Phân lập và thiết kế vector phục vụ công tác chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng chống chịu với điều kiện bất thuận

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO<br /> GIỐNG CÂY TRỒNG BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU<br /> VỚI ĐIỀU KIỆN BẤT THUẬN<br /> Nguyễn Anh Vũ, Lương Thanh Quang, Nguyễn Hữu Kiên,<br /> Bùi Thúy Hiền, Dương Tuấn Bảo, Nguyễn Minh Ngọc,<br /> Nguyễn Trung Anh, Đỗ Như Quỳnh, Trần Quốc Bảo,<br /> Vũ Hoàng Nam, Trần Thu Cúc, Phạm Thị Lý Thu,<br /> Lê Huy Hàm, Nguyễn Văn Đồng<br /> Viện Di truyền Nông nghiệp<br /> SUMMARY<br /> Gene isolation and construction of expression vector as material<br /> for creating stress-tolerant transgenic crop plants<br /> Among abiotic stress factors, drought causes most damage to crop yield world wide. In the wake<br /> of increasing frequency and scale of drought due to global warming, creating drought tolerant crop<br /> plants is not only in the interest of Vietnam but also the world. In our research, we isolated from<br /> soybean (Glycine max) 3 genes potentially involved in drought tolerance including: GmMYB, GmGLP<br /> and GmCHS7. These genes were placed under 35S promoter’s control in the binary vector pZY101-Asc<br /> carrying ammonium glufosinate resistant bar gene as the selection marker. Agrobacteium tumefaciens<br /> strains transformed with these vectors were used to create transgenic soybean lines resulting in some<br /> promising initial results.<br /> Keywords: Agrobacterium tumefaciens, drought tolerant, glufosinate, GmGLP1, GmMyb, GmCHS7,<br /> soybean, transgenic<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ *<br /> Hạn hán - tình trạng lượng nước tự nhiên<br /> thấp hơn mức trung bình trong một thời gian dài<br /> trên diện rộng và mang tính khu vực, là một<br /> trong các yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn<br /> nhất đến năng suất cây trồng trên toàn thế giới<br /> [1]. Một số mô hình dự đoán biến đổi khí hậu<br /> cho thấy hạn hán sẽ xảy ra thường xuyên hơn<br /> trong tương lai do những tác động dài hạn của<br /> hiện tượng ấm lên toàn cầu [2, 3]. Kết quả là<br /> diện tích đất canh tác ngày càng bị thu hẹp.<br /> Trước những thách thức nêu trên, việc nghiên<br /> cứu phát triển những giống cây trồng mới có<br /> khả năng thích ứng, chống chịu các điều kiện<br /> bất thuận đang là một trong những mục tiêu<br /> hàng đầu của các nhà khoa học.<br /> Tình trạng thiếu nước dẫn đến một loạt các<br /> thay đổi về hình thái, sinh lý, hóa sinh cũng như<br /> ở cấp phân tử gây ảnh hưởng xấu tới sự phát<br /> triển và năng suất cây trồng [4]. Tương tự như<br /> stress mặn, stress hạn phá vỡ sự cân bằng nội<br /> Người phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý.<br /> <br /> 258<br /> <br /> môi và phân bố ion trong tế bào [5, 6]. Cây<br /> trồng phản ứng với các stress hạn và mặn thông<br /> qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào<br /> như sản xuất protein stress, tăng cường các chất<br /> chống oxi hóa và tích lũy các chất tan tương<br /> thích [7, 8, 9]. Cơ chế phản ứng của tế bào thực<br /> vật với điều kiện hạn được thể hiện trong hình 1.<br /> Các gen phản ứng với stress hạn có thể chia<br /> thành 2 nhóm chính. Nhóm 1 mã hóa cho các<br /> protein chức năng tham gia các phản ứng cuối<br /> trong chuỗi đáp ứng stress bao gồm gen điều<br /> hòa áp suất thẩm thấu [10], các protein chống<br /> oxi hóa [11], aquaporin [12], protein phổ biến<br /> trong thời kì hình thành phôi muộn (LEA) [13],<br /> các protein vận chuyển [14]. Nhóm 2 mã hóa<br /> các protein điều khiển bao gồm các yếu tố phiên<br /> mã và các protein kinase truyền tin. Một số yếu<br /> tố phiên mã liên quan đến khả năng chịu mặn và<br /> chịu hạn thường gặp bao gồm WRKY [15,16],<br /> bZIP [15], MYB [17,18], DREB [19], NCED<br /> [20] và AP2/ERF [21]. Các protein kinase<br /> truyền tin bao gồm: Protein kinase phụ thuộc<br /> Ca2+ [22], MAPK [23], RPK [24], PIK [25] và<br /> protein kinase serine/threonine [26].<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> Hình 1. Cơ chế phản ứng của thực vật với điều kiện hạn<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn<br /> phân lập và thiết kế vector tăng cường biểu hiện<br /> 3 gen: GmMYB, GmCHS7 và GmGLP1.GmMYB<br /> (XM_003549497) ban đầu được xếp vào nhóm<br /> MYB, tuy nhiên với trình tự mang vùng WRKY,<br /> gen này được xếp lại vào nhóm các yếu tố phiên<br /> mã WRKY mã hóa cho protein WRKY24.<br /> <br /> Nghiên cứu gần đây cho thấy WRKY nằm trong<br /> số các yếu tố phiên mã tăng cường biểu hiện<br /> trong điều kiện mặn và có nhiều khả năng giúp<br /> nâng cao khả năng chịu mặn của đậu tương [27].<br /> GmGLP1 (EU916269) là một trong các gen mã<br /> hóa protein giống germin (germin-like protein)<br /> tìm thấy trong hạt nảy mầm. Tất cả các protein<br /> 259<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> germin đều mang motif germin tạo thành cấu<br /> trúc lõi thùng beta tham gia vào gắn kết với kim<br /> loại [28]. Mặc dù còn nhiều germin chưa được<br /> xác định chức năng, các phân tích chức năng<br /> tương đồng cho thấy germin tham gia vào nhiều<br /> quá trình quan trọng khác nhau như phát triển,<br /> điều hòa áp suất thẩm thấu, dao động quang chu<br /> kỳ và phòng vệ [29]. Một báo cáo gần đây cho<br /> thấy tăng cường biểu hiện germin tách từ đậu<br /> tương giúp tăng khả năng chịu mặn của cây<br /> thuốc lá chuyển gen [30]. Cuối cùng,<br /> GmCHS7(XM_003517481) là một trong các gen<br /> thuộc nhóm đa gen mã hóa chalcone synthase<br /> tham gia sinh tổng hợp flavonoid/isoflavonoid.<br /> Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy chalcone<br /> synthase tham gia vào phản ứng phòng vệ của<br /> thực vật chống lại các tác nhân sinh học gây<br /> bệnh [31]. Một số nghiên cứu lại cho thấy<br /> GmCHS7 biểu hiện mạnh ở rễ và có nhiều khả<br /> năng tham gia vào quá trình hình thành nốt sần<br /> rễ cây họ Đậu [32].