Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 22/ số 1 (Đặc biệt)/ 2017<br />
<br />
PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ ĐỘ SẠCH CỦA THUỐC TADALAFIL TRONG<br />
QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI<br />
Đến tòa soạn 15/12/2016<br />
Vũ Đức Cường<br />
Khoa Công nghệ Hóa học, Trường Đại học Công nghiệp Việt Trì<br />
Phạm Thị Thắm<br />
Trường Đại học Thủy Lợi<br />
Phạm Thế Chính, Nguyễn Thị Hiền, Đoàn Duy Tiên, Nguyễn Văn Tuyến<br />
Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam<br />
SUMMARY<br />
DETERMINATION OF STRUCTURE AND PURITY OF TADALAFIL DRUG BY<br />
MODERN PHYSICOCHEMICAL METHODS<br />
Tadalafil is used to treat male erectile dysfunction. It belongs to phosphordieterase type-5<br />
inhibitor (PDE5) class and inhibits cGMP specific PDE5 which is responsible for<br />
degradation of cGMP in the corpus cavernosum located around the penis. In this article,<br />
the spectrometry analysis to identify the structures and purity of tadalafil has been carried<br />
out. The results determined that 97.5% of the sample products containing tadalafil.<br />
Keywords: tadalafil, PDE5, cGMP<br />
1. MỞ ĐẦU<br />
Tadalafil (1) là thuốc ức chế enzym<br />
phosphodiestease-5 (PDE-5) được sử<br />
dụng hiệu quả điều trị bệnh rối loạn<br />
cương dương [1-2]. Thuốc có tác dụng ức<br />
chế enzym PDE-5 làm nhiệm vụ phân hủy<br />
chất sinh học nitric oxit (NO) và guanosin<br />
monophosphat vòng (cGMP) [3]. Rối loạn<br />
cương dương là do PDE-5 hoạt động quá<br />
mạnh dẫn đến NO và cGMP bị phân hủy,<br />
không tạo được sự giãn mạch cần thiết<br />
giúp cho quá trình cương. Thuốc ức chế<br />
<br />
PDE-5 giúp bảo vệ và duy trì các chất<br />
sinh học tạo sự cương [3-7].<br />
<br />
Tadalafil thương mại có tên là Cialis<br />
20mg, thuốc mới nhất được công nhận sử<br />
dụng tại nhiều nước, có lợi trong việc kéo<br />
dài thời gian tác dụng đến 36 giờ.<br />
Tadalafil là chất ức chế chọn lọc có hồi<br />
45<br />
<br />
phục cGMP, đặc biệt là trên enzym PDE5. Khi kích thích tình dục, nitric oxit được<br />
phóng thích tại chỗ, sự ức chế PDE-5 của<br />
tadalafil làm tăng nồng độ cGMP trong<br />
thể hang dẫn tới sự giãn cơ trơn và làm<br />
tăng dòng máu vào trong mô dương vật,<br />
từ đó gây cương dương vật. Khi không có<br />
kích thích tình dục, tadalafil không có tác<br />
dụng [3-5]. Đây là thuốc sắp hết hạn<br />
quyền bảo hộ nên được nhiều quốc gia<br />
<br />
Packard Mass Spectrometer 5989 MS và<br />
thiết bị HPLC Agilent 1100, cột C18<br />
(150x4,6 mm, 5 μm), Detector DAD,<br />
bước sóng 292nm. Tất cả các thiết bị trên<br />
là của Viện Hoá học - Viện Hàn lâm<br />
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.<br />
<br />
trên thế giới quan tâm nghiên cứu tổng<br />
hợp, nhằm ứng dụng vào sản xuất thương<br />
mại. Trong công trình này, chúng tôi tập<br />
trung nghiên cứu phân tích cấu trúc và<br />
