trong nước muối 0,85% eragrostides và Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh trên được khử trùng đến các nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-6. Cấy cây khoai mỡ. Các chủng Streptomyces phân lập ở Kenya đã được trải mẫu ở các nồng độ pha loãng trên đĩa petri có chứa môi trường chứng minh có khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum, Gause-1 [14]. Nuôi ủ ở nhiệt độ 30oC trong vòng 4-7 ngày để thu Fusarium spp. và Colletotrichum kahawae gây bệnh trên cây trồng được các khuẩn lạc riêng lẻ. Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ [10]. Kết quả nghiên cứu vi nấm Trichoderma viride, Trichoderma khuẩn được cấy 3 lần lặp lại sang đĩa Petri chứa môi trường Gause-1 harzianum, Trichoderma longibrachyatum của A.J. Deshmukh và để làm thuần. Xác nhận dòng xạ khuẩn Streptomyces sp. dựa trên cs (2010) [11] đã xác định các chủng nấm trên là một tác nhân các đặc điểm hình thái và vi thể của các dòng xạ khuẩn phân lập. * Tác giả liên hệ: Email: nguyenbatho0705@gmail.com 64(10ĐB) 10.2022 76
Khoa học Nông nghiệp / Công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thủy sản loại sinh khối. Ủ đĩa ở 4oC trong 15 phút, cho dịch trong giếng Isolation and selection of Streptomyces sp. khuếch tán. Sau đó ủ ở nhiệt độ 28±2oC trong 7 ngày cho nấm Colletotrichum sp. CC1.5 phát triển. Chủng xạ khuẩn nếu có khả species and Trichoderma sp. species against năng sinh ra chất kháng khuẩn để ức chế Colletotrichum sp. CC1.5 coffee berry disease by Colletotrichum sp. sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch. Đo kích thước vòng vô khuẩn xung quanh giếng. CC1.5 in Dak Nong province Kích thước vòng vô khuẩn = D-d. Ba Tho Nguyen , Minh Ngoc Truong, Thi Mai Trinh Do, * trong đó, D là đường kính vòng đối kháng (mm); d là đường kính Dao Thanh Huong Nguyen, Thanh Binh Le, lỗ (mm). Thi Lien Nguyen, Thi Nguyet Ho, Thi Huyen Le Thí nghiệm được lặp lại 3 lần đối với mỗi chủng xạ khuẩn cần National Center for Technological Progress, Ho Chi Minh Branch chọn lọc. Received 4 July 2022; accepted 26 July 2022 Phân lập và sàng lọc các chủng có khả năng là vi nấm Trichoderma: Các mẫu đất được sấy khô ở 50oC trong 48 giờ, sau Abstract: đó được pha loãng trong nước muối 0,85% được khử trùng đến các Anthracnose is one of the serious diseases on coffee trees. nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-6. Lấy 0,5 ml dung dịch pha loãng Prevention of coffee berry disease on coffee trees by biological nhỏ lên trên đĩa môi trường chứa môi trường PDA và ủ ở 28oC trong measures is an alternative solution to the use of chemical 72 giờ. Chọn những tản nấm rời, có hình thái đặc trưng của nấm pesticides. The study aims to select strains of Streptomyces Trichoderma cấy chuyển sang môi trường PDA mới [16]. and Trichoderma with strong antagonistic ability against Phương pháp đối kháng trực tiếp: Cấy nấm bệnh Colletotrichum Colletotrichum sp. CC1.5 fungus causing coffee berry disease. sp. CC1.5 và các chủng vi nấm Trichoderma tiềm năng trên 2 điểm Results revealed that an actinomycete strain DR92S showed a đối xứng nhau qua tâm đĩa petri, các điểm cấy cách mép đĩa 1,5 cm. high ability to antagonize Colletotrichum sp. CC1.5 after 8 days Đối chứng là đĩa chỉ được cấy riêng nấm bệnh, ủ ở nhiệt độ 28±2oC. by direct antagonism and diffusion through agar holes, with the Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Theo dõi sự phát triển của nấm đối antagonism efficiency and inhibition zone of 71.85% and 28.63 kháng với nấm bệnh sau 3-5 ngày ở nhiệt độ 28±2oC. Hiệu suất ức mm, respectively. A strain of Trichoderma DR10T8 showed chế của chủng vi nấm Trichoderma sp. đến sự phát triển của nấm 100% inhibitory effects against Colletotrichum sp. CC1.5 after Colletotrichum