Phân tích di truyền từ một tế bào để phát hiện đột biến gây bệnh beta thalassemia bằng phương pháp minisequencing

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TỪ MỘT TẾ BÀO ĐỂ PHÁT HIỆN<br /> ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH BETA-THALASSEMIA<br /> BẰNG PHƢƠNG PHÁP MINISEQUENCING<br /> Trần Văn Khoa*; Ngô Trường Giang*; Đặng Tiến Trường* Nguyễn Đình Tảo*<br /> Triệu Tiến Sang*; Nguyễn Thu Hà**; Hoàng Đặng An Sinh*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: hoàn thiện quy trình phát hiện các đột biến gây bệnh beta -thalassemia từ 1 tế bào<br /> bạch cầu bằng phương pháp minisequensing. Đối tượng và phương pháp: tế bào bạch cầu<br /> lympho của 9 bệnh nhân (BN) hoặc người mang đột biến gen beta-globin được tách khỏi máu<br /> toàn phần bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng dùng ficoll, lấy 1 bạch cầu dưới kính hiển vi soi<br /> nổi, sau đó ly giải tế bào, nhân gen beta-globin bằng nested PCR, chạy minisequensing, điện di<br /> tự động phát hiện đột biến gây bệnh đối chiếu với kết quả phân tích từ máu toàn phần bằng<br /> phương pháp ARMS-PCR và multiplex ARMS-PCR. Kết quả và kết luận: các đột biến trên đối<br /> tượng trong phạm vi nghiên cứu đều được phát hiện khi phân tích với 1 tế bào bạch cầu, phù<br /> hợp kết quả phân tích từ máu ngoại vi toàn phần để phục vụ cho chẩn đoán di truyền trước<br /> chuyển phôi.<br /> * Từ khóa: Beta-thalassemia; Một tế bào; Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ; Minisequencing.<br /> <br /> Single Cell Genetic Analysis for Mutation Detection in Beta-thalassemia<br /> Using Minisequencing Method<br /> Summary<br /> Objectives: Setting up a protocol for detection of beta-thalsassemia induced mutations from<br /> unique lymphocyte using minisequencing method. Subjects and methods: 9 peripheral blood<br /> lymphocytes of beta-thalassemia patients or beta-globin mutation carriers were isolated using<br /> density gradient centrifugation with ficoll. One lymphocyte was taken using stereoscopic microscope,<br /> then lysised. Beta-globin gene was amplified with nested PCR. Minisequencing and electrophoresis<br /> were performed to detect mutations in comparison with ARMS-PCR and multiplex ARMS-PCR<br /> method. Results and conclusions: All kinds of common mutations in the subjects were detected<br /> using unique lymphocyte as same result using whole peripheral blood sample.<br /> * Key words: Beta-thalssemia; Single cell; Preimplantation genetic diagnosis; Minisequencing.<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Viện Huyết học Truyền máu Trung ương<br /> Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tvkhoabi@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 09/10/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/11/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 27/12/2014<br /> <br /> 32<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Beta-thalassemia là một trong những<br /> bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất trên<br /> thế giới [1]. Ở Việt Nam, ước tính có<br /> khoảng 5 triệu người mang gen và bị<br /> bệnh. Hàng năm có khoảng 2.000 trẻ<br /> được sinh ra mắc bệnh thalassemia. Các<br /> đột biến gen beta-globin gây ra bệnh<br /> beta-thalassemia thường là các đột biến<br /> điểm. Tại khu vực Đông Nam Á, một số<br /> đột biến thường gặp là: Cd17, Cd 41/42,<br /> Cd71/72, -28, IVS1-1, IVS1-5, IVS2-654,<br /> CD26, CD95 [2].