hàm lượng của thuốc tadalafil trong quá<br />
trình tổng hợp bằng các phương pháp hóa<br />
lý hiện đại.<br />
2. THỰC NGHIỆM<br />
2.1. Nguyên liệu và hóa chất<br />
Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp<br />
<br />
clorua (0,129 mol), hỗn hợp khuấy ở nhiệt<br />
độ 0-5 oC trong 24h. Kết thúc phản ứng,<br />
dung môi được loại bỏ ở áp suất thấp sau<br />
đó cho thêm nước và chiết 3 lần bằng<br />
CH2Cl2. Dịch hữu cơ được rửa ba lần<br />
bằng dung dịch K2CO3 10%, sau đó làm<br />
khan với Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở<br />
áp suất thấp thu được sản phẩm thô. Sản<br />
phẩm thô được làm sạch bằng kết tinh lại<br />
trong dung môi diclorometan thu được<br />
<br />
hữu cơ và dung môi được mua của hãng<br />
Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ), sử dụng<br />
trực tiếp. Các dung môi dùng cho quá<br />
trình chiết, chạy sắc ký cột là loại dung<br />
môi công nghiệp được cất lại và làm khan<br />
trước khi sử dụng. Bột silica gel cho sắc<br />
ký cột 100 - 200 mesh (Merck, Đức), bản<br />
mỏng sắc ký silica gel là bản nhôm tráng<br />
<br />
hợp chất 3 (hiệu suất 98%). Hợp chất 3 là<br />
chất rắn màu trắng có điểm chảy 230231oC, 1H NMR-500 MHz (CDCl3): 7,91<br />
(1H, s, NH); 7,58 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5);<br />
7,28 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 7,15-7,25<br />
(3H, m, H-6, H-7, H-5’); 6,84 (1H, d,<br />
J=7,5 Hz, H-6’); 6,63 (1H, s, H-2’); 5,89<br />
(2H, s, H-7’); 5,28 (1H, s, H-1); 4,93 (1H,<br />
<br />
sẵn Art. 5554 DC - Alufolien Kiesel 60<br />
F254 (Merck, Đức).<br />
<br />
sb, H-3); 4,33 (1H, sb, CH2-Ha); 4,19 (1H,<br />
d, J=15,0 Hz, CH2-Hb); 3,68 (3H, s,<br />
<br />
2.2. Thiết bị<br />
Phổ cộng hưởng từ proton 1H-NMR (500<br />
MHz) và cacbon 13C-NMR (125 MHz)<br />
được đo trên máy cô ̣ng hưởng từ ha ̣t nhân<br />
Avance 500 (Bruker, Đức). Phổ FT-IR<br />
được đo trên máy Impact 410-Nicolet và<br />
phổ MS được đo trên máy Hewlett<br />
<br />
OCH3); 3,46 (1H, d, J=16 Hz, H-4a); 3,18<br />
(1H, m, H-4b).<br />
<br />
46<br />
<br />
2.3. Tổng hợp chất 3 (sơ đồ 1)<br />
Dung dịch của chất 2 (0,117 mol) và<br />
0,175 mol Et3N trong 400 mL dung môi<br />
diclorometan, được cho thêm cloaxetyl<br />
<br />
2.4. Tổng hợp tadalafil (sơ đồ 1)<br />
Dung dịch của 3 (54,85 g, 0,129 mol) và<br />
methyl amin (20,0 g, 0,645 mol) trong<br />
EtOH khan (600 mL) được khuấy ở nhiệt<br />
độ phòng trong 48 giờ. Kết thúc phản ứng<br />
<br />
dung môi được loại bỏ ở áp suất thấp thu<br />
được sản phẩm thô. Sản phẩm thô được<br />
kết tinh lại trong hỗn hợp nước-isopropyl<br />
ancol nhận được tadalafil 1 với hiệu suất<br />
91%. Tadalafil là chất rắn màu trắng có<br />
điểm chảy 301-302 oC. 1H NMR-500<br />
MHz (CDCl3): 11,05 (s, NH indol), 7,54<br />
(1H, d, J=7,5 Hz), 7,24 (1H, d, J=8.0 Hz),<br />
7,12 (1H, d, J=7,0 Hz), 7,00 (1H, d, J=7,0<br />
Hz), 6,78 (1H, s), 6,77 (2H, s), 6,09 (1H,<br />
<br />