sp. CC1.5 theo công thức sau: 5 days of treatment. The gene sequence analyses exhibited that H = (R - r)/R × 100 the closest genetic relationships of the actinomycete strain trong đó: H là hiệu suất đối kháng của vi nấm Trichoderma (%); R DR9S2 and the fungal strain DR10T8 were Streptomyces là bán kính của hệ nấm Colletotrichum sp. CC1.5 (cm); r là bán kính hiroshimensis and Trichoderma viride, respectively. của vi nấm Trichoderma trên đĩa có chủng vi nấm Colletotrichum Keywords: Anthracnose, coffea spp., Colletotrichum, Streptomyces, sp. CC1.5 (cm). Trichoderma. Phương pháp đối kháng gián tiếp: Nuôi cấy lắc (100 vòng/phút) Classification number: 4.6 chủng vi nấm tiềm năng trên môi trường PDA lỏng trong 8 ngày. Sau đó ly tâm (8.000 vòng/phút trong 5 phút) để loại bỏ sinh khối thu dịch nổi. Nuôi cấy nấm bệnh Colletotrichum sp. CC1.5 trong môi trường PDA lỏng, pha loãng để đạt nồng độ 105 CFU/ml. Hút Phương pháp đối kháng trực tiếp: Được thực hiện theo mô tả 100 µl dịch nuôi cấy chứa Colletotrichum sp. CC1.5 trải đều trên của D. Dhanasekaran và cs (2012) [15]. Quan sát sự hình thành đĩa petri chứa môi trường PDA. Tạo những giếng nhỏ có đường vùng kháng nấm sau 4 và 8 ngày nuôi cấy. Hiệu suất ức chế của xạ kính 8 mm. Nhỏ 100 µl dịch nuôi cấy các chủng vi nấm đối kháng khuẩn đến sự phát triển của vi nấm theo công thức sau: đã loại sinh khối. Ủ đĩa ở 4oC trong 15 phút cho dịch trong giếng H = (R - r)/R × 100 khuếch tán. Sau đó ủ ở nhiệt độ 28±2oC. Sau 5 ngày, khả năng đối kháng được đánh giá thông qua kích thước vòng vô khuẩn. Kích trong đó: H là hiệu suất đối kháng của xạ khuẩn (%); R là bán kính thước vòng vô khuẩn được tính theo công thức sau: của hệ sợi nấm đối chứng (cm); r là bán kính của hệ sợi nấm trên đĩa Kích thước vòng đối kháng = D-d có chủng xạ khuẩn (cm). trong đó: D là đường kính vòng đối kháng (mm); d là đường kính Phương pháp đối kháng gián tiếp: Nuôi cấy lắc 100 vòng/phút lỗ thạch (mm). chủng Streptomyces trên môi trường lỏng Gause 1 ở nhiệt độ 30oC. Sau đó ly tâm (8.000 vòng/phút trong 5 phút) để loại bỏ sinh khối thu Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. dịch nổi. Nuôi cấy nấm bệnh Colletotrichum sp. CC1.5 trong môi Định danh Streptomyces và Trichoderma bằng phương pháp trường PDA lỏng, pha loãng để đạt nồng độ 105 CFU/ml. Hút 100 µl sinh học phân tử: Chủng Streptomyces được định danh bằng phương dịch nuôi cấy chứa Colletotrichum sp. CC1.5 trải đều trên đĩa petri pháp định danh giải trình tự đoạn 16S rDNA bằng cặp mồi 9F/1541R chứa môi trường PDA. Tạo những giếng nhỏ có đường kính 8 mm. [17]. Đối với nấm Trichoderma được định danh bằng phương Nhỏ 100 µl dịch nuôi cấy các chủng Streptomyces đối kháng đã pháp giải trình tự đoạn ITS1/ITS4 với cặp mồi V9G/LS266 [18]. 64(10ĐB) 10.2022 77
đối kháng đã loại sinh khối. Ủ đĩa ở 4oC trong 15 phút cho dịch trong giếng khuếch tán. Sau đó ủ ở nhiệt độ 28±2oC. Sau 5 ngày, khả năng đối kháng được đánh giá thông Hình 1. Khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trường Gause I. (A) Khuẩn lạc chủng ĐR9S2 qua kích thước vòng vô khuẩn. Kích thước vòng vô khuẩn được tính theo công thức sau 4 ngày nuôi cấy; (B) Chủng ĐR9S2 sau 7 ngày nuôi cấy. sau: Khả năng đối kháng chủng vi nấm Colletotrichum CC1.5 của các chủng xạ khuẩn Khoa Kíchhọc thướcNông kháng = D - d/ Công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thủy vòng đối nghiệp sản phân lập được xác định thông qua hiệu quả ức chế và kích thước vòng Streptomyces trong đó: D là đường kính vòng đối kháng (mm); d là đường kính lỗ thạch (mm). kháng vô khuẩn (bảng 1). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tất cả 20 chủng xạ khuẩn phân lập được đều có khả năng đối kháng với nấm Định danh Streptomyces và Trichoderma bằng phương pháp sinh học phân tử: Colletotrichum CC1.5, tuy nhiên mức độ đối kháng giữa các chủng Streptomyces có sự chủng Streptomyces được định danh bằng phương pháp định danh giải trình tự đoạn Kết quả và bàn luận khángkháckhuẩn biệt. Kết quả bảng 1 cho thấy, phần lớn các chủng xạ khuẩn phân lập ở mẫu đất xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn, hiệu quả ức chế đạt 16S rDNA bằng cặp mồi 9F/1541R [17]. Đối với nấm Trichoderma được định danh rừng có hiệu quả đối kháng cao hơn các chủng phân lập ở mẫu đất vườn. Kết quả đối 42,67-68,12%. Sau 8 ngày, vòng kháng khuẩn xung quanh khuẩn lạc Phân bằng lập, phương pháptuyển giải trìnhchọn tự đoạnchủng Streptomyces ITS1/ITS4 có khả với cặp mồi V9G/LS266 [18].năng đối kháng trực tiếp sau 4 ngày, quan sát thấy đã xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh rõ ràng (hình 2), hiệu quả ức chế đạt 40,74-71,85%. Trong 20 chủng kháng với Kết quả nấm và bàn Colletotrichum sp. CC1.5 luận khuẩn lạc xạ khuẩn, hiệu quả ức chế đạt 42,67-68,12%. Sau 8 ngày, vòng kháng khuẩn xạ khuẩn được thử nghiệm khả năng đối kháng trực tiếp với nấm xung quanh khuẩn lạc rõ ràng (hình 2), hiệu quả ức chế đạt 42,96-71,85%. Trong 20 Phân lập, tuyển chọn chủng Streptomyces có khả năng đối kháng với nấm Tất cả 18 mẫu đất lấy từ vườn cà phê khỏe mạnh trong vùng bị Colletotrichum sp. CC1.5, chủng xạ khuẩn được thử nghiệm chủngkhảĐR9S2 năng đối cókháng hiệutrựcquảtiếpđốivớikháng nấm tốt Colletotrichum CC1.5 bệnhTấtvàcả mẫu đất ở rừng tự nhiên, đã phân lập và làm thuần được nhất Colletotrichum (71,85%), CC1.5, thấp chủng nhất ĐR9S2 là chủng có hiệuĐV1S3 (40,74%). quả đối kháng Kết quả tốt nhất (71,85%), thấp đối 18 mẫu đất lấy từ vườn cà phê khỏe mạnh trong vùng bị bệnh và mẫu đất ở 20rừng chủng mang đặc điểm hình thái của Streptomyces như khuẩn lạc khángnhấtđục lỗ của là chủng ĐV1S3 20(40,74%). chủngKếtStreptomyces quả đối kháng đụccholỗ củathấy tất Streptomyces 20 chủng cả 20 chủng tự nhiên, đã phân lập và làm thuần được 20 chủng mang đặc điểm hình thái của khô và có hình dạng phóng xạ (hình 1). phân cho lậpthấyđược đều tất cả 20 tạophânvùng chủng kháng lập được đều tạonấm, vớinấm, vùng kháng đường kính với đường kínhvòng vòng vô Streptomyces như khuẩn lạc khô và có hình dạng phóng xạ (hình 1). khuẩnvôtừ 10,63 khuẩn đến từ 10,63 đến28,63 28,63 mmmm (bảng (bảng 1).đó,Trong 1). Trong đó, chủng chủng ĐR9S2 ĐR9S2 có kết quả đường có kết quả kínhđường vòng kháng kính vòng khuẩn kháng cao nhất (28,63khuẩn mm) (hìnhcao 3). nhất (28,63 mm) (hình 3). Mặt trước đĩa petri (A) (B) 5 Hình 1. Khuẩn lạc xạ khuẩn trên môi trường Gause I. (A) Khuẩn lạc chủng ĐR9S2 sau 4 ngày nuôi cấy; (B) Chủng ĐR9S2 sau 7 ngày nuôi cấy. Mặt sau đĩa petri Khả năng đối kháng chủng vi nấm Colletotrichum sp. CC1.5 của các chủng xạ khuẩn Streptomyces phân lập được xác định thông qua hiệu quả ức chế và kích thước vòng kháng vô khuẩn Sau 4 ngày đối kháng Sau 8 ngày đối kháng (bảng 1). HìnhHình 2. Đốikháng 2. Đối kháng giữa giữachủng Streptomyces chủng hiroshimensis ĐR9S2 Streptomyces với nấm hiroshimensis với nấmCC1.5 trên môi trường PDA sp.ở 28 C theo trên thời gian. o Colletotrichum ĐR9S2 Colletotrichum CC1.5 môi trường PDA Bảng 1. Khả năng đối kháng nấm Colletotrichum sp. CC1.5 ở 28oC theo thời gian. của một số chủng Streptomyces phân lập. 6 Đối kháng trực tiếp Đối kháng gián tiếp STT Tên chủng Hiệu quả ức chế Hiệu quả ức chế (D-d, mm) sau 4 ngày (%) sau 8 ngày (%) 1 ĐR1S1 65,22hi±1,59 62,96i ± 1,13 26,90gh±0,71 2 ĐR3S3 55,56 ±1,13 def 57,04 ± 0,56 h 24,47fg ±0,07 3 ĐR7S2 62,67ghi±0,49 54,07gh ± 2,34 23,63f±0,70 4 ĐR9S2 66,67i±1,13 71,85n ± 0,67 28,63h±0,31 Hình 3. Khả năng đối kháng nấm bệnh Colletotrichum 5 ĐR9S6 56,25efg±2,17 51,85fg ± 1,48 23,17ef±1,07 sp. CC1.5 của chủng Streptomyces hiroshimensis ĐR9S2 6 ĐR10S4 68,12a±2,54 