Phân tích đa dạng di truyền của một số giống gấc ở đồng bằng sông Cửu Long dựa trên trình tự vùng Gene ITS và Gene Matk

Tạp chí Khoa học – 2014, Quyển 3 (2), 25 - 29<br /> <br /> Trường Đại học An Giang<br /> <br /> PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG GẤC Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG<br /> CỬU LONG DỰA TRÊN TRÌNH TỰ VÙNG GENE ITS VÀ GENE MATK<br /> Bùi Văn My Tin1<br /> 1<br /> <br /> ThS. Khoa Khoa học Nông nghiệp, Trường Đại học Cửu Long<br /> <br /> Thông tin chung:<br /> Ngày nhận bài: 13/12/13<br /> Ngày nhận kết quả bình duyệt:<br /> 18/01/14<br /> Ngày chấp nhận đăng:<br /> 30/07/14<br /> Title:<br /> An analysis of morphological<br /> characteristics of several<br /> momordica cochinchinensis in<br /> the Mekong Delta region<br /> based on the sequencing ITS<br /> and MATK gene<br /> Từ khóa:<br /> Gấc, giải trình tự, ITS, matK,<br /> phả hệ<br /> Keywords:<br /> Momordica cochinchinensis<br /> (Lour) (Spreng), sequencing,<br /> matK (megakaryocyteassociated tyrosine Kinase),<br /> genealogy, ITS (internal<br /> Trancribeb Spacer)<br /> <br /> ABSTRACT<br /> In terms of biology, Momordica cochinchinensis (Lour) (Spreng) is a fruit<br /> functional food containing antioxidants protecting cell membranes. The objective<br /> of this study was mapping the pedigree diagram of studied species in Mekong<br /> Delta using sequencing ITS and matK gene. Results fromDNA analysis using<br /> PCR amplifiel for ITS and matK gene showed that the size of ITS1 + 5,8S + ITS2<br /> with primer (ITS1 and ITS4) was identically 600 bp while matK with primer<br /> (matK472F và matK1248R) was approximately 800 bp. Results from ITS and<br /> matK analysis indicated that four samples were relatively homogenous of<br /> genetics ( resulted from sequencing the ITS and matK gene) and the same species<br /> of Momordica cochinchinensis.<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Xét về mặt sinh học quả gấc là loài trái cây thực phẩm chức năng có chứa các<br /> chất chống oxy hoá bảo vệ màng tế bào. Mục tiêu của đề tài này là xây dựng sơ<br /> đồ phả hệ giữa các loài nghiên cứu ở vùng ĐBSCL dựa trên giải trình tự vùng<br /> gene ITS và matK. Qua kết quả xác định DNA từ các mẫu lá gấc bằng phương<br /> pháp phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS và gene matK cho thấy ITS1 + 5,8S +<br /> ITS2 với primer (ITS1 và ITS4) cho cùng kích thước gần 600 bp và matK với<br /> primer (matK472F và matK1248R) cho cùng kích thước gần 800 bp. Kết hợp<br /> tương quan phân tích ITS và matK có thể kết luận bốn mẫu gấc này tương đối<br /> đồng nhất với nhau về di truyền qua phân tích trình tự vùng gene ITS và matK và<br /> đều cùng một loài Momordica cochinchinensis.