136,9; 136,2; 133,9; 125,7; 121,1; 119,3;<br />
118,8; 118,0; 111,2; 107,9; 106,9; 104,7;<br />
100,8; 55,5; 55,2; 51,4; 32,8; 23,0.<br />
2.5. Xác định hàm lượng tadalafil theo<br />
phương pháp HPLC<br />
Xây dựng đường chuẩn tadalafil: Cân 2<br />
mg tadalafil chuẩn được pha loãng trong<br />
acetonitrile với các nồng độ như sau: 2<br />
mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,1 mg/ml.<br />
Điều kiện và thiết bị phân tích: Sử dụng<br />
<br />
s), 5,80 (2H, s), 4,19 (1H, dd, J=4,0 Hz;<br />
hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, cột C18<br />
11,5 Hz), 4,17 (1H, d, J=17,0 Hz), 3,87<br />
(150x4,6 mm, 5 μm), Detector DAD,<br />
(1H, d, J=17,0 Hz), 3,52 (1H, dd, J=4,5<br />
bước sóng 292 nm. Pha động acetonitrile<br />
Hz; 16,0 Hz), 3,14 (1H, dd, J=12,0 Hz;<br />
và dung dịch nước (ammonium acetate<br />
13<br />
15,5 Hz), 2,97 (3H, s).<br />
C NMR<br />
2,0%, acid formic 0,2%) = 30:70. Hệ Pha<br />
(DMSO): 166,8; 166,5; 147.0; 146,0;<br />
động được cài đặt như bảng 1:<br />
Bảng 1. Điều kiện phân tích HPLC<br />
Thời gian (phút) %B (acetonitrile) Lưu lượng (ml/phút)<br />
0,00<br />
30<br />
1,0<br />
4,00<br />
30<br />
1,0<br />
5,00<br />
30<br />
1,0<br />
30<br />
30<br />
3,0<br />
Xây dựng đường chuẩn: Đường chuẩn được xây dựng dựa trên phần mềm excel.<br />
Bảng 2. Số liệu xây dựng đường chuẩn<br />
Nồng độ (mg/ml)<br />
2<br />
0,4<br />
0,2<br />
0,1<br />
Phương trình đường chuẩn:<br />
Y= 2373x + 606,46<br />
Trong đó: x là nồng độ của tadalafil<br />
(mg/ml); Y là diện tích pic<br />
Xác định nồng độ tadalafil: Cân 0,8 mg<br />
chất cần phân tích, hòa tan trong 1 ml<br />
acetonitril. Kết quả đo diện tích pic<br />
2466,9. Thay vào phương trình đường<br />
chuẩn ta được x = 0,78 mg/ml. Tính được<br />
mẫu phân tích chứa 97,5% tadalafil.<br />
<br />
Diện tích pic<br />
5493,66<br />
1107,07<br />
505,55<br />
23,.97<br />
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
3.1. Cấu trúc của tadalafil<br />
Tadalafin được tổng hợp qua hai bước<br />
phản ứng theo sơ đồ 1. Đầu tiên, hợp chất<br />
2 được axyl hóa nhờ phản ứng với 1,5<br />
đương lượng cloaxetyl clorua, có mặt của<br />
tác nhân kiềm nhận được hợp chất 3, tiếp<br />
theo được đóng vòng β-cacbolin nhờ phản<br />
ứng với 5 đương lượng metyl amin trong<br />
dung môi EtOH ở nhiệt độ phòng nhận<br />
47<br />
<br />
được tadalafil (1). Cấu trúc của hợp chất 3<br />
được chứng minh trong công trình trước<br />
[15]. Bài báo này tập trung phân tích cấu<br />
<br />
trúc của tadalafil bằng các phương pháp<br />
phổ hiện đại.<br />
<br />
Sơ đồ 1. Tổng hợp tadalafil<br />
Cấu trúc của các hợp chất tadalafil được<br />
chứng minh bằng các phương pháp phổ<br />
FT-IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR. Trên<br />
phổ FT-IR của hợp chất tadalafil (1) có<br />
đỉnh hấp phụ tại 3321 cm-1 đặc trưng của<br />
nhóm amin bậc hai, đỉnh hấp phụ tại 1674<br />
cm-1 đặc trưng cho nhóm C=O, đỉnh hấp<br />