67,41k ± 0,59 27,57g±0,28 bằng Ghi Hìnhphương chú: trong pháp 3. Khả năng cùng một đốiđối cột, các giákháng kháng nấm gián trị theo sau bởi tiếp. bệnh Colletotrichum CC1.5 của chủng các chữ cái giống nhau khác biệt không có ý 7 ĐR11S5 53,62def±0,97 43,70abcd ± 1,22 19,47cd±1,77 Streptomyces hiroshimensis ĐR9S2 bằng phương pháp đối kháng gián tiếp. Từ thống kê kếtα=0,05 ở mức quả thí bằngnghiệm trắc nghiệmcho phânthấy, ĐR9S2 là chủng có khả năng hạng LSD. Bảng 1. Khả năng đối kháng nấm Colletotrichum CC1.5 của một số chủng 8 ĐR15S4 49,31abcde ±3,24 47,41cdef ± 1,43 10,63a±1,50 đối kháng Từ kết mạnh quả thí nhất, nghiệm cholần lượt thấy, là 71,85% ĐR9S2 là chủngvàcó28,63 mm. khả năng đốiChủng này nhất kháng mạnh 9 ĐR12S5 49,27abcde±1,11 56,30h ± 0,59 24,33fg±1,01 Streptomyces phân lập. 10 ĐR15S3 49,27abcde±2,23 41,48ab ± 0,78 14,63b±0,33 được lần lượt định danhvàđến là 71,85% loàimm. 28,63 bằng kỹ này Chủng thuật sinh được học định phân danh đến tử. loàiKết bằngquả kỹ thuật Đối kháng trực tiếp Đối kháng gián tiếp 11 ĐR17S4 48,61abcd±2,18 42,96abc ±0,21 16,90bc±1,18 điện sinh họcdiphân STT sảntử.phẩm Tên PCR Kết quả điện Hiệu của chủng quảdiứcsản chếphẩm xạ PCR Hiệu khuẩn quảcủa ĐR9S2 chủng ức chế (Dxạ với cặp mồi - d,khuẩn mm) ĐR9S2 với cặp chủng 12 ĐV1S3 50,67cde±1,32 40,74a ±1,09 17,97cd±0,99 16S-rDNA trên gel agarose cho thấy xuất hiện một băng vạch DNA mồi 16S-rDNA trên gel sau 4 ngàycho agarose (%)thấy sau 8 ngày xuất hiện(%) một băng vạch DNA sáng rõ ràng 13 ĐV2S5 59,42fgh±3,07 42,96abc ± 2,11 18,50cd±0,20 sáng1 rõ ràng kích thước ĐR1S1 khoảng 1,5 65,22hi±1,59 kb 62,96 i (hình 4A), ± 1,13 sản 26,90 gh phẩm PCR ±0,71 kích thước khoảng 1,5 kb55,56 (hình def 4A), sản phẩmh PCR này được phân tích trình tự và so 14 ĐV4S1 52,78def±1,35 48,12def ± 1,26 14,40b±0,83 này được phân tích trình 2 ĐR3S3 tự ±1,13và so sánh 57,04 ± trên 0,56 NCBI-Blast 24,47 fg ±0,07 cho thấy sánh trên chủng3 NCBI-Blast xạ ĐR7S2 cho khuẩn ĐR9S2thấy 62,67ghi chủng ±0,49 là xạ khuẩn 54,07ghĐR9S2 Streptomyces ± 2,34 là Streptomyces 23,63f±0,70 hiroshimensis hiroshimensis (độ tương 15 ĐV8S6 57,97fg±1,15 48,88ef ±1,51 20,80de±0,78 4 ĐR9S2 66,67i±1,13 71,85n ± 0,67 28,63h±0,31 16 ĐV10S4 50,00bcde±3,95 45,93bcde ±2,65 18,93cd±0,52 đồng (độ 5 100%) tương (hình (hình đồng 100%) ĐR9S6 4B). 4B). 56,25efg±2,17 51,85fg ± 1,48 23,17ef±1,07 17 ĐV11S3 44,93abc±1,71 45,18abcde ±1,70 19,97d±0,31 6 ĐR10S4 68,12a±2,54 67,41k ± 0,59 27,57g±0,28 7 ĐR11S5 53,62def±0,97 43,70abcd ± 1,22 19,47cd±1,77 18 ĐV13S5 45,33abc±1,14 46,67cde±1,49 11,63a±0,90 8 ĐR15S4 49,31abcde ±3,24 47,41cdef ± 1,43 10,63a±1,50 19 ĐV15S3 42,67a±0,85 45,18abcde±1,51 19,73cd±1,22 9 ĐR12S5 49,27abcde±1,11 56,30h ± 0,59 24,33fg±1,01 20 ĐV16S2 43,06ab±4,20 48,15def±0,89 16,80bc±1,18 10 ĐR15S3 49,27abcde±2,23 41,48ab ± 0,78 14,63b±0,33 Ghi chú: trong cùng một cột, các giá trị theo sau bởi các chữ cái giống 11 ĐR17S4 48,61abcd±2,18 42,96abc ±0,21 16,90bc±1,18 nhau khác biệt không có ý thống kê ở mức α=0,05 bằng trắc nghiệm 12 ĐV1S3 50,67cde±1,32 40,74a ±1,09 17,97cd±0,99 phân hạng LSD. 13 ĐV2S5 59,42fgh±3,07 42,96abc ± 2,11 18,50cd±0,20 14 ĐV4S1 52,78def±1,35 48,12def ± 1,26 14,40b±0,83 Tất cả 20 chủng xạ khuẩn phân lập được đều có khả năng đối 15 ĐV8S6 (A) 57,97fg±1,15 48,88ef ±1,51 (B) 20,80de±0,78 kháng với nấm Colletotrichum sp. CC1.5, tuy nhiên mức độ đối Hình 16 ĐV10S4 50,00bcde±3,95 45,93bcde ±2,65 18,93cd±0,52 Hình4.174.Kết Kết quả quả ĐV11S3 điện di44,93 điện sảnsản di abcphẩm PCR vớiabcde phẩm PCR ±1,71 cặp±1,70 45,18 với mồi mồi cặp 16S-rDNA ±0,31và cây 16S-rDNA 19,97 d và phát cây sinh kháng giữa các chủng Streptomyces có sự khác biệt. Kết quả bảng 1 phát loài củasinh 18 chủngloàixạcủa ĐV13S5 chủng khuẩn45,33 xạ tuyển abc được khuẩnchọn. ±1,14 được(A) 46,67 tuyển