<br /> <br /> học, nuôi cấy mô, sinh học phân tử, công nghệ<br /> tổng hợp hoá dược,… đã tạo ra các biệt dược khác<br /> nhau sử dụng trong công tác phòng và chữa bệnh<br /> cho con người. Mặc dù việc nghiên cứu một cách<br /> toàn diện từ đặc điểm hình thái, cấu tạo tế bào,<br /> thành phần hóa học, đến phân tích vùng gene ITS<br /> hay gene matK để xác định trình tự DNA, xây<br /> dựng sơ đồ phả hệ,… của những cây cỏ thiên<br /> nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao.<br /> Tuy nhiên, ở nước ta và trên thế giới những công<br /> trình nghiên cứu về các lĩnh vực này còn rất ít. Do<br /> đó đề tài “Phân tích đa dạng di truyền của một số<br /> giống gấc ở Đồng bằng sông Cửu Long dựa trên<br /> trình tự vùng gene ITS và gene matK” được tiến<br /> <br /> 1. GIỚI THIỆU<br /> Quả gấc (Momordica cochinchinensis (Lour)<br /> (Spreng) thuộc họ bầu bí cucurbitaceae, là một<br /> loại quả rất quen thuộc với mỗi chúng ta. Ngoài<br /> giá trị dinh dưỡng gấc còn có tác dụng chữa bệnh,<br /> là trái cây thực phẩm chức năng vì trong trái có<br /> chứa lycopen, β-caroten (tiền vitamin A) và alpha<br /> tocopherol (vitamin E) giữ vị trí quan trọng trong<br /> quá trình chuyển hoá sinh học, là chất chống oxy<br /> hoá bảo vệ sự toàn vẹn màng tế bào.... Ở Việt<br /> Nam có khoảng ba loài thường gọi là gấc nếp, gấc<br /> tẻ và gấc lai. Hiện nay, với sự phối hợp mềm dẻo<br /> của nhiều ngành khoa học như: công nghệ sinh<br /> <br /> 25<br /> <br /> Tạp chí Khoa học – 2014, Quyển 3 (2), 25 - 29<br /> <br /> Trường Đại học An Giang<br /> <br /> hành với mục tiêu nhằm góp phần làm rõ thêm về<br /> đa dạng di truyền, xây dựng sơ đồ phả hệ giữa các<br /> loài nghiên cứu dựa trên giải trình tự vùng gene<br /> ITS và matK.<br /> <br /> cặp mồi trên bằng kít ABI Prism BigDyeTM<br /> Terminator v1.1 Cycle Sequencing trên máy giải<br /> trình tự tự động.<br /> 2.3.1.5 Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương<br /> pháp điện di<br /> <br /> 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> Phát hiện sản phẩm PCR trên gel agarose 2% pha<br /> trong đệm TE 1 X, nhuộm với Ethidium bromide<br /> 2 μl. Cho vào mỗi giếng 7 μl sản phẩm cộng với<br /> loading buffer. Chạy điện di trong 70 phút ở hiệu<br /> thế 100V. Chụp hình gel dưới ánh sáng đèn cực<br /> tím bởi máy đọc và chụp hình gel Bio-Rad UV<br /> 2000. Nếu phổ điện di là băng sáng, rõ, không có<br /> băng phụ là DNA đạt.<br /> <br /> 2.1 Vật liệu<br /> Các mẫu lá của bốn mẫu gấc có đặc tính hình thái<br /> khác nhau được thu từ bốn tỉnh Bến Tre, Vĩnh<br /> Long, Đồng Tháp và Cần Thơ để ly trích DNA.<br /> 2.2 Thời gian, địa điểm<br /> Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh<br /> học phân tử - Viện Nghiên Cứu và Phát triển<br /> Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ.<br /> <br /> 2.3.1.6 Phản ứng gắn huỳnh quang (cycle<br /> sequencing)<br /> <br /> Thời gian: tháng 9/2012 đến tháng 5/2013.