PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP VỚI VENT ADN POLYMERASE

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

87
lượt xem 14
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bệnh Hemophilia A liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIII. Vent ADN polymerase có khả năng xúc tác tổng hợp ADN mới chính xác hơn so với Taq ADN polymerase. Mục tiêu: Xác định qui trình phát hiện đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIII sử dụng Vent ADN polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP. Phương pháp: Phản ứng chuỗi PCR và cắt enzyme giới hạn RFLP. Kết quả: Phát hiện được 16 trên 29 mẫu bệnh nhân Hemophilia A có đột...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP VỚI VENT ADN POLYMERASE

TCNCYH 38 (5) - 2005 PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR - RFLP VỚI VENT ADN POLYMERASE Nguyễn Hoài Giang 1, Nguyễn Hạnh Phúc 1 Phạm Quang Vinh 2 1 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 2 Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương Bệnh Hemophilia A liên quan đến các đột biến trên gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIII. Vent ADN polymerase có khả năng xúc tác tổng hợp ADN mới chính xác hơn so với Taq ADN polymerase. Mục tiêu: Xác định qui trình phát hiện đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hóa cho yếu tố đông máu số VIII sử dụng Vent ADN polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP. Phương pháp: Phản ứng chuỗi PCR và cắt enzyme giới hạn RFLP. Kết quả: Phát hiện được 16 trên 29 mẫu bệnh nhân Hemophilia A có đột biến ở intron 18. Cũng trong số bệnh nhân này, chúng tôi chưa phát hiện được trường hợp nào mang đột biến ở intron 19. Kết luận: Hình thành được qui trình phát hiện đột biến Hemophilia A bằng PCR - RFLP. Qui trình có thể ứng dụng để phát hiện các phụ nữ mang gen bệnh và chẩn đoán sớm trước sinh bệnh Hemophilia A. Từ khóa: Hemophilia A, PCR, RFLP, Vent ADN polymerase I. ĐẶT VẤN ĐỀ (1/290 đến 1/2.400) [3, 5]. Những đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII là Hemophilia (bệnh ưa chảy máu) bao gồm các đột biến mất vị trí nhận biết của enzyme giới hạn đột biến ở gen mã hoá cho yếu tố đông máu số Bcl I và Hind III [2, 4]. Do vậy, độ chính xác của VIII (Hemophilia A) và ở gen của yếu tố IX các sản phẩm PCR so với khuôn mẫu ADN ban đầu (Hemophilia B). Hemophilia A là bệnh di truyền liên rất quan trọng, nó đảm bảo kết quả chẩn đoán quan đến nhiễm sắc thể X. Ước tính có khoảng từ phát hiện đột biến ở bệnh nhân Hemophilia A. 1/5000 đến 1/10.000 các bé trai sinh ra mắc bệnh Mục tiêu: Xác định qui trình phát hiện đột này. Gen mã hoá cho yếu tố đông máu số VIII biến ở intron 18 và 19 của gen mã hóa cho nằm trên cánh dài của nhiễm sắc thể tại vị trí yếu tố đông máu số VIII sử dụng Vent ADN Xq28. Gen này rất lớn (khoảng 180 kb) bao gồm polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP 26 exon [2]. Các đột biến của gen mã hoá cho yếu tố VIII được phát hiện một cách nhanh chóng và II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP chính xác bằng kỹ thuật PCR kết hợp với phân tích NGHIÊN CỨU RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 1. Đối tượng [2, 4]. Các mẫu máu của bệnh nhân Hemophilia A (29 Cũng giống như Taq ADN polymerase, một mẫu) được cung cấp bởi Viện Huyết học và Truyền enzyme polymerase được dùng phổ biến trong kỹ máu Trung ương. Các mẫu máu của người bình thuật PCR, Vent ADN polymerase cũng có khả thường khoẻ mạnh (25 mẫu) được cung cấp bởi năng xúc tác tổng hợp các sợi ADN mới. Các Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Các enzyme Taq nghiên cứu cho thấy Vent ADN polymerase có ADN