Phân tích định lượng và phân tích tổng thể sắc đồ nhằm đánh giá chất lượng Đại hoàng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG VÀ<br /> PHÂN TÍCH TỔNG THỂ SẮC ĐỒ NHẰM ĐÁNH GIÁ<br /> CHẤT LƢỢNG ĐẠI HOÀNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Chử Văn Mến*; Nguyễn Văn Long*; Vũ Tuấn Anh*<br /> TÓM TẮT<br /> Phƣơng pháp phân tích định lƣợng kết hợp với phân tích tổng thể sắc đồ đƣợc phát triển<br /> nhằm đánh giá chất lƣợng Đại hoàng dựa trên sắc đồ đặc trƣng. 5 hoạt chất gồm:<br /> chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin và sennoside A đƣợc định lƣợng.<br /> Thực hiện phân tách trên cột pha đảo C18 với chƣơng trình gradient sử dụng dung môi A<br /> (dung dịch 0,05 M axit phosphoric trong nƣớc) và dung môi B (acetonitrile), bƣớc sóng<br /> 280 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Chƣơng trình rửa giải gồm: 0 - 5 phút (20% B), 18 phút<br /> (28% B), 25 phút (42% B), 30 phút (100% B) cho kết quả tách tốt. Phƣơng pháp trên đƣợc<br /> áp dụng cho 31 mẫu Đại hoàng gồm các loài khác nhau. Kết quả: hàm lƣợng hoạt chất biến<br /> động nhiều trong các mẫu Đại hoàng và không khác biệt giữa các loài Đại hoàng. Ở phân<br /> tích tổng thể sắc đồ, 17 pic chính đƣợc chọn. Phân tích phân biệt tuyến tính LDA cho thấy<br /> các mẫu đƣợc phân loại thành 4 nhóm với độ chính xác 100%. Nghiên cứu này cho thấy:<br /> việc kết hợp định lƣợng các hoạt chất cùng với phân tích tổng thể sắc đồ giúp tiếp cận toàn<br /> diện trong đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu nói chung và Đại hoàng nói riêng.<br /> * Từ khóa: Đại hoàng; Sắc ký lỏng hiệu năng cao; Đánh giá chất lƣợng.<br /> <br /> QUANTITATIVE AND PATTERN ANALYSIS FOR THE QUALITY<br /> EVALUATION OF RHEI RHIZOMA BY HPLC<br /> SUMMARY<br /> A quantitative and pattern analysis for the quality evaluation of Rhei rhizoma by HPLC<br /> based on chromatographic fingerprints in 40 minutes was developed. Five marker compounds,<br /> namely, chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin and sennoside A were quantitated.<br /> The chromatographic separation was performed on a C18 column by gradient elution with<br /> 0.05 M phosphoric acid in water and acetonitrile, the wavelength was set at 280 nm, the flow<br /> rate was set at 1 ml/min, gradient condition as followed: 0 - 5 min (20% B);<br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 16/8/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 31/10/2013<br /> Ngày bài báo được đăng: 5/11/2013<br /> <br /> 31<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> 18 min (28% B); 25 min (42% B); 30 min (100% B) gave the satisfied separation. The developed<br /> method was applied to the quantitation of 31 samples of different Rhei Rhizoma species.<br /> The results showed that the contents of bioactive compounds were fluctuated among samples<br /> and there were no difference among Rhubarb species. For pattern analysis, seventeen<br /> common peaks were selected. LDA (Linear Discriminant Analysis) showed that the samples<br /> were clustered into 4 different groups of species with the accuracy of 100%. This study<br /> showed that quantitative determination of marker compounds combined with patternrecognition method can provide a comprehensive approach for the quality assessment of<br /> herbal medicines.