<br /> Điều trị cho những BN này tạo ra gánh<br /> nặng cả về kinh tế cũng như tinh thần cho<br /> gia đình và toàn xã hội. Chính vì vậy, việc<br /> phòng bệnh và khống chế sự phát tán<br /> bệnh ra cộng đồng là rất cấp thiết.<br /> Hiện nay, bằng một số biện pháp can<br /> thiệp chẩn đoán trước sinh như chọc hút<br /> nước ối hay sinh thiết gai rau đã phần<br /> nào hạn chế sinh ra những trẻ bị bệnh.<br /> Tuy nhiên, những phương pháp này<br /> thường tiến hành khá muộn, nếu dừng<br /> thai kỳ sẽ ảnh hưởng lớn tới sức khỏe<br /> thai phụ. Chẩn đoán di truyền trước<br /> chuyển phôi (Preimplantation genetic<br /> diagnosis - PGD) là phương pháp sàng<br /> lọc phôi bất thường về mặt di truyền<br /> được thực hiện trước khi cấy phôi vào tử<br /> cung người mẹ, đây là một phương pháp<br /> dự phòng hiệu quả các bệnh di truyền,<br /> trong đó có beta-thalassemia [3, 4, 5, 6].<br /> Tuy nhiên, đây là một kỹ thuật khó, chỉ<br /> tiến hành trên 1 hoặc 2 tế bào [1].<br /> Minisequencing là phương pháp trực tiếp,<br /> sử dụng các mồi đặc hiệu và nucleotid<br /> gắn huỳnh quang để phát hiện đột biến<br /> điểm [2]. Để thực hiện kỹ thuật này, cần<br /> có một quy trình phát hiện đột biến gen<br /> 33<br /> <br /> trên 1 tế bào. Do đó, chúng tôi thực hiện<br /> nghiên cứu này với mục tiêu: Hoàn thiện<br /> quy trình phát hiện các đột biến gây bệnh<br /> beta-thalassemia từ 1 tế bào bạch cầu<br /> bằng phương pháp minisequensing, làm<br /> tiền đề cho chẩn đoán di truyền trước<br /> chuyển phôi.<br /> ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT VÀ PHƢƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 9 mẫu máu của 9 thành viên thuộc 3<br /> gia đình gồm bố, mẹ mang gen đột biến<br /> gây bệnh beta-thalassemia có con bị<br /> bệnh beta-thalassemia đang điều trị tại<br /> Trung tâm Thalassemia, Viện Huyết học<br /> Truyền máu Trung ương, có kết quả sàng<br /> lọc đột biến beta-thalassemia từ ADN<br /> máu toàn phần bằng phương pháp<br /> ARMS-PCR và multiplex ARMS-PCR<br /> (làm đối chứng). Tất cả các trường hợp<br /> được lấy 5 ml máu cho vào ống chống<br /> đông bằng EDTA để tiến hành các bước<br /> tiếp theo (tách tế bào, ly trích ADN, nhân<br /> gen, tiến hành giải trình tự tại Trung tâm<br /> Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học<br /> viện Quân y).<br /> 2. Hóa chất.<br /> - Hóa chất tách bạch cầu: dung dịch<br /> cân bằng, dung dịch ficoll (d = 1,077).<br /> - Hóa chất ly giải tế bào: dung dịch<br /> KOH 0,2 M, dung dịch tricine 0,2 M.<br /> - Hóa chất tinh sạch: SAP, EXO1.<br /> - Hóa chất điện di tự động: hidi-formamid,<br /> geneScan-120 LIZ.<br /> - Hóa chất cho PCR: PCR Reaction<br /> mix, ADN polymerase, primers, minisequensing<br /> primers, SNaPshot multiplex kit.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> - Thiết bị: máy ly tâm văng, kính hiển vi<br /> soi nổi có độ phóng đại 320X, buồng thao<br /> tác PCR (Mỹ), máy PCR ABI 9700<br /> (Applied Biosystem), hốt ủ hóa chất (Hàn<br /> Quốc), máy điện di tự động 3130xl Genetic<br /> analyzer, hệ thống điện di trên gen.