<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Vật liệu<br /> Vật liệu thực vật: Giống đậu tương<br /> DT2008, DT84,Williams 82 và ĐT22. Các hóa<br /> chất, vật tư tiêu hao cơ bản phục vụ tách chiết<br /> và clone gen. Các plasmid pGEMT-easy,<br /> pRTL2 và pZY101-Asc.<br /> <br /> gen<br /> <br /> GmMYB,<br /> <br /> GmGLP1<br /> <br /> và<br /> <br /> Ba dòng đậu tương DT2008, DT84 và<br /> Williams 82 đã được cho nảy mầm trong xô<br /> nhựa chứa đất giá thể. Mỗi dòng gieo 100 hạt<br /> kích thước lớn, vỏ trơn đều, không rạn nứt hay<br /> bị tổn thương, không có dấu hiệu bị mọt. Các thí<br /> nghiệm được tưới nước đầy đủ hàng ngày, mỗi<br /> xô 100 ml nước. Sau ba tuần, ngừng tưới nước<br /> trong 3 ngày. Sau đó xử lý hạn nhân tạo bằng<br /> cách tưới 200 ml dung dịch sorbitol 7% (w/v).<br /> 15 mẫu lá đã thu được từ 3 giống tại 5 thời<br /> điểm: Ngay trước khi xử lý hạn, sau xử lý hạn<br /> 1h, 5h, 12h và 24h. Với mỗi mẫu lá, chúng tôi<br /> đã thu lá từ 20 cây khác nhau của cùng một điều<br /> kiện (giống và thời điểm). Mẫu được xử lý lạnh<br /> sâu bằng cách ngâm trong ni tơ lỏng (-196oC) để<br /> làm ngưng toàn bộ các phản ứng sinh hóa trong<br /> 260<br /> <br /> ARN tổng số từ các mẫu được dùng để tổng<br /> hợp thư viện cDNA sử dụng enzyme reverse<br /> transcriptase. Tổng hợp mạch cDNA đầu tiên<br /> bằng cách ủ hỗn hợp ARN tổng số (tối đa 5 g)<br /> (4 l), mồi oligo (dT)20 50 M (1 l), dNTP 10<br /> mM (1 l) và nước cất đã qua xử lý DEPC (4 l)<br /> trong 5 phút ở 65oC, chuyển sang giữ trên đá<br /> trong 2 phút. Sau đó trộn với hỗn hợp Tổng hợp<br /> cDNA bao gồm: Dịch đệm 10x (2 l), MgCl2 25<br /> mM (4 l), DTT 0,1 M (2 l), RnaseOUT 40<br /> U/l (1 l), superScript III RT 200U/l (1 l) vả<br /> ủ trong 50 phút ở 50oC. Sau đó ủ 5 phút ở 80oC<br /> để ngưng phản ứng phiên mã ngược, làm lạnh<br /> ống nghiệm trên đá, ly tâm nhanh để thu mẫu,<br /> sau đó thêm 1 µl RnaseH và ủ ở 37oC trong 20<br /> phút để phân hủy ARN.<br /> Các gen quan tâm được PCR từ thư viện<br /> cDNA với các cặp mồi đặc hiệu:<br /> + GmMYB Forward:<br /> GTGAGCACAGTCATGATC<br /> <br /> và<br /> <br /> GmMYB Reverse:<br /> TCAGCAAGGCTTAATTTC;<br /> <br /> + GmGLP1 Forward:<br /> <br /> 2.1. Phương pháp nghiên cứu<br /> *Tách chiết<br /> GmCHS7<br /> <br /> mẫu, ngăn chăn sự phân hủy ARN thông tin.<br /> Mẫu lá được nghiền nhỏ thành bột mịn trong<br /> nitơ lỏng và được dùng để tách ARN theo quy<br /> trình sử dụng bộ kit SV Total RNA isolation<br /> (Promega).<br /> <br /> ATGAAGCTCACAGGTTTCCTG và<br /> <br /> GmGLP1 Reverse:<br /> TTATTTCTTAGGAGCAAGCCTAGAC;<br /> <br /> + GmCHS7 Forward:<br /> ATGGTTAGCGTAGCTGAGAT và<br /> <br /> GmCHS7 Reverse:<br /> TCAGATGGCCACACTATGC.