polymerase, Vent ADN polymerase, các nhiều ưu điểm vượt trội so với Taq ADN enzyme giới hạn Bcl I và Hind III và thang ADN polymerase [5]. Vent ADN polymerase bị mất 50% chuẩn 100bp sử dụng cho nghiên cứu này là của hoạt tính xúc tác sau 130 phút ở 97,5oC, so với 10 hãng New England Biolabs (Mỹ). phút của Taq ADN polymerase. Tốc độ tổng hợp sợi ADN mới của Vent ADN polymerase (trên 80 2. Phương pháp nghiên cứu nucleotide/giây) cũng nhanh hơn so với Taq ADN - Tách chiết ADN từ các mẫu máu của bệnh polymerase (75 nucleotide/giây). Vent ADN nhân Hemophilia A và người bình thường khoẻ polymerase lại ít gây lỗi khi xúc tác tổng hợp sợi mạnh được cải tiến theo phương pháp của ADN mới (1/31.000) so với Taq ADN polymerase Sambrook và cộng sự [6]. 1
TCNCYH 38 (5) - 2005 - Cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 (18F và 18R) pháp đã cải tiến của Sambrook và cộng sự [6]. Kết và intron 19 (19F và 19R) của gen mã hoá yếu tố quả đo OD ở bước sóng 260nm cho thấy tất cả các VIII được tiến hành phản ứng PCR với Taq ADN mẫu ADN tách chiết được đều đủ điều kiện để tiến polymerase theo nghiên cứu của Kogan và cộng sự hành phản ứng PCR. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành [4]. phản ứng PCR với Taq ADN polymerase và cặp mồi Trình tự của các cặp mồi là 18F và 18R theo các thông số đã được tối ưu bởi Kogan và cộng sự. Tiếp theo để sử dụng Vent ADN 18F: 5’-TAA AAG CTT TAA ATG GTC TAG GC-3’ polymerase trong kỹ thuật PCR - RFLP phát hiện 18R: 5’-TTC GAA TTC TGA AAT TAT CTT GTT C-3’ các đột biến của bệnh Hemophilia A, chúng tôi tiến 19F: 5’-AAG GTC CTC GAG GGC GAG CAT-3’ hành tối ưu hoá điều kiện cho PCR với enzyme 19R: 5’-AAG GTC GGA TCC GTC CAG AAG-3’ này. Sử dụng số liệu của hãng New England Biolabs và kinh nghiệm dùng Vent ADN polymerase - Phản ứng PCR với Vent ADN polymerase và trong nghiên cứu trước của chúng tôi [1, 3], điều các cặp mồi 18F - 18R; 19F - 19R được tối ưu theo kiện PCR với enzyme này sau khi tối ưu hoá là 30 nghiên cứu của Nguyễn Hoài Giang và cộng sự [1]. chu kỳ với 94oC – 30 giây, 50oC - 20 giây, 72oC - - Sản phẩm PCR với cặp mồi 18F và 18R được 20 giây; 2 mM Mg2+; 200 µM dNTPs. Trên gel ủ cùng enzyme giới hạn Bcl I ở 50oC trong 12 giờ. polyacrylamide, sản phẩm PCR sử dụng Vent ADN Sản phẩm PCR với cặp mồi 19F và 19R được ủ polymerase với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 có cùng enzyme giới hạn Hind III ở 37oC trong 12 giờ kích thước 142bp ở cả người bình thường khoẻ [4]. mạnh và bệnh nhân Hemophilia, cũng như khi sử - Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide dụng Taq ADN polymerase (giếng 1 đến 3, hình 1). 6% và nhuộm bạc theo phương pháp của Trong số 25 mẫu người bình thường khoẻ mạnh Sambrook và cộng sự [6]. khi sử dụng kỹ thuật PCR - RFLP với cặp mồi đặc III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU hiệu cho intron 18: 25/25 mẫu (100%) đều bị cắt với enzyme Bcl I ở 50oC sau 12 giờ. Với 29 mẫu 1. PCR - RFLP với intron 18 của gen yếu bệnh nhân Hemophilia A có 13 mẫu không bị cắt tố đông máu số VIII và 16 mẫu bị cắt bởi enzyme Bcl I ở 50oC sau 12 Tất cả các mẫu máu (29 mẫu của bệnh nhân giờ. Kết quả này cho thấy có 16/29 (55%) số bệnh Hemophilia A và 25 mẫu của người bình thường nhân Hemophilia A được nghiên cứu có mang đột khoẻ mạnh) được tách chiết ADN theo phương biến ở intron 18 gen mã hoá cho yếu tố VIII. 2