<br /> 3. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> - Tách tế bào bạch cầu bằng phương<br /> pháp ly tâm tỷ trọng sử dụng ficoll-paque<br /> theo quy trình của nhà sản xuất.<br /> - Pha loãng bạch cầu bằng dung dịch<br /> PBS 1X, gắp 1 tế bào bạch cầu trên kính<br /> hiển vi soi nổi đặt vào ống PCR 0,2 ml.<br /> - Ly giải tế bào bằng 5 μl KOH 0,2 M, ủ<br /> 650C trong 10 phút, trung hòa KOH bằng<br /> 5 μl tricine 0,2 M.<br /> - Tiến hành phản ứng nested PCR<br /> theo Wang và CS (2003), có cải biên [2].<br /> Cụ thể:<br /> <br /> + PCR vòng 1: nhân gen beta-globin<br /> với thể tích 50 μl chứa dịch ly giải 1 tế<br /> bào bạch cầu; 0,2 μm mỗi primer vòng 1;<br /> 0,2 mM mỗi loại deoxyribonucleotid<br /> triphosphat (dNTP) và 2,5 đơn vị HotStarTaq<br /> ADN polymerase (Qiagen) trong 1X PCR<br /> buffer chứa 1,5 mM MgCl2.<br /> + PCR vòng 2: nhân gen beta-globin,<br /> sử dụng 3 μl sản phẩm PCR vòng 1 với<br /> thể tích 50 μl. Thành phần phản ứng<br /> tương tự như vòng 1, ngoại trừ ADN<br /> polymerase giảm còn 1 đơn vị. Chu trình<br /> nhiệt tương tự như PCR vòng 1.<br /> - Minisequencing được tiến hành với<br /> SNaPshotTM multiplex ready reaction mix<br /> (Applied Biosystems) và 0,2 μm mỗi<br /> minisequencing primer theo quy trình của<br /> nhà sản xuất.<br /> - Trình tự mồi gen beta-globin 2 vòng:<br /> <br /> beta-F1*<br /> <br /> ACGGCTGTCATCACTTAGAC<br /> <br /> HUMHBB: 62010-62029<br /> <br /> beta-R1*<br /> <br /> AAGAGGTATGAACATGATTAGC<br /> <br /> HUMHBB: 63466-63445<br /> <br /> BGLO-2F<br /> <br /> GTCATCACTTAGACCTCACC<br /> <br /> HUMHBB: 62016-62035<br /> <br /> BGLO-2R<br /> <br /> CAGAATAATCCAGCCTTATCC<br /> <br /> HUMHBB: 63424-63404<br /> <br /> 1.457 bp<br /> <br /> 1.409 bp<br /> <br /> Bảng 1: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nested PCR.<br /> phót<br /> 0<br /> <br /> 95 C<br /> <br /> 45 giây<br /> <br /> 0<br /> <br /> 56 C<br /> <br /> 45 giây<br /> <br /> 0<br /> <br /> 72 C<br /> <br /> 2 phút<br /> <br /> 0<br /> <br /> 5 phút<br /> <br /> 72 C<br /> <br /> chu kú<br /> <br /> 30 chu kỳ<br /> <br /> 1 chu kỳ<br /> <br /> Sản phẩm nhân vòng 2 được tinh sạch bằng 2 enzym SAP và EXO1, chạy multiplex<br /> minisequensing theo quy trình kit ABI PRIMER TSNaPshot Multiplex (Applied Biosystems)<br /> với các mồi minisequencing.<br /> <br /> 34<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> Bảng 2: Trình tự các mồi sử dụng cho<br /> minisequencing.<br /> <br /> SNP-654<br /> <br /> TGATAATTTCTGGGTTAAGG<br /> <br /> SNP-28<br /> <br /> (gact)7 GATGGCTCTGCCCTGACTT<br /> <br /> Cd 26)<br /> <br /> (gact)3 CAACCTGCCCAGGGCCT<br /> <br /> Cd 17R<br /> <br /> act (gact)7<br /> CAACTTCATCCACGTTCACCT<br /> <br /> Cd 28R<br /> <br /> (gact)6 GATGGCTCTGCCCTGACTT<br /> <br /> Cd 71/72F<br /> IVSI-1R<br /> <br /> kế, băng điện di rõ, nét, đẹp, không thấy<br /> sản phẩm phụ.<br /> 2. Kết quả điện di tự động phát hiện<br /> đột biến.<br /> A TT<br /> THB16<br /> <br /> T<br /> THM16<br /> <br /> C<br /> <br /> ct (gact)8<br /> AGAAAGTGCTCGGTGCCTTTA<br /> TCTTGTAACCTTGATACCAA<br /> <br /> Sản phẩm minisequencing được điện<br /> di huỳnh quang trên máy 3130xl Genetic<br /> analyzer, phân tích bằng phần mềm<br /> GeneMapper ID v 3.2. Đánh giá kết quả<br /> phát hiện đột biến dựa vào kích thước,<br /> màu sắc và độ lớn của các pic thu được<br /> trên điện di huỳnh quang.