<br /> * Key words: Rhei Rhizoma; HPLC; Quality evaluation.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> Đại hoàng (Rhei Rhizoma) là một<br /> nhóm loài trong chi Rheum thuộc họ<br /> Rau răm (Polygonaceae). Có ba loài của<br /> chi Rheum có trong Dƣợc điển Việt Nam,<br /> Hàn Quốc và Trung Quốc bao gồm:<br /> R. tanguticum, R. palmatum và R. officinale<br /> [1, 2, 3]. Trong dƣợc điển Nhật Bản,<br /> ngoài ba loài trên còn có thêm Rheum<br /> coreanum và những loài lai giữa các loài<br /> trên là dƣợc liệu Đại hoàng [4]. Ngoài<br /> ra, các loài không chính thức nhƣ Rheum<br /> undulatum, Rheum rhaponticum, Rumex<br /> crispus, Rumex aquatica và Reynoutria<br /> elliptica thƣờng bị nhầm là Đại hoàng.<br /> Trong một số trƣờng hợp, việc xác định<br /> loài dựa trên phân tích mô học giữa các<br /> loài của mẫu Đại hoàng trên thị trƣờng<br /> cực kỳ khó khăn. Nhiều nhà nghiên cứu<br /> và thầy thuốc đông y thƣờng bị nhầm<br /> lẫn bởi sự không rõ ràng của nhiều loài<br /> trong việc sử dụng dƣợc liệu Đại hoàng.<br /> Do vậy, đánh giá chất lƣợng Đại hoàng<br /> dựa trên thành phần hoạt chất đóng vai<br /> trò<br /> rất quan trọng trong kiểm soát chất<br /> lƣợng của Đại hoàng.<br /> Đại hoàng đƣợc biết đến với nhiều<br /> hoạt tính sinh học nhƣ nhuận tràng ,<br /> <br /> lợi mật, bảo vệ gan, kháng virut, kháng<br /> viêm... [5, 6, 7]. Các hoạt chất chính<br /> của Đại hoàng gồm: các anthraquinone<br /> nhƣ chrysophanol, emodin [8], dianthrone<br /> nhƣ sennoside A [9] hay stilbene nhƣ<br /> rhaponticin [10]. Phân tích định lƣợng<br /> đơn thuần một số chất đánh dấu không<br /> thể phân biệt Đại hoàng thật và giả.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi kết hợp<br /> giữa phân tích định lƣợng và phân tích<br /> tổng thể sắc đồ nhằm đánh giá toàn diện<br /> chất lƣợng Đại hoàng từ các loài khác<br /> nhau.<br /> <br /> Hình 1: Cấu trúc hóa học của các hoạt chất<br /> chính trong Đại hoàng: 1. Sennoside A,<br /> 2. Rhaponticin, 3. Emodin-glucoside,<br /> 4. Emodin, 5. Chrysophanol.<br /> <br /> 32<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Hóa chất và thiết bị.<br /> Hóa chất: các chất chuẩn chrysophanol,<br /> emodin, emodin-glucoside, rhaponticin<br /> và sennoside A đƣợc chiết xuất, phân<br /> tách, tinh chế và xác định cấu trúc, chuẩn<br /> nội (eugenol), acetonitrile, methanol, nƣớc<br /> cất, axit phosphoric đạt tiêu chuẩn cho sắc<br /> ký lỏng hiệu năng cao, các hóa chất khác<br /> đạt tiêu chuẩn phân tích.<br /> Mẫu Đại hoàng đƣợc thu hái từ nhiều<br /> vùng khác nhau của Trung Quốc và Hàn<br /> Quốc, đƣợc GS. Jae Hyun Lee, Khoa<br /> Y học Cổ Truyền, Đại học Dong Guk<br /> thẩm định và lƣu trữ tại Khoa Dƣợc,<br /> Đại học Quốc gia Chung Nam, Hàn Quốc.<br /> Thiết bị: máy sắc ký lỏng hiệu năng<br /> cao Shimadzu gồm bơm LC-20AD, detector<br /> SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự<br /> động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO20A (Shimadzu, Japan). Thực hiện phân<br /> tách trên cột C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm,<br /> Optimapak, RStech Corp, Hàn Quốc).