<br /> <br /> 2.3.1 Khảo sát trên gene<br /> <br /> Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch và đo nồng<br /> độ sẽ được thực hiện phản ứng PCR để gắn huỳnh<br /> quang. Phản ứng PCR (gắn huỳnh quang) được<br /> thực hiện trong thể tích 10 µl.<br /> <br /> 2.3.1.1 Ly trích DNA<br /> <br /> 2.3.1.7 Tinh sạch sản phẩm gắn huỳnh quang<br /> <br /> Ly trích DNA lá gấc theo qui trình CTAB (Cetyl<br /> trimethylammonium bromide) được mô tả bởi<br /> Rogers và Bendich (1988). Sau khi tách chiết<br /> DNA, chạy điện di nhanh để kiểm tra DNA bằng<br /> gel agarose 0,8% với điện trường 5V/cm trong 15<br /> phút. Chụp hình bằng hệ thống phân tích gel<br /> BioRad UV 2000.<br /> <br /> Sản phẩm Cycle Sequencing được tinh sạch bằng<br /> cồn theo các bước sau:<br /> <br /> 2.3 Phương pháp<br /> <br /> Sau khi kết thúc phản ứng PCR, lấy các tuýp sản<br /> phẩm ra khỏi máy<br /> Thêm 2,5 μl EDTA 125 mM<br /> Cho vào tuýp 30 µl cồn 96% để tủa DNA, ủ ở<br /> nhiệt độ phòng 15 phút<br /> <br /> 2.3.1.2 Thực hiện phản ứng PCR<br /> Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS:<br /> <br /> Lắc ngang và ngược tuýp, để đảm bảo cho phần<br /> dưới đáy rời ra.<br /> <br /> Với cặp mồi<br /> ITS1: 5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′<br /> ITS4: 5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′<br /> <br /> Ly tâm 1000 vòng trong 45 phút, rút bỏ dịch.<br /> Cho vào 30 µl cồn 70% vào để rửa, ly tâm với tốc<br /> độ 10.000 vòng/phút, 20 phút. Bỏ nước. Lặp lại<br /> hai lần.<br /> <br /> Thực hiện phản ứng khuếch đại gene matK:<br /> Với cặp mồi<br /> matK472F:<br /> 5’-CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC-3’<br /> matK1248R:<br /> 5’-GCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGC-3’<br /> <br /> Sấy khô chân không ở 300C khoảng 10 phút.<br /> 2.3.1.8 Biến tính sản phẩm và giải trình tự<br /> Thêm vào 20 μl HiDi Formamide.<br /> Biến tính trên máy PCR Perkin Elmer 9700 ở<br /> 950C trong 7 phút để tách DNA thành sợi đơn.<br /> Sau khi biến tính xong để sản phẩm ngay trên<br /> nước đá trong 2 phút để tránh DNA bắt cặp lại với<br /> nhau.<br /> Hút mẫu đưa vào máy giải trình tự ABI 3130. Đọc<br /> kết quả.<br /> <br /> 2.3.1.3 Giải trình tự sản phẩm PCR vùng gene<br /> ITS và matK<br /> 2.3.1.4 Tinh sạch sản phẩm PCR<br /> Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kít<br /> PureLinkTM PCR Purification (Invitrogen).<br /> Những đoạn PCR tinh sạch được giải trình tự với<br /> 26<br /> <br /> Tạp chí Khoa học – 2014, Quyển 3 (2), 25 - 29<br /> <br /> Trường Đại học An Giang<br /> <br /> 2.3.2 Phân tích và xử lý số liệu<br /> <br /> 3.2 Kết quả phân tích trình tự vùng gene matK<br /> Hình 2 là kết quả sản phẩm PCR thu được của<br /> DNA các mẫu gấc với cặp mồi matK472F và<br /> matK1248R, tất cả các sản phẩm khuếch đại cho<br /> cùng kích thước khoảng gần 800bp. Kết quả này<br /> cũng tương đối phù hợp với các kết quả nghiên<br /> cứu của Yu, J., J.H. Xue, và S.L. Zhou (2011)<br /> khuếch đại đoạn matK khoảng 776bp, chất lượng<br /> chuỗi nucleotide cao.