cde ±1,49 chọn. Kết quả (A)diKết 11,63 điện a sảnquả ±0,90 phẩm điện PCRdi đoạn cho thấy, phần lớn các chủng xạ khuẩn phân lập ở mẫu đất rừng có sản phẩm 19 PCR ĐV15S3 đoạnĐR9S2 16S-rDNA 42,67a±0,85 của chủng ĐR9S2 45,18abcde ±1,51 (M: thang DNA 19,73cd±1,22 1 kb); (B) quan 16S-rDNA của chủng (M: thang DNA 1 kb); (B) Cây phả hệ mối tương hiệu quả đối kháng cao hơn các chủng phân lập ở mẫu đất vườn. Kết 20 hệĐV16S2 Cây phả mối tương43,06 quan±4,20 ab 48,15defStreptomyces giữa các chủng ±0,89 16,80bằng bc ±1,18 giải trình tự quả đối kháng trực tiếp sau 4 ngày, quan sát thấy đã xuất hiện vòng giữa các chủng 16S-rDNA củaStreptomyces chủng ĐR9S2 bằng giải chủng và các trình tựStreptomyces 16S-rDNA của chủng tham ĐR9S27 và các khảo. chủng Streptomyces tham khảo. Phân lập, tuyển chọn chủng vi nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum CC1.5 trên môi trường PDA 64(10ĐB) 10.2022 78Kết quả từ mẫu đất ở vườn trồng cà phê khỏe mạnh và đất rừng nguyên sinh đã phân lập được 53 chủng vi nấm Trichoderma sp. và sàng lọc, đánh giá hiệu quả đối kháng của các chủng phân lập được với nấm Colletotrichum CC1.5 bằng phương pháp
10 ĐV3T4 56,72g±5,45 86,41fg ± 5,30 19,30bdce ± 2,31 11 ĐV5T3 62,07 ±9,08 f 90,67 ± 5,73 de 17,93bcd ± 2,51 12 ĐV8T5 72,36 ±8,75 d 91,52 ±3,53 cd 18,87bcde±2,63 Khoa học Nông13nghiệp / Công72,93 ĐV10T4 nghệcd sinh học trong ±7,59 nông nghiệp, 91,82cd±4,21 thủy sản 13,90ab±0,29 14 ĐV15T2 76,27c±10,17 95,22b±2,32 30,03gh±1,13 15 ĐV17T5 71,50 ±8,71 d 94,44 ±2,61 b 26,40fg±0,06 Ghi chú: trong cùng một cột, các giá trị theo sau bởi các chữ cái giống nhau khác biệt không Phân lập, tuyển chọn chủng vi nấm Trichoderma có khả năng Từkêkết có ý thống quảα=0,05 ở mức đối kháng bằng trắccủa cácphân nghiệm chủng hạngvi nấm LSD. Trichoderma phân đối kháng với nấm Colletotrichum sp. CC1.5 trên môi trường PDA lập với nấm Colletotrichum sp. CC1.5, chúng tôi đã chọn được Từ kết quả đối kháng của các chủng vi nấm Trichoderma phân lập với nấm Kết quả từ mẫu đất ở vườn trồng cà phê khỏe mạnh và đất rừng 1 chủng Trichoderma có hoạt tính cao là ĐR10T8 để thực hiện Colletotrichum CC1.5, chúng tôi đã chọn được 1 chủng Trichoderma có hoạt tính cao nguyên sinh đã phân lập được 53 chủng vi nấm Trichoderma sp. và định danh đến loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Kết quả định là ĐR10T8 để thực hiện định danh đến loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Kết quả sàng lọc, đánh giá hiệu quả đối kháng của các chủng phân lập được danh vi nấm Trichoderma ĐR10T8 với cặp mồi ITS cho thấy, sản định danh vi nấm Trichoderma ĐR10T8 với cặp mồi ITS cho thấy, sản phẩm PCR với nấm Colletotrichum sp. CC1.5 bằng phương pháp đối kháng trực phẩm PCR điện di trên gel agarose xuất hiện 1 băng vạch DNA điện di trên sáng và gel agarose rõ ràng vớixuất hiện kích 1 băng thước vạch DNA khoảng 1000sáng bpvà(hình rõ ràng với Kết 6A). kích quả thước tiếp. Kết quả thu nhận được 15 chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng (được thể hiện ở bảng 2). Sau 3 ngày, tất cả 15 chủng nấm giải 1000 khoảng trìnhbptự(hình của 6A). sản Kết phẩmquả PCR và tự giải trình socủa sánh sản trên phẩmNCBI-Blast PCR và so sánh chotrên Trichoderma cho hiệu quả ức chế nấm gây bệnh khô cành, khô quả thấy chủng NCBI-Blast cho vi nấm thấy ĐR10T8 chủng là Trichoderma vi nấm ĐR10T8 là Trichoderma (độ tương virideviride đồng (độ tương đồng trên cây cà phê ở mức trung bình đến rất cao (47,48 đến 86,56%). 99%) 99%) (hình(hình 6B). 