<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Điều kiện sắc ký:<br /> Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak<br /> C18 (250 x 4,6; 5μm) của Công ty RS<br /> tech (Hàn Quốc); bƣớc sóng phát hiện:<br /> 280 nm; pha động: dung môi A (dung<br /> dịch axit phosphoric 0,05 M trong nƣớc);<br /> dung môi B (acetonitrile); tốc độ dòng:<br /> 1 ml/phút; thể tích tiêm: 10 μl.<br /> <br /> Chƣơng trình rửa giải nhƣ sau:<br /> THỜI GIAN<br /> (phút)<br /> <br /> %A<br /> <br /> %B<br /> <br /> 80<br /> <br /> 20<br /> <br /> 0<br /> <br /> 5<br /> <br /> 5<br /> <br /> 18<br /> <br /> 80<br /> <br /> 72<br /> <br /> 20<br /> <br /> 28<br /> <br /> 18<br /> <br /> 25<br /> <br /> 72<br /> <br /> 58<br /> <br /> 28<br /> <br /> 42<br /> <br /> 25<br /> <br /> 30<br /> <br /> 58<br /> <br /> 0<br /> <br /> 42<br /> <br /> 100<br /> <br /> 30<br /> <br /> 35<br /> <br /> 0<br /> <br /> 80<br /> <br /> 100<br /> <br /> 20<br /> <br /> 35<br /> <br /> 40<br /> <br /> 80<br /> <br /> 20<br /> <br /> * Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử:<br /> - Nội chuẩn (IS): dung dịch eugenol<br /> nồng độ 1.000 µg/ml trong methanol.<br /> - Mẫu chuẩn: dãy các dung dịch chuẩn<br /> có nồng độ chính xác chrysophanol (từ<br /> 2 - 200 µg/ml), emodin (1 - 100 µg/ml),<br /> emodin-glucoside (0,5 - 50 µg/ml),<br /> rhaponticin (2 - 200 µg/ml) và sennoside A<br /> (0,5 - 50 µg/ml) trong dung dịch chuẩn<br /> nội eugenol 200 (µg/ml) trong methanol.<br /> - Mẫu thử: cân chính xác 100 mg bột<br /> dƣợc liệu Đại hoàng, cho vào bình định<br /> mức 10 ml. Thêm 9 ml ethanol 70% và<br /> 200μl dung dịch chuẩn nội, bổ sung<br /> ethanol 70% vừa đủ, cân, lắc siêu âm<br /> 60 phút, cân lại, bổ sung khối lƣợng mất<br /> bằng ethanol 70%. Ly tâm, gạn lấy lớp<br /> trên và lọc qua màng lọc 0,45 μm.<br /> 34<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ và so sánh phổ của mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b, c); (1): sennoside A;<br /> (2): rhaponticin; (3): emodin-glucoside (4): emodin; (5): chrysophanol.<br /> Với điều kiện sắc ký và phƣơng pháp<br /> xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu<br /> đƣợc cho các pic tách rõ ràng, nhiễu nền<br /> thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử<br /> Đại hoàng và hỗn hợp chuẩn. Trên sắc<br /> ký đồ, mẫu thử có thời gian lƣu trùng<br /> với thời gian lƣu của pic sennoside A,<br /> rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,<br /> chrysophanol của mẫu chuẩn lần lƣợt là<br /> 12,25; 13,35; 17,56; 34,42; 36,06 phút.<br /> Tại thời gian lƣu của sennoside A,<br /> rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,<br /> chrysophanol trên các sắc đồ mẫu thử và<br /> mẫu chuẩn, chúng tôi đã so sánh phổ<br /> hấp thụ UV thu đƣợc của pic. Kết quả<br /> cho thấy phổ mẫu thử và mẫu chuẩn<br /> <br /> trùng khít lên nhau với hệ số phù hợp lần<br /> lƣợt là 0,9997; 0,9996; 0,9998; 0,9992 và<br /> 0,9994. Điều này chứng tỏ: pic thu đƣợc<br /> trên sắc ký đồ của mẫu thử tinh khiết và<br /> các thành phần khác có trong mẫu thử<br /> không ảnh hƣởng đến quá trình phân<br /> tích năm chất đối chiếu sennoside A,<br /> rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,<br /> chrysophanol, qua đó cho phép tiến hành<br /> định tính và định lƣợng.