<br /> <br /> Các mẫu sau khi giải trình tự sẽ được truyền qua<br /> máy tính và phân tích bằng phần mềm BioEdit<br /> 7.0.5.3. để xếp hàng (Alignment) các trình tự. Sau<br /> đó dùng phần mềm Mega 5.2.2 để phân tích dữ<br /> liệu trên giản đồ phả hệ (Trần Nhân Dũng &<br /> Nguyễn Vũ Linh, 2011).<br /> 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1 Kết quả phân tích trình tự vùng gene ITS<br /> <br /> 1500bp<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> M<br /> <br /> M<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 600bp<br /> 500bp<br /> <br /> 500bp<br /> <br /> Hình 2: Sản phẩm PCR với cặp mồi matK472F và<br /> matK1248R trên gel agarose 1,5%<br /> Chú thích:<br /> (M): thang chuẩn 100bp; (1): Đối chứng âm; (2): VL4;<br /> (3): BT2; (4): ĐT2; (5): CT2<br /> <br /> Hình 1: Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4 trên<br /> gel agarose 1,5%<br /> Chú thích:<br /> (1): VL4; (2): BT2; (3): đối chứng âm; (4): ĐT2; (5): CT2;<br /> (M): thang chuẩn 100bp<br /> <br /> 3.3 Giản đồ cây phát sinh loài<br /> <br /> Đoạn mồi tiêu chuẩn ITS1 và ITS4 khuếch đại<br /> phân đoạn tương ứng với gene 5,8S và hai vùng<br /> lân cận ITS1 và ITS2. Sản phẩm PCR thu được có<br /> chất lượng tốt với một băng rõ duy nhất cho mỗi<br /> loài gấc trên gel điện di (Hình 1). Tất cả các sản<br /> phẩm khuếch đại nằm ở vị trí có kích thước<br /> khoảng 500bp đến 600bp. Đoạn gene ITS có kích<br /> thước nhỏ (600bp đến 700bp) và trình tự lặp lại<br /> cao (Baldwin &cs., 1995). Như vậy, kích thước<br /> vùng gine ITS được khuếch đại là phù hợp.<br /> <br /> Đa dạng các mẫu gấc qua phân tích vùng ITS<br /> Kết quả phân tích trình tự ITS rất tốt, tuy có sai số<br /> nhưng chấp nhận được (giản đồ Hình 3), với<br /> CI=0,973333 và RI=0,913043. Khi phân tích<br /> giống loài các cá thể có quan hệ cùng loài chỉ số<br /> này lớn hơn 7. CI=0, 973333 cho thấy các trình tự<br /> này không có sự thay đổi nhiều. Trong tập đoàn<br /> phân tích các nhân tố biến động không nhiều.<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 3: Giản đồ đa dạng sinh học các mẫu gấc qua phân tích vùng ITS (chỉ số tương đồng được ghi trên đầu các<br /> nhánh. Hai mẫu AY606266.1 và AM981080.1 là outgroup).<br /> <br /> 27<br /> <br /> Tạp chí Khoa học – 2014, Quyển 3 (2), 25 - 29<br /> <br /> Trường Đại học An Giang<br /> <br /> Dựa vào giản đồ hình nhánh (Hình 3), các mẫu<br /> gấc thu thập được chia làm hai nhóm chính:<br /> <br /> Trình tự đoạn ITS có thể dùng phân biệt các loài<br /> Momordica cochinchinensis (CT2) và ba mẫu<br /> VL4, ĐT2 và BT2 có thể là Momordica<br /> angustisepala.