phụ tại 1040 cm-1 đặc trưng cho C-O-C.<br />
<br />
Ngoài ra, trên phổ FT-IR còn xuất hiện<br />
các đỉnh hấp phụ của các liên kết C-H bão<br />
hòa, C-H và C=C của nhân thơm. Trên<br />
phổ ESI-MS cho pic ion phân tử ở m/z<br />
390,0 [M+H]+ và 387,9 [M-H]+ phù hợp<br />
với công thức phân tử C22H19N3O4 của<br />
hợp chất tadalafil.<br />
<br />
Hình 1. Phổ 1H-NMR của tadalafil<br />
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 1 xuất<br />
hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng của<br />
proton có mặt trên phân tử. Tín hiệu cộng<br />
48<br />
<br />
hưởng singlet của ba proton tại 2,97 ppm<br />
là đặc trưng của nhóm N-CH3. Tín hiệu<br />
cộng hưởng doublet-doublet với hằng số<br />
<br />
tương tác 12,0 và 16,0 Hz tại 3,14 ppm<br />
được gán cho proton H-12a. Tín hiệu<br />
cộng hưởng của proton H-12b tại 3,52<br />
ppm với hằng số tương tác 4,5 và 16,0 Hz.<br />
Proton ở vị trí H-3 thể hiện là cặp doublet<br />
tại 3,87 ppm và 4,17 ppm với hằng số<br />
tương tác 17,0 Hz. Proton ở vị trí H-13 là<br />
tín hiệu doublet-doublet tại 4,19 ppm với<br />
hằng số tương tác 4,0 và 11,5 Hz. Proton<br />
ở vị trí H-6 là tín hiệu singlet tại 6,09 ppm.<br />
<br />
của chất 1, trong đó có hai tín hiệu của<br />
nhóm cacbonyl. Phân tích phổ trên cho<br />
phép khẳng định cấu trúc của hợp chất 1<br />
là tadalafil.<br />
<br />
Ngoài ra, trên vùng trường thấp trên 1HNMR của hợp chất 1 thể hiện tín hiệu<br />
cộng hưởng của 8 proton thơm, tín hiệu<br />
cộng hưởng của nhóm etylen tại 5,80 ppm.<br />
Độ dịch chuyển hóa học và các hằng số<br />
tương tác phù hợp với cấu trúc của<br />
tadalafil đã được công bố trong tài liệu [17]. Phổ 13C-NMR thể hiện đầy đủ các tín<br />
hiệu cộng hưởng của 22 nguyên tử cacbon<br />
<br />
606,46, R2=0,9844, trong đó: X là Nồng<br />
độ của tadalafil (mg/ml); Y là diện tích<br />
pic.<br />
Xác định nồng độ tadalafil: Kết quả<br />
HPLC cho biết độ sạch của tadalafil là<br />
97,5%.<br />
<br />
Hình 2. Đường chuẩn định lượng tadalafil<br />
4. KẾT LUẬN<br />
Đã phân tích cấu trúc của tadalafil và các<br />
hợp chất trung gian bằng phương pháp<br />
phổ hiện đại. Đã xác định hàm lượng của<br />
tadalafil theo phương pháp HPLC bằng<br />
việc xây dựng đường chuẩn, kết quả cho<br />
biết mẫu sản phẩm chứa 97,5% tadalafil.<br />
<br />
3.2. Xác định hàm lượng tadalafil bằng<br />
phương pháp HPLC<br />
Xây dựng đường chuẩn: Từ các dữ liệu<br />
trong bảng 2 chúng tôi xây dựng đường<br />
chuẩn dựa trên phần mềm excel (hình 2).<br />
Phương trình đường chuẩn: Y= 2373x +<br />
<br />
Hình 3. Phổ HPLC của tadalafil<br />
Lời cảm ơn: Các tác giả cám ơn sự tài<br />
trợ của đề tài thuộc chương trình Hóa<br />
dược mã số: CNHD.ĐT.055/14-16 để<br />
thực hiện công trình này.<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
1. J. Emmick, M. Mitchell, A. Bedding,<br />
“Pharmacodynamic interactions between<br />
<br />
49<br />
<br />