<br /> 1. Khoảng tuyến tính, giới hạn phát<br /> hiện và giới hạn định lƣợng.<br /> Pha một gồm 6 dung dịch mẫu chuẩn<br /> có nồng độ từ 0,5 - 200 μg/ml. Tiến<br /> hành sắc ký nhƣ điều kiện đã mô tả.<br /> <br /> 35<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> Bảng 1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng.<br /> NỒNG ĐỘ<br /> (g/ml)<br /> <br /> PHƢƠNG TRÌNH<br /> HỒI QUY<br /> <br /> r<br /> <br /> LOD<br /> (g/ml)<br /> <br /> LOQ<br /> ((g/ml)<br /> <br /> Sennoside A<br /> <br /> 0,9 - 50<br /> <br /> Y = 0,0023 X - 0,0066<br /> <br /> 1,0000<br /> <br /> 0,28<br /> <br /> 0,94<br /> <br /> Rhaponticin<br /> <br /> 2,0 - 200<br /> <br /> Y = 0,0066 X - 0,0039<br /> <br /> 0,9998<br /> <br /> 0,15<br /> <br /> 0,50<br /> <br /> Emodin- glucoside<br /> <br /> 0,5 - 50<br /> <br /> Y = 0,0211 X - 0,0045<br /> <br /> 0,9997<br /> <br /> 0,05<br /> <br /> 0,15<br /> <br /> Emodin<br /> <br /> 1,0 - 100<br /> <br /> Y = 0,0155 X - 0,0069<br /> <br /> 0,9997<br /> <br /> 0,06<br /> <br /> 0,20<br /> <br /> Chrysophanol<br /> <br /> 2,0 - 200<br /> <br /> Y = 0,0061 X - 0,0055<br /> <br /> 0,9996<br /> <br /> 0,16<br /> <br /> 0,50<br /> <br /> CHẤT<br /> CHUẨN<br /> <br /> Kết quả khảo sát cho thấy: với khoảng<br /> nồng độ của sennoside A từ 0,9 - 50 μg/ml,<br /> rhaponticin từ 2,0 - 200 μg/ml, emodinglucoside từ 0,5 - 50 μg/ml, emodin từ<br /> 1,0 - 100 μg/ml, chrysophanol từ 2,0 200 μg/ml, có sự tƣơng quan tuyến tính<br /> giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích pic<br /> chuẩn/chuẩn nội.<br /> Phƣơng trình tuyến tính của các chất<br /> sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside,<br /> emodin, chrysophanol cho phép xác định<br /> giới hạn phát hiện lần lƣợt 0,28, 0,15,<br /> 0,05, 0,06 và 0,16 µg/ml giới hạn định<br /> <br /> lƣợng của từng chất lần lƣợt 0,94, 0,50,<br /> 0,15, 0,20 và 0,50 µg/ml.<br /> 2. Độ đúng, độ lặp lại của phƣơng<br /> pháp.<br /> Độ đúng và độ lặp lại của phƣơng<br /> pháp đƣợc xác định trên các mẫu chuẩn<br /> đã biết trƣớc nồng độ. Tính độ đúng và<br /> độ lặp lại trong ngày bằng cách phân<br /> tích mẫu chuẩn 5 lần/ngày; độ đúng và<br /> độ lặp lại giữa các ngày đƣợc tiến hành<br /> bằng cách phân tích mẫu chuẩn trong<br /> 5 ngày liên tiếp.<br /> <br /> Bảng 2: Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp.<br /> CHẤT<br /> CHUẨN<br /> <br /> NỒNG<br /> ĐỘ<br /> <br /> TRONG NG<br /> <br /> (n<br /> <br /> 5)<br /> <br /> Độ lặp lại (%)<br /> <br /> Độ đúng (%)<br /> <br /> GI A C C NG<br /> <br /> (n<br /> <br /> 5)<br /> <br /> Độ lặp lại (%) Độ đúng (%)<br /> <br /> Sennoside A<br /> <br /> 12,5<br /> <br /> 0,73<br /> <br /> 100,2<br /> <br /> 0,93<br /> <br /> 99,2<br /> <br /> Rhaponticin<br /> <br /> 50,0<br /> <br /> 0,83<br /> <br /> 100,9<br /> <br /> 0,83<br /> <br /> 101,1<br /> <br /> Emodin- glucoside<br /> <br /> 12,5<br /> <br /> 1,13<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> 1,32<br /> <br /> 99,5<br /> <br /> Emodin<br /> <br /> 25,0<br /> <br /> 0,39<br /> <br /> 100,9<br /> <br /> 0,62<br /> <br /> 102,0<br /> <br /> Chrysophanol<br /> <br /> 50,0<br /> <br /> 0,90<br /> <br /> 101,4<br /> <br /> 1,29<br /> <br /> 101,6<br /> <br /> 37<br /> <br />