<br /> <br /> Thành phần phản ứng bao gồm: Dung dịch<br /> đệm 10X (5 l), dNTP 10 mM (5 l), mồi xuôi<br /> (5 l), mồi ngược (5 l), Pfu DNA polymerase<br /> (1,25 l), cDNA (1 l), H2O (27,75 l)với chu<br /> trình nhiệt: Biến tính ở 95oCtrong 3 phút; 40<br /> chu kỳ 95oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây<br /> và 72oC trong 1 phút; sau đó kéo dài mạch lần<br /> cuối ở 72oC trong 7 phút. Sản phẩm PCR sau<br /> khi đã kiểm tra điện di được tinh sạch bằng bộ<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> kit GenCatch PCR Purification (Epoch Life<br /> Science), tạo đầu dính với Taq polymerase, gắn<br /> vào vector nhân dòng pGEMT-easy và đưa và<br /> E. coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt.<br /> Các gen quan tâm tiếp tục được PCR với cặp<br /> mồi đặc hiệu mang trình tự giới hạn để cắt giới<br /> hạn và chuyển vào cassette biểu hiện gen dưới sự<br /> kiểm soát của promoter 35S trong vector pRTL2.<br /> Trình tự của các cặp mồi đặc hiệu:<br /> + GmMyb-KpnI:<br /> GC GGTACC ATGGCCCAGCGCCGCA<br /> <br /> và<br /> <br /> GmMyb-BamHI:<br /> GC GGATCC TCAGCAAGGCTTAATTTCAAAACCTA<br /> <br /> + GmGLP1-XmaI:<br /> GC CCCGGG ATGAAGCTCACAGGTTTCCTG và<br /> <br /> GmGLP1-BamHI:<br /> GC GGATCC TTATTTCTTAGGAGCAAGCCTAGAC<br /> <br /> + GmCHS7-NcoI:<br /> CCATGG ATGGTTAGCGTAG và<br /> <br /> GmCHS7-XbaI:<br /> AGATCT TCAGATGGCCACAC<br /> <br /> Sau khi các gen quan tâm được đưa vào<br /> cassette biểu hiện gen pRTL2, toàn bộ cassette<br /> biểu hiện gen mang promoter, enhancer, gene<br /> quan tâm cùng trình tự poly A được cắt bằng<br /> enzyme cắt giới hạn AscI và gắn vào vector nhị<br /> thể pZY101-Asc mang gen chọn lọc bar kháng<br /> <br /> ammonium glufosinate. Vector pZY101-Asc<br /> mang cassette biểu hiện gen quan tâm được biến<br /> nạp vào một số chủng A. tumefaciens bằng<br /> phương pháp xung điện. Các chủng khuẩn A.<br /> tumefaciens mang gen được dùng để chuyển nạp<br /> vào hạt đậu tương đang nảy mầm theo phương<br /> pháp của Zeng và cộng sự [33] có cải tiến.<br /> Cây chuyển gen tái sinh trồng ra đất sau<br /> khoảng 20 ngày được phun BASTA (tương<br /> đương ammonium glufosinate 60 mg/L) để kiểm<br /> tra khả năng kháng thuốc trừ cỏ. Các cây sống<br /> sót sau khi phun được thu mẫu lá để phân tích.<br /> Sự có mặt của gen cần chuyển trong cây chuyển<br /> gen được kiểm tra bằng PCR với mồi xuôi nằm<br /> trong<br /> vùng<br /> promoter<br /> 35S_F<br /> (GTGACAGATAGCTGGGCAATG) và mồi<br /> ngược nằm trong gen tương ứng. Như vậy mặc<br /> dù mồi ngược có thể gắn vào gen nội sinh, sản<br /> phẩm PCR chỉ được hình thành trên cassette<br /> biểu hiện gen mang gen cần chuyển nằm ngay<br /> sau promoter 35S.<br /> III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Từ thư viện cDNA của 3 giống đậu tương<br /> DT2008, DT84 và Williams 82, chúng tôi đã tiến<br /> hành PCR và tách chiết được gen GmMYB,<br /> GmGLP1 và GmCHS7, chủ yếu từ giống Williams<br /> 82 với các mẫu sau khi xử lý hạn nhân tạo cho<br /> thấy nhiều khả năng các gen này phản ứng và biểu<br /> hiện trong điều kiện hạn (Hình 2, Hình 3).