Nghiên cứu Y học <br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013<br />
<br />
PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC <br />
TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT COLD‐PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ DNA <br />
Hoàng Anh Vũ*, Hứa Thị Ngọc Hà** <br />
<br />
TÓM TẮT <br />
Giới thiệu: Tăng biểu hiện của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô thường gặp trong ung thư đại trực <br />
tràng (UTĐTT) và là đích điều trị của kháng thể đơn dòng. Tuy nhiên, sự kháng thuốc xảy ra khi có đột biến gen <br />
KRAS trong tế bào ung thư. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mô tả đột biến trên codon 12 và 13 của gen <br />
KRAS, giúp quyết định chỉ định kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân. <br />
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Từ tháng 01/2011 đến tháng 05/2013, 173 bệnh nhân UTĐTT <br />
được khảo sát đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử – Đại học Y Dược <br />
TPHCM. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật COLD‐PCR (co‐amplification at lower denaturation temperature <br />
polymerase chain reaction) để khuếch đại exon 2 của gen KRAS từ bệnh phẩm là mô vùi nến. Sau đó, đột biến <br />
của gen KRAS được xác định bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA. <br />
Kết quả: 62 trường hợp có đột biến của gen KRAS (35,8%), trong đó 4 trường hợp mang đột biến ở cả hai <br />
codon 12 và 13. Có tất cả 7 dạng đột biến được phát hiện, bao gồm 5 dạng đột biến ở codon 12 (Gly12Asp, <br />
Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Ala và Gly12Cys) và 2 dạng đột biến ở codon 13 (Gly13Asp và Gly13Ser). <br />
Kết luận: Đột biến codon 12 và 13 của gen KRAS thường gặp trên bệnh nhân Việt Nam bị UTĐTT. Kết <br />
hợp kỹ thuật COLD‐PCR và giải trình tự chuỗi DNA phù hợp cho khảo sát các đột biến này từ bệnh phẩm giải <br />
phẫu bệnh. <br />
Từ khóa: ung thư đại trực tràng, đột biến gen KRAS, giải trình tự chuỗi DNA, COLD‐PCR <br />
<br />
ABSTRACT <br />
DETECTION OF KRAS MUTATIONS IN COLORACTAL CANCER USING COLD‐PCR <br />
AND DNA SEQUENCING <br />
Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha <br />
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 51 ‐ 55 <br />
Background: Commonly over‐expressed in colorectal cancer, EGFR is an ideal target for monoclonal <br />
antibody therapy. However, drug‐resistance was observed in patients whose tumor cells harbored KRAS <br />
mutations. We conduct this study to describe KRAS mutations at codons 12 and 13 for selecting patients suitable <br />
for monoclonal antibody indication. <br />
Materials and methods: From January 2011 to May 2013, 173 patients with colorectal cancer were <br />
analyzed for KRAS mutations at Center for Molecular Biomedicine – University of Medicine and Pharmacy, Ho <br />
Chi Minh City. COLD‐PCR (co‐amplification at lower denaturation temperature polymerase chain reaction) was <br />
used to amplify KRAS exon 2 from paraffin‐embedded tissue samples. Mutations were identified by direct DNA <br />
sequencing. <br />
Results: KRAS mutations were detected in 62 patients (35.8%) including 4 patients who carried double <br />
mutations at both codons 12 and 13. In total, 7 types of mutations were found, of which 5 were at codon 12 <br />
* Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TPHCM <br />
<br />
** Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM <br />
Tác giả liên lạc: TS. Hoàng Anh Vũ ĐT: 0122 299 3537 Email: hoangvuxinh@yahoo.com <br />
<br />
50<br />
<br />
Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh <br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 <br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
(Gly12Asp, Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Ala and Gly12Cys) and 2 at codon 13 (Gly13Asp and Gly13Ser). <br />
Conclusion: High frequency of KRAS mutations were found in Vietnamese patients with colorectal cancer. <br />
COLD‐PCR in combination with direct DNA sequencing is suitable for detecting KRAS mutations from <br />
pathological samples. <br />
Keywords: colorectal cancer, KRAS gene mutation, DNA sequencing, COLD‐PCR <br />
chất truyền tin hạ nguồn của EGFR, KRAS có <br />
ĐẶT VẤN ĐỀ <br />
vai trò quan trọng trong việc khởi phát và tiến <br />