TCNCYH 38 (5) - 2005 Hình 1. PCR - RFLP với intron 18 của gen yếu tố VIII ở người bình thường và bệnh nhân Hemophilia A Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với 55oC - 1 phút, 70oC - 3 phút; chúng tôi cũng đã enzyme Taq ADN polymerase (ADN khuôn được thành công trong việc khuyếch đại intron này tách chiết từ máu của người bình thường khoẻ bằng Taq ADN polymerase và cặp mồi 19F - 19R mạnh). (giếng 1, hình 2). Tương tự như với intron 18, Giếng 2: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với điều kiện PCR với Vent ADN polymerase cho cặp enzyme Vent ADN polymerase (ADN khuôn được mồi 19F và 19R sau khi tối ưu hoá là 30 chu kỳ tách chiết từ máu của người bình thường khoẻ với 94oC - 30 giây, 57oC - 20 giây, 72oC - 40 giây mạnh). và sản phẩm PCR có kích thước 730bp. Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với Loại trừ 16 mẫu đã phát hiện được mang đột enzyme Vent ADN polymerase (ADN khuôn được biến ở intron 18, 13 mẫu bệnh nhân còn lại và 25 tách chiết từ máu của bệnh nhân Hemophilia A). mẫu người bình thường khoẻ mạnh được khuyếch đại bằng cặp mồi 19F và 19R với Vent ADN Giếng 4: Sản phẩm PCR (ở giếng 1) sau khi polymerase theo điều kiện PCR đã được tối ưu cắt bằng enzyme giới hạn Bcl I. hoá như trên (giếng 1 đến 4, hình 2). Tất cả các Giếng 5: Sản phẩm PCR (ở giếng 2) sau khi mẫu bệnh nhân Hemophilia A (13/13) và các mẫu cắt bằng enzyme Bcl I. của người bình thường khoẻ mạnh (25/25) đem Giếng 6: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi nghiên cứu, đều bị cắt bởi enzyme Hind III ở cắt bằng enzyme Bcl I. 37oC sau 12 giờ (giếng 5 và 6, hình 2). Nghĩa là, Mr: Thang ADN chuẩn 100bp của hãng New không có bệnh nhân nào trong số 13 bệnh nhân England Biolabs. Hemophilia A được nghiên cứu có đột biến ở intron 19 gen mã hoá cho yếu tố VIII. 2. PCR - RFLP với Intron 19 của gen yếu tố đông máu số VIII Sử dụng điều kiện PCR của intron 19 của Kogan và cộng sự là 30 chu kỳ với 94oC - 1 phút, 3
TCNCYH 38 (5) - 2005 Hình 2. PCR - RFLP với intron 19 của người bình thường và bệnh nhân Hemophilia A Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với polyacrylamide (6%) cho thấy sản phẩm PCR với enzyme Taq ADN polymerase. (ADN khuôn được cặp mồi 18F và 18R có kích thước 142bp, giống tách chiết từ máu của người bình thường khoẻ như kết quả của Kogan và cộng sự đã công bố [4]. mạnh). Kết quả của các nghiên cứu trước đây về đột biến Giếng 2: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với gen của bệnh Haemophilia cũng đã chỉ rõ [2, 4], enzyme Taq ADN polymerase (ADN khuôn được đột biến ở intron 18 sẽ làm mất vị trí nhận biết của tách chiết từ máu của bệnh nhân Hemophilia A). enzyme giới hạn Bcl I. Nghĩa là những bệnh nhân Hemophilia A có đột biến ở intron 18 sẽ không Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với thay đổi kích thước của sản phẩm PCR sau khi ủ enzyme Vent ADN polymerase (ADN khuôn được với enzyme Bcl I (giếng 6, hình 1). Ngược lại tách chiết từ máu của người bình thường khoẻ những người bình thường khoẻ mạnh hoặc những mạnh). bệnh nhân Hemophilia A không có đột biến ở Giếng 4: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với intron 18 sẽ bị enzyme giới hạn Bcl I cắt tạo ra 2 enzyme Vent ADN polymerase (ADN khuôn được băng kích thước 99 và 43 bp (giếng 4, 5, hình 1). tách chiết từ máu của bệnh nhân Haemophilia A). Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả Giếng 5: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi cắt nghiên cứu của chúng tôi trên 29 mẫu của bệnh bằng enzyme giới hạn Hind III. nhân Hemophilia A và 25 mẫu của người bình Giếng 6: Sản phẩm PCR (ở giếng 4) sau khi cắt thường khoẻ mạnh. Kết quả tối ưu hoá điều kiện bằng enzyme Hind III. phản ứng PCR với intron 18 cho thấy, Vent ADN polymerase cho phép nâng cao nhiệt độ gắn mồi Mr: Thang ADN chuẩn 100bp của hãng New (50oC) hơn so với sử dụng Taq ADN polymerase England Biolabs. (45oC). Yếu tố này có lẽ cũng góp phần tạo ra sản IV. BÀN LUẬN phẩm PCR đặc hiệu ít lỗi