<br /> <br /> Hình 2. A. Kết quả PCR GmMYB từ các thư viện cDNA của giống Williams 82. M: Thang ADN chuẩn<br /> 1kb plus; 1-5 lần lượt các mẫu cDNA thu ở 0h, 1h, 5h, 12h và 24h sau khi xử lý hạn. B: Kết quả PCR<br /> GmCHS7 từ các thư viện cDNA của giống Williams 82. M: Thang ADN chuẩn 1kb plus; 1-4 lần lượt<br /> các mẫu 1h, 5h, 12h và 24h.<br /> <br /> 261<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> Hình 3. Kết quả PCR GmGLP1từ các thư viện cDNA sau xử lý hạn.M: Thang chuẩn DNA 1kb plus;<br /> 1-5 lần lượt các mẫu 0h, 1h, 5h, 12h và 24h giống DT2008; 6-10: lần lượt các mẫu 0h, 1h, 5h, 12h và<br /> 24h giống Williams82.<br /> Các gen GmMYB, GmGLP1 và GmCHS7 sau<br /> khi được PCR thành công từ thư viện cDNA đã<br /> được đưa vào plasmid pGEMT-easy, nhân dòng<br /> và giải trình tự. Kết quả giải trình tự cho thấy các<br /> gen này mang trình tự đúng với trình tự đã công<br /> <br /> bố trên cơ sở dữ liệu NCBI. Các gen này được<br /> chuyển vào cassette biểu hiện gen dưới sự điều<br /> khiển của promoter 35S và đưa vào vector nhị thể<br /> pZY101-Asc (Hình 4).<br /> <br /> Hình 4. Kết quả PCR kiểm tra cassette biểu hiện gen trong pZY101-Asc mang GmMYB (1) 2742 bp,<br /> GmGLP1 (2) 1884 bp và GmCHS7 (3) 2334 bp.<br /> Sau khi thiết kế thành công các vector nhị<br /> thể pZY101-Asc mang GmMYB, GmGLP1 và<br /> GmCHS7, chúng tôi đã tiến hành biến nạp vào<br /> các chủng A. tumefaciens EHA101, EHA105,<br /> GV3101, LBA4404 và AGL1. Các chủng khuẩn<br /> mang gen này được dùng để chuyển nạp vào<br /> một số giống đậu tương của Việt Nam. Hình 5<br /> minh họa quy trình chuyển nạp gen vào đậu<br /> tương bằng phương pháp gây tổn thương nốt lá<br /> mầm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Các<br /> nghiên cứu trước đây đã cho thấy tần số chuyển<br /> gen vào đậu tương bằng phương pháp này bị<br /> ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong đó có giống<br /> đậu tương sử dụng để tiếp nhận gen. Các giống<br /> đậu tương phản ứng rất khác nhau quy trình tái<br /> 262<br /> <br /> sinh chồi và chọn lọc. Ngay trong giai đoạn nảy<br /> mầm, các giống có tốc độ nảy mầm khác nhau,<br /> ảnh hưởng đến khả năng gây tổn thương nốt lá<br /> mầm và độ mẫn cảm với chuyển nạp. Ở giai<br /> đoạn tái sinh chồi, với cùng một nồng độ chất<br /> kích thích sinh trưởng nhất định, một số giống<br /> đáp ứng tạo chồi rất tốt trong khi các giống<br /> khác tạo mô xốp thay vì phát sinh chồi. Tương<br /> tự, phản ứng của các giống với áp lực chọn lọc<br /> thực vật cũng có khác biệt rõ rệt. Ở cùng một<br /> nồng độ chất chọn lọc ammonium glufosinate,<br /> chồi tái sinh ở một số giống chuyển màu nâu và<br /> chết đồng loạt trong vòng một tuần. Một số<br /> giống khác có khả năng chống chịu cao hơn và<br /> chồi giữ xanh lâu hơn.<br /> <br />