<br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn<br /> 1. Kết quả nhân gen beta-globin.<br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh điện di tự động sản<br /> phẩm minisequencing mẫu THM16<br /> và THB16.<br /> THM16 (mẫu máu của người mẹ gia<br /> đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử Cd26,<br /> pic bên phải màu đen là nucleotid C (bình<br /> thường), pic bên trái màu đỏ là nucleotid<br /> T (đột biến).<br /> THB16 (mẫu máu của người bố gia<br /> đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử Cd17,<br /> pic bên phải xanh lá cây là nucleotid A<br /> (đột biến), pic bên trái đỏ là nucleotid T<br /> (bình thường).<br /> A<br /> <br /> T<br /> <br /> T<br /> THC16<br /> <br /> Hình 1: Hình ảnh điện di trên gel agarose<br /> sản phẩm khuếch đại vòng 2<br /> gen beta-globin.<br /> Marker ADN 1 kp (dải giữa); chứng âm<br /> (dải thứ nhất); chứng dương (dải thứ hai);<br /> 9 dải còn lại: băng gen beta-globin, kích<br /> thước tương đương 1.409 bp của 9 thành<br /> viên thuộc 3 gia đình.<br /> Sản phẩm nhân gen có chất lượng tốt,<br /> kích thước phù hợp với dự kiến theo thiết<br /> 35<br /> <br /> C<br /> <br /> Hình 3: Hình ảnh điện di tự động sản<br /> phẩm minisequencing mẫu THC16.<br /> THC16 (mẫu máu của người con<br /> gia đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử<br /> Cd26/Cd17.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> A<br /> <br /> A<br /> <br /> T<br /> <br /> T<br /> <br /> Hình 4: Hình ảnh điện di tự động sản<br /> phẩm minisequencing mẫu<br /> THB24,THM24.<br /> THB24,THM24 (mẫu máu của người<br /> bố, mẹ gia đình 24) mang kiểu gen dị hợp<br /> tử Cd17, pic bên phải xanh lá cây là<br /> nucleotid A (đột biến), pic bên trái đỏ là<br /> nucleotid T (bình thường).<br /> A<br /> <br /> Hình 6: Hình ảnh điện di tự động sản<br /> phẩm minisequencing mẫu THM48 và<br /> THB48.<br /> THM48 (mẫu máu của người mẹ gia<br /> đình 48) mang kiểu gen dị hợp tử IVS1-1,<br /> pic phải màu đen là nucleotid C (bình<br /> thường), pic trái màu đỏ là nucleotid T<br /> (đột biến).<br /> THB48 (mẫu máu của người bố gia<br /> đình 48) mang kiểu gen dị hợp tử<br /> Cd41/42, pic phải xanh da trời là<br /> nucleotid G (đột biến), pic trái màu đen là<br /> nucleotid C (bình thường).<br /> <br /> Hình 5: Hình ảnh điện di tự động sản<br /> phẩm minisequencing mẫu THC24.<br /> THC24 (mẫu máu của người con gia<br /> đình 24) mang kiểu gen đồng hợp tử<br /> Cd17, chỉ xuất hiện 1 pic xanh lá cây,<br /> nucleotid A (đột biến).<br /> A<br /> <br /> Kết quả điện di minisequencing phân<br /> tích xác định đột biến rõ ràng, phát hiện<br /> được cả 9 trường hợp: người lành mang<br /> gen (THM16, THB16, THM24, THB24,<br /> THM48, THB48), đồng hợp tử gây bệnh<br /> (THC24) và dị hợp tử của 2 đột biến<br /> (THC16, THC48).<br /> Dưới đây là kết quả tổng hợp phát<br /> hiện các đột biến gen beta-globin từ 1 tế<br /> bào bạch cầu tách từ máu ngoại vi của 9<br /> thành viên thuộc 3 gia đình có con mắc<br /> bệnh beta-thalassemia.<br /> <br /> 36<br /> <br />