hơn của Taq ADN 1. PCR - RFLP với intron 18 của gen yếu polymerase [3, 5]. tố đông máu số VIII 2. PCR - RFLP với intron 19 của gen yếu Việc khuyếch đại intron 18 bằng kỹ thuật PCR tố đông máu số VIII với Taq ADN polymerase bằng cặp mồi 18F và 18R Tương tự như trường hợp khuyếch đại intron được tiến hành theo điều kiện PCR của Kogan và 18 bằng Vent ADN polymerase, intron 19 cũng cộng sự (30 chu kỳ: 94oC - 1 phút, 45oC - 1 phút, được khuyếch đại thành công bằng enzym này. 72oC - 1 phút). Kết quả điện di trên gel Các nghiên cứu về đột biến gen của bệnh 4
TCNCYH 38 (5) - 2005 Haemophilia cho thấy đột biến ở intron 19 sẽ làm mã hoá cho yếu tố VIII và không có mẫu nào mất vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Hind III mang đột biến ở intron 19. [2, 4]. Nghĩa là những bệnh nhân Hemophilia A có TÀI LIỆU THAM KHẢO đột biến ở intron 19 sẽ không thay đổi kích thước của sản phẩm PCR sau khi ủ với enzyme Hind III. 1. Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Hạnh Ngược lại những người bình thường khoẻ mạnh Phúc, Lê Thị Kim Tuyến. (2001). Tối ưu hoá hoặc những bệnh nhân Hemophilia A không có đột điều kiện PCR để khuyếch đại các alen D1S80 biến ở intron 19 sẽ có một hoặc hai vị trí nhận biết (pMCT118) bằng Vent DNA polymerase. Tạp chí đặc hiệu với enzyme giới hạn Hind III cắt tạo ra 2 Nghiên cứu Y học. 3: 20 - 23. băng kích thước 480 và 250bp hoặc 3 băng kích 2. Bowen DJ. (2002). Haemophilia A and thước 480, 160 và 90bp [2, 4]. Điều này cũng phù haemophilia B: molecular insights. Mol. Pathol. 55: hợp với quan sát của chúng tôi trên 13 mẫu bệnh 1 - 8. Catalog and Technique Reference 2005 - nhân và 25 mẫu người bình thường khoẻ mạnh. 2006. New England Biolab. Kết quả chưa phát hiện được bệnh nhân mang 3. Kogan SC, Doherty M and Gitschier J đột biến ở intron 19 có thể được giải thích là do (1987). An improved method of prenatal diagnosis đột biến ở intron 19 không phổ biến của bệnh of genetics disease by analysis of amplified DNA nhân Hemophilia A ở Việt Nam hoặc số mẫu sequences - application to haemophilia A. N. Engl. nghiên cứu cần được tăng lên nhiều hơn nữa. J. Med. 317: 985 - 990. V. KẾT LUẬN 4. Sambrook J, Frisch EF, and Maniatis T. (1989). Molecular Cloning. Cold Spring Harbor 1. Hình thành được qui trình phát hiện các đột Laboratory Press, USA. biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII, bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật PCR - RFLP 5. Rolfs AI. Schuller U. Finckh I. Weber - với Vent ADN polymerase. Rolfs (1992). PCR: Clinical Diagnostics and Research. Springer - Verlag Berlin, Heidelberg. 2. 16/29 (55%) số bệnh nhân Hemophilia A được nghiên cứu có mang đột biến ở intron 18 gen Summary DETERMINATION THE MUTATIONS OF HAEMOPHILIA A BY PCR - RFLP WITH VENT DNA POLYMERASE Haemophilia A is an X - linked recessive genetic disorder caused by the mutations in the factor VIII gene. The incidence of haemophilia A is from 1/5000 to 1/10.000 males births. Vent DNA polymerase is a high - fidelity thermophilic DNA polymerase. Compared to Taq DNA polymerase, which has a fidelity of 1/290 - 1/2,400, that of Vent DNA polymerase appears to be 5 - 15 times higher (1/31,000). Objectives: Determination the mutations of Haemophilia A by PCR - RFLP with Vent DNA polymerase. Methods: PCR and RFLP. Results: 16/29 (55%) of the Haemophilia A patients has the mutation in intron 18 of factor VIII gene and none of them has the mutation in intron 19. Conclusion: PCR - RFLP are the sensitive tools for detection of mutations and these methods can be used for carrier analysis and prenatal diagnosis of haemophilia A. Keywords: Haemophilia A, PCR, RFLP, Vent DNA polymerase. 5