6B). Sau 5 ngày, nấm bệnh Colletochitrum sp. CC1.5 không phát triển được và bị nấm Trichoderma mọc bao phủ lên (hình 5), hiệu quả đối kháng ghi nhận rất cao trong đó có 2 chủng là ĐR8T6 và ĐR10T8 ức chế hoàn toàn nấm Colletotrichum sp. CC1.5 (hiệu quả đối kháng 100%). Tuy nhiên, trong kết quả khuếch tán qua lỗ thạch của các chủng Colletotrichum cho thấy, mặc CC1.5 dù (hiệuchủng ĐR8T6 quả đối kháng cóTuykhả 100%). năng nhiên, trong đối kháng kết quả khuếch trực tiếp caotánnhưng khả qua lỗ thạch của năng tiết các chủng chochất ức dùchế thấy, mặc viĐR8T6 chủng nấm cóColletotrichum khả năng đối kháng sp. CC1.5 trực không cao kết quả vòng kháng nấm đạt 11,60 mm. tiếp cao nhưng khả năng tiết chất ức chế vi nấm Colletotrichum CC1.5 không cao kết quả vòng kháng nấm đạt 11,60 mm. (A) (B) Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS và cây phát Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS và cây phát sinh loài của sinh loài của chủng Trichoderma được tuyển chọn. (A) Kết quả điện di chủng sản Trichoderma phẩm PCR đoạnđượcITS tuyển củachọn. chủng(A) Kết quả(M: ĐR10T8 điện di sản thang phẩm DNA PCR(B) 1 kb); đoạn CâyITS củaphả hệ mối chủng tương ĐR10T8 (M:quan giữa thang DNA các1 chủng Cây phả hệ bằng Trichoderma kb); (B) giải trình mối tương quantự ITScác giữa của chủng chủng ĐR10T8 Trichoderma và các bằng giải chủng Trichoderma trình tự tham khảo. ITS của chủng ĐR10T8 và các chủng Bàn luận Trichoderma tham khảo. Bàn luận Khả năng đối kháng với vi nấm Colletotrichum sp. CC1.5 gây Hình 5. Đối kháng giữa chủng nấm Trichoderma viride ĐR10T8 với nấm bệnh khô cành, khô quả trên cây cà phê của chủng Streptomyces 10 Hình 5. Đối kháng giữa chủng nấm Trichoderma viride ĐR10T8 hiroshimensis ĐR9S2 và Trichoderma viride ĐR10T8 trong nghiên Colletotrichum CC1.5 trên môi trường PDA ở 28oC, theo thời gian. với nấm Colletotrichum sp. CC1.5 trên môi trường PDA ở Bảng 2. Khả năng ức chế nấm Colletotrichum CC1.5 của một số chủng cứu này cho thấy cả 2 chủng đều có khả năng đối kháng với nhiều 28oC, theo thời gian. Trichoderma. cơ chế. Các chủng xạ khuẩn Streptomyces có khả năng cạnh tranh Bảng 2. Khả năng ức Đối chế kháng nấm trực tiếpColletotrichum sp. gián Đối kháng CC1.5 tiếp của dinh dưỡng nơi cư trú, tiết hợp chất kháng sinh, các enzyme có một số STT chủng Trichoderma. Tên chủng Hiệu quả ức chế Hiệu quả ức chế (D - d, mm) khả năng phân giải thành tế bào của nấm bệnh (protease, chitinase, sau 3 ngày (%) sau 5 ngày (%) 1 ĐR1T5 Đối kháng 71,74dtrực ±9,38tiếp 96,11b±2,13 16,90abc±1,96 cellulase [19, 20]. Chủng nấm Trichoderma có cơ chế trực tiếp liên Đối kháng gián tiếp quan đến hiệu quả đối kháng với nấm bệnh là có tốc độ phát triển STT 2Tên chủng ĐR5T3 Hiệu quả ức chế sau 3 Hiệu quả ức chế sau 80,23b ±5,54 95,66 b ±0,94 5 cdef±2,02 20,50 (D-d, mm) 3 ĐR8T6 ngày (%) 84,16 ±5,95 a ngày (%) 100,00 a ±0,00 11,60 ±2,60 a nhanh, khả năng cạnh tranh dinh dưỡng, không gian sống với nấm 1 4 ĐR1T5ĐR10T8 71,74d86,56 ±9,38±4,80 a 100,00b a±0,00 96,11 ±2,13 32,80h±2,71abc 16,90 ±1,96 bệnh tốt [21, 22] và tiết ra chitinase, glucanase, protease, có thể làm 2 5 ĐR5T3 ĐR12T7 71,48d±5,49 80,23 ±5,54ef b 94,03bcb ±3,08 95,66f ±0,94 18,93bcde±1,70 20,50 ±2,02 cdef phá hủy vách tế bào của nấm và ký sinh trong sợi nấm bệnh [8]. 6 ĐR13T3 63,89 ±4,85 87,32 ±4,41 22,867def±0,61 3 ĐR8T6ĐR15T3 84,16a55,81 7 ±5,95g±8,31 100,00a±0,00 84,57g±5,17 11,60a±2,60 24,63efg±0,55 Kết quả hiệu quả ức chế nấm bệnh Colletotrichum sp. của 4 8ĐR10T8 ĐR17T4 86,5667,34 a ±4,80e±7,52 100,00 88,33 ef ±0,00 a ±7,21 16,10 32,80 ±1,56±2,71 abc h chủng Streptomyces hiroshimensis ĐR9S2 đạt 71,85%, so sánh 5 9ĐR12T7 ĐV1T3 71,48d47,48 ±5,49h±2,47 94,03hbc±8,38 81,00 ±3,08 18,93 14,60abc bcde ±2,54 ±1,70 với các nghiên cứu khác như của Đỗ Văn Sử và Lê Minh Tường 6 ĐR13T3 63,89ef±4,85 87,32f±4,41 22,867def±0,61 (2016) [23], chủng Streptomyces CT10 có hiệu quả ức chế với nấm 9 7 ĐR15T3 55,81g±8,31 84,57g±5,17 24,63efg±0,55 Colletotrichum sp. phân lập trên cây ớt là 60,73% và đường kính 8 ĐR17T4 67,34e±7,52 88,33ef±7,21 16,10abc±1,56 vòng kháng