<br /> <br /> Nhóm A: Gồm mẫu CT2 thu được từ nhà lưới 1 –<br /> Bộ môn sinh lý – Khoa Nông Nghiệp – Đại học<br /> Cần Thơ với chỉ số bootstrap là 100% được xếp<br /> thành nhóm riêng so với các mẫu nhóm B. Và cho<br /> kết quả tương đồng 100% với hai mẫu đối chứng<br /> là AY606266.1 và AM981080.1. Điều này có thể<br /> giải thích là đối với các mẫu có mức tương đồng<br /> 100% thì chúng có thể xuất phát cùng một nguồn<br /> gốc và không bị biến đổi kiểu gene dưới tác động<br /> của môi trường, đối với các mẫu có độ tương<br /> đồng thấp hơn 100% thì có thể chúng có nguồn<br /> gốc khác nhau hoặc có cùng nguồn gốc nhưng do<br /> tác động của môi trường và phản ứng lại sự thay<br /> đổi này là khác nhau ở mỗi cá thể.<br /> <br /> Mặt khác, bốn mẫu này so với hai mẫu đối chứng<br /> AY606266.1 (trình tự vùng ITS1, 5,8S, ITS2 của<br /> Momordica cochinchinensis ở Trung Quốc, 2004)<br /> và mẫu AM981080.1 (trình tự vùng ITS1, 5,8S,<br /> ITS2 của Momordica angustisepala ở Đức, 2009)<br /> với chỉ số bootstrap là 100% thì có sự khác biệt và<br /> được phân thành nhóm riêng biệt.<br /> Phả hệ các mẫu gấc qua phân tích matK<br /> Kết quả phân tích trình tự vùng matK rất tốt giản<br /> đồ (Hình 4). Với chỉ số CI=0,812500 và<br /> RI=0,625000, CI=0,812500 cho thấy các trình tự<br /> này còn có sự thay đổi nhiều. Trong tập đoàn<br /> phân tích các nhân tố còn nhiều biến động.<br /> <br /> Nhóm B: Gồm ba mẫu VL4, ĐT2 và BT2. Chỉ số<br /> bootstrap của nhóm này là 50%. Trong nhóm này<br /> cho thấy các trình tự rất đa dạng, biến đổi nhiều.<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 4: Giản đồ phả hệ các mẫu gấc qua phân tích vùng gene matK (chỉ số tương đồng được ghi trên đầu các<br /> nhánh. Hai mẫu GQ163380.1 và GQ163447.1 là outgroup).<br /> <br /> Giản đồ phả hệ (Hình 4) chia các giống gấc ra<br /> thành hai nhóm chính:<br /> <br /> một nhóm 50 lần, chứng tỏ nhóm A và B có thể<br /> có cùng nguồn gốc với nhau. Bốn mẫu gấc trong<br /> giản đồ không phân thành hai nhóm như ở trường<br /> hợp đoạn gene ITS. Tuy nhiên, theo sơ đồ phả hệ,<br /> chỉ số bootstrap của mẫu CT2 là 100% trong khi<br /> chỉ số bootstrap của mẫu CT2 ở đoạn gine ITS là<br /> 50%.<br /> <br /> Nhóm A: Gồm ba mẫu BT2, ĐT2 và VL4. Các<br /> mẫu tuy được thu thập từ các vùng địa lý khác<br /> nhau nhưng được xếp vào cùng một nhóm với chỉ<br /> số bootstrap là 50%. Các mẫu trong nhóm còn<br /> nhiều biến động.<br /> <br /> 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ<br /> <br /> Nhóm B: Gồm mẫu CT2 được xếp thành nhóm<br /> riêng so với các mẫu nhóm A với chỉ số bootstrap<br /> là 50%, cho thấy mức độ khác biệt về mặt di<br /> truyền so với những mẫu gấc khác, nghĩa là khi so<br /> sánh và xếp nhóm thì mẫu gấc này xếp trong cùng<br /> <br /> 4.1 KẾT LUẬN<br /> Không có sự khác biệt về hình thái giữa các mẫu<br /> gấc ở bốn tỉnh Vĩnh Long, Bến Tre, Đồng Tháp<br /> và Cần Thơ, và cũng không có sự khác biệt khi so<br /> 28<br /> <br /> Tạp chí Khoa học – 2014, Quyển 3 (2), 25 - 29<br /> <br /> Trường Đại học An Giang<br /> <br /> sánh với mô tả của Đỗ Huy Bích và cs. (2003),<br /> Đỗ Tất Lợi (1986), và Phạm Hoàng Hộ (1999).<br /> Việc khảo sát sự đa dạng nguồn gene của các mẫu<br /> giữa các quần thể địa lý khác nhau điều này sẽ<br /> quan trọng hơn giữa các mẫu trong cùng một quần<br /> thể. Các mẫu gấc thu được từ bốn tỉnh Vĩnh Long,<br /> Bến Tre, Đồng Tháp và Cần Thơ tương đối đồng<br /> nhất với nhau về di truyền qua phân tích trình tự<br /> vùng gene ITS và matK. Có thể các mẫu VL4,<br /> BT2, ĐT2 và CT2 đều là Momordica<br /> cochinchinensis.<br /> <br /> Ribosomal DNA: A valuable Source of Evidence<br /> on Angiosperm Phylogeny. Annals of the Missouri<br /> Botanical Garden, 82(2), 247-277.<br /> Chu Hoàng Mậu. (2005). Cơ sở và phương pháp sinh<br /> học phân tử. Hà Nội: Nhà xuất bản Đại học Sư<br /> phạm, tr. 85-87.<br /> Đỗ Huy Bích., Đặng Quang Chung., Bùi Xuân<br /> Chương., Nguyễn Thượng Dong., Đỗ Trung Đàm.,<br /> Phạm Văn Hiển., Vũ Ngọc Lộ., Phạm Duy Mai.,<br /> Phạm Kim Mãn., Đoàn Thị Nhu., Nguyễn Tập.,<br /> Trần Đoàn., & Viện Dược Liệu. (2003). Cây thuốc<br /> và động vật làm thuốc ở Việt Nam (tập 1). Hà Nội:<br /> Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 1057 trang.<br /> Đỗ Tất Lợi. (2003). Những cây thuốc và vị thuốc Việt<br /> Nam. Hà Nội: Nhà xuất bản Y học Dân tộc.<br /> Phạm Hoàng Hộ. (1999). Cây cỏ Việt Nam (quyển 1).<br /> Hà Nội: Nhà xuất bản trẻ Hà Nội, tr. 568.<br /> Rogers, S. O., A. J. Bendich. (1988). Extraction of<br /> DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology<br /> Manual A6, 1 - 10.<br /> Trần Nhân Dũng & Nguyễn Vũ Linh. (2011). Giáo<br /> trình Tin sinh học. Cần Thơ: Nhà xuất bản Đại học<br /> Cần Thơ, tr. 103-111.<br /> Trần Nhân Dũng & Võ Hùng Nhiệm. (2009). Ứng dụng<br /> Công nghệ sinh học trong phân loại và nhận diện<br /> giống xoài ở Đồng Tháp. Đề tài NCKH cấp tỉnh.<br /> Đồng Tháp, tr. 11.<br /> Yu, J., J. H. Xue, S. L. Zhou. (2011). New universal<br /> matK primers for DNA barcoding angiosperms.<br /> Journal of Systematics and Evolution, 49, 176–181.<br /> <br /> Như vậy, các mẫu thu được từ những khu vực địa<br /> lý khác nhau cũng có thể ảnh hưởng đến trình tự<br /> vùng gene ITS hoặc matK nhưng chưa đủ để gây<br /> biến đổi các giống gấc hiện hành.<br /> 4.2 KIẾN NGHỊ<br /> Do điều kiện thời gian và kinh phí nên đề tài chỉ<br /> nghiên cứu trên phạm vi địa lý hẹp, không có sự<br /> khác biệt rõ rệt. Vì vậy, các nghiên cứu cần được<br /> tiến hành trên phạm vi rộng hơn, có sự tách biệt<br /> về mặt địa lý và di truyền học.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Baldwin, B. G., M. J. Sanderson., J. Mark Porter., M. F.<br /> Wojcichowski., C. S. Campbell., & M. J.<br /> Donoghue. (1995). The its Region of<br /> nuclear<br /> <br /> 29<br /> <br />