khuẩn đạt 13,7 mm; Nguyễn Thị Vân và cs (2019) 9 ĐV1T3 47,48h±2,47 81,00h±8,38 14,60abc±2,54 [24] cho thấy, chủng Streptomyces VTCC-A-69 có hiệu quả ức 10 ĐV3T4 56,72g±5,45 86,41fg ± 5,30 19,30bdce ± 2,31 chế nấm Colletotrichum sp. là 38%; Q.G. Fadhilah và cs (2021) 11 ĐV5T3 62,07f±9,08 90,67de ± 5,73 17,93bcd ± 2,51 [25] cho hiệu quả đối kháng của chủng Streptomyces sanyensis 12 ĐV8T5 72,36 ±8,75 d 91,52 ±3,53 cd 18,87bcde±2,63 với vi nấm Colletotrichum sp. KA đạt 59,88%. Như vậy, chủng 13 ĐV10T4 72,93 ±7,59 cd 91,82 ±4,21 cd 13,90ab±0,29 Streptomyces hiroshimensis ĐR9S2 phân lập được có khả năng 14 ĐV15T2 76,27 ±10,17 c 95,22 ±2,32 b 30,03gh±1,13 kháng Colletotrichum sp. mạnh hơn các chủng Streptomyces sp. của 15 ĐV17T5 71,50 ±8,71 d 94,44 ±2,61 b 26,40fg±0,06 các nghiên cứu trên đạt được. Ghi chú: trong cùng một cột, các giá trị theo sau bởi các chữ cái giống nhau khác biệt không có ý thống kê ở mức α=0,05 bằng trắc nghiệm Kết quả đánh giá hoạt lực kháng nấm Colletotrichum sp. CC1.5 phân hạng LSD. của chủng nấm Trichoderma viride ĐR10T8 trong nghiên cứu này 64(10ĐB) 10.2022 79
Khoa học Nông nghiệp / Công nghệ sinh học trong nông nghiệp, thủy sản (hiệu quả ức chế đạt 100% và đường kính vòng vô khuẩn 32,80 mm) có [12] P. Dutta, et al. (2018), “Effect of extracellular metabolites of Trichoderma hoạt lực cao hơn trong các báo cáo của L.R. Shovan và cs (2008) [26], pseudokoningii on radial growth of Fusarium oxysporum, Colletotrichum capsici, chủng Trichoderma harzianum đối kháng với nấm Colletotrichum Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum”, Int. J. Curr. Microbiol. App. dematium gây bệnh trên cây đậu nành đạt hiệu quả 89,44%; Nasreen Sci., 7(1), pp.874-879. Musheer và Shabbir Ashraf (2017) [27], đánh giá hoạt lực đối kháng [13] Nguyễn Bá Thọ, Nguyễn Thị Liên, Võ Đình Quang (2020), “Phân lập của chủng Trichoderma viride với nấm gây bệnh Colletotrichum một số chủng Bacillus sp. đối kháng với nấm Colletotrichum sp. gây bệnh khô leosporiodes trong điều kiện phòng thí nghiệm là 69,79%. cành khô quả trên cây cà phê ở tỉnh Đắk Nông”, Tạp chí Khoa học Công nghệ và Thực phẩm, 20(3), tr.94-102. Kết luận [14] E. Küster, S.T. Williams (1964), “Selection of media for isolation of Nghiên cứu đã phân lập và tuyển chọn được 20 chủng xạ khuẩn streptomycetes”, Nature, 202(4935), pp.928-929. Streptomyces có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp. [15] D. Dhanasekaran, et al. (2012), Applications of Actinobacterial CC1.5, trong đó chủng Streptomyces hiroshimensis ĐR9S2 có Fungicides in Agriculture and Medicine, IntechOpen, pp.29-54. hiệu quả đối kháng và tạo vòng kháng vô khuẩn cao lần lượt là [16] K. Kumar, et al. (2012), “Isolation and characterization of Trichoderma 71,85% và 28,63 mm; 15 chủng Trichoderma có khả năng kháng spp. for antagonistic activity against root rot and foliar pathogens”, Indian nấm Colletotrichum sp. CC1.5, trong đó chủng vi nấm có hiệu Journal of Microbiology, 52(2), pp.137-144. quả đối kháng và tạo vòng vô khuẩn mạnh là Trichoderma viride [17] T. Tamura, K. Hatano (1998), “Phylogenetic analyses on the (86,56-100%, 32,80 mm). strains belonging to invalidated genera of the order Actinomycetales”, Với kết quả khả năng kiểm soát mạnh với vi nấm Colletotrichum Actinomycetologica, 12(1), pp.15-28. sp. CC1.5, cả 2 chủng vi sinh tuyển chọn được trong nghiên cứu [18] H. Garcia Garces, et al. (2016), “Molecular identification and này cần được nghiên cứu sâu hơn về quy trình hình thành chế phylogenetical analysis of dermatophyte fungi from Latin America”, Mycoses, phẩm và thử nghiệm kiểm soát bệnh khô cành, khô quả trên cây cà 59(12), pp.787-797. phê ở điều kiện đồng ruộng. [19] Z. Jaradat, et al. (2008), “Influence of culture conditions on cellulase production by Streptomyces sp. (strain J2)”, Jordan Journal of Biological TÀI LIỆU THAM KHẢO Sciences, 1(4), pp.141-146. [1] P.W. Damm, et al. (2012a), “The Colletotrichum acutatum species [20] M. Shimizu, et al. (2009), “A promising strain of endophytic complex”, Studies in Mycology, 73, pp.37-114. Streptomyces sp. for biological control of cucumber anthracnose”, Journal of [2] P.W. Damm, et al. (2012b), “The Colletotrichum boninense species General Plant Pathology, 75(1), pp.27-36. complex”, Studies in Mycology, 73, pp.1-36. [3] K.D. Prihastuti, et al. (2009), “Characterization of Colletotrichum [21] S. Santos-Villalobos, et al. (2013), “Potential use of Trichoderma species associated with coffee berries in northern Thailand”, Fungal Divers., 39, asperellum (Samuels, Liechfeldt et Nirenberg) T8a as a biological control agent pp.89-109. against anthracnose in mango (Mangifera indica L.)”, Biological Control, 64(1), [4] F. Rakotoniriana, et al. (2013), “Colletotrichum gigasporum sp. nov., a pp.37-44. new species of Collettrichum producing long straight conidia”, Mycol. Prog., 12, [22] P. Chaverri, G.J. Samuels (2003), “Hypocrea/Trichoderma pp.403-412. (Ascomycota, Hypocreales, Hypocreaceae): Species with green ascospores”, [5] D. Silva, et al. (2012), “Application of the Apn2/MAT locus to improve Studies in Mycology, 48, pp.1-116. the systematics of the Colletotrichum gloeosporioides complex: An example from coffee (Coffea spp.) hosts”, Mycologia, 104, pp.396-409. [23] Đỗ Văn Sử, Lê Minh Tường (2016), “Hiệu quả phòng trị của xạ khuẩn [6] U. Weir, et al. (2012), “The Colletotrichum gloeosporioides species đối với bệnh thán thư trên cây ớt do nấm Colletotrichum sp.”, Tạp chí Khoa học, complex”, Stud. Mycol., 73, pp.115-180. Trường Đại học Cần Thơ, Chuyên đề Nông nghiệp, tr.28-35. [7] K.A. El-Tarabily, K. Sivasithamparam (2006), “Non-streptomycete [24] Nguyễn Thị Vân và cs (2019), “Khảo sát khả năng đối kháng với 4 loại actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as nấm gây bệnh trên thực vật của xạ khuẩn được phân lập từ Vườn quốc gia Cúc plant growth promoters”, Soil Biology and Biochemistry, 38(7), pp.1505-1520. Phương và Ba Bể”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 17(1), tr.1-9. [8] Q. Wu, et al. (2017), “Identification of a novel fungus, Trichoderma asperellum GDFS1009, and comprehensive evaluation of its biocontrol efficacy”, [25] Q.G. Fadhilah, et al. (2021), “The antagonistic activity of marine PlOS ONE, 12(6), DOI: 10.1371/journal.pone.0179957. actinomycetes from mangrove ecosystem against phytopathogenic fungi [9] A.C.F. Soares, et al. (2006), “Soil streptomycetes with in vitro activity Colletotrichum sp. KA”, Biodiversitas Journal of Biological Diversity, 22(2), against the yam pathogens Curvularia eragrostides and Colletotrichum pp.837-843. gloeosporioides”, Brazilian Journal of Microbiology, 37, pp.456-461. [26] L.R. Shovan, et al. (2008), “In vitro control of Colletotrichum dematium [10] J.O. Nonoh, et al. (2010), “Isolation and characterization of Streptomyces causing anthracnose of soybean by fungicides, plant extracts and Trichoderma species with antifungal activity from selected national parks in Kenya”, Afr. J. harzianum”, International Journal of Sustainable Crop Production, 3(3), pp.10-17. Microbiol. Res., 4, pp.856-864. [11] A.J. Deshmukh, et al. (2010), “In vitro evaluation of some known [27] Nasreen Musheer, Shabbir Ashraf (2017), “Effect of Trichoderma spp. bioagents to control Colletotrichum gloeosporioides Penz. and causing on Colletotrichum gleosporiodes Penz and Sacc. causal organism of turmeric leaf anthracnose of Indian bean”, Int. J. Pharm. BioSci., 1(2), pp.1-6. spot disease”, Trends in Biosciences, 10(48), pp.9605-9608. 64(10ĐB) 10.2022 80