Rối loạn các thụ thể tyrosine kinase, trong đó <br />
triển của một số ung thư như carcinôm tuyến <br />
có thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR: <br />
của đại tràng, phổi và tụy. Khi đột biến xảy ra sẽ <br />
epidermal growth factor receptor), thường gặp <br />
làm mất hoạt tính ATPase và giữ phân tử <br />
trong ung thư ở người, trở thành những đích <br />
protein KRAS ở trạng thái gắn ATP liên tục, dẫn <br />
nhắm phân tử hiệu quả trong điều trị. Hoạt tính <br />
đến hậu quả là các phân tử truyền tin hạ nguồn <br />
tyrosine kinase của EGFR đóng vai trò quan <br />
luôn hoạt động để duy trì tín hiệu tăng sinh tế <br />
trọng trong sự điều khiển sự tăng sinh và sống <br />
bào(13). <br />
còn của tế bào, thông qua quá trình tự <br />
Tại Việt Nam, kháng thể đơn dòng đã được <br />
phosphoryl hóa thụ thể EGFR hoặc thông qua 2 <br />
chỉ định cho UTĐTT giai đoạn tiến xa. Nghiên <br />
con đường truyền tín hiệu trung gian hạ nguồn <br />
cứu này được tiến hành nhằm xác định tần suất <br />
là con đường PIK3CA/AKT/mTOR và <br />
đột biến tại codon 12 và 13 của gen KRAS ở bệnh <br />
RAS/RAF/MAPK(4). Sự hoạt hóa của protein <br />
nhân UTĐTT bằng kỹ thuật COLD‐PCR (co‐<br />
EGFR khởi động cho các dòng thác tín hiệu nội <br />
amplification <br />
at <br />
lower <br />
denaturation <br />
bào, có liên quan đến một số con đường truyền <br />
temperature) kết hợp với giải trình tự DNA, <br />
tin để gây ra những đáp ứng tế bào vô cùng <br />
giúp quyết định lựa chọn kháng thể đơn dòng <br />
quan trọng bao gồm tăng sinh tế bào, biệt hóa tế <br />
cho bệnh nhân một cách phù hợp. Kỹ thuật <br />
bào, sự di động và sinh tồn của tế bào. Trong <br />
COLD‐PCR cho phép khuếch đại ưu thế dòng <br />
ung thư đại trực tràng (UTĐTT), protein EGFR <br />
alen mang đột biến, giúp cải thiện độ nhạy của <br />
thường biểu hiện quá mức trên bề mặt tế bào, <br />
kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA(10). Trong kỹ <br />
được coi là nguồn gốc khởi phát các tín hiệu <br />
thuật này, sau khoảng 10 chu kỳ luân nhiệt đầu <br />
tăng sinh tế bào quá độ trong khối u. Ức chế <br />
tiên với kỹ thuật PCR chuẩn, người ta sử dụng <br />
hoạt tính tyrosine kinase của EGFR là một chiến <br />
nhiệt độ biến tính thấp trong khoảng 80 – 900C <br />
lược điều trị thích hợp, đã được nghiên cứu <br />
chỉ đủ cho các mạch đôi dị hợp tử có mang đột <br />
nhiều trong UTĐTT. Tuy nhiên kháng thể đơn <br />
biến trong sản phẩm PCR duỗi ra để được ưu <br />
dòng ức chế đặc hiệu sự hoạt hóa EGFR như <br />
tiên khuếch đại. Với những điều kiện tối ưu hóa, <br />
cetuximab hay panitumumab được chứng minh <br />
COLD‐PCR có thể giúp cho giải trình tự DNA <br />
chỉ có hiệu quả trong điều trị UTĐTT giai đoạn <br />
đạt độ nhạy T<br />
c.38G>A<br />
c.34G>T<br />
c.35G>C<br />
c.34G>A<br />
c.37G>A<br />
<br />
Gly12Val<br />
Gly13Asp<br />
Gly12Cys<br />
Gly12Val<br />
Gly12Ser<br />
Gly13Ser<br />
<br />
Tỷ lệ<br />
(n =<br />
173)<br />
10,9<br />
<br />
18<br />
<br />
10,4<br />
<br />
15<br />
<br />
8,6<br />
<br />
4<br />
<br />
2,3<br />
<br />
4<br />
<br />
2,3<br />
<br />
3<br />
<br />
1,7<br />
<br />
3<br />
<br />
1,7<br />
<br />
Cần chú ý rằng tình trạng không đột biến ở <br />
codon 12 và 13 của gen KRAS chưa đủ đảm bảo <br />
cho bệnh nhân có đáp ứng với cetuximab hoặc <br />
panitumumab. Các yếu tố kháng thuốc khác bao <br />
gồm đột biến codon 61 và 146 của gen KRAS, <br />
đột biến codon 12, 13 và 61 của gen NRAS, đột <br />
<br />
53<br />
<br />
Nghiên cứu Y học <br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013<br />
<br />
biến codon 600 của gen BRAF, đột biến exon 9 <br />
và 20 của gen PIK3CA(3,14,15) nên được khảo sát <br />
trong các nghiên cứu tiếp theo. <br />
<br />
6.<br />
<br />
7.<br />
<br />
8.<br />
<br />
9.<br />
<br />
10.<br />
<br />
11.<br />
<br />
<br />
<br />
KẾT LUẬN <br />
Đột biến gen KRAS thường gặp trong <br />
UTĐTT ở bệnh nhân Việt Nam. Phát hiện đột <br />
biến gen KRAS bằng kỹ thuật COLD‐PCR kết <br />
hợp giải trình tự chuỗi DNA nên được thực hiện <br />
cho bệnh nhân muốn được được trị bằng kháng <br />
thể đơn dòng cetuximab. <br />
<br />
12.<br />
<br />
13.<br />
<br />
14.<br />
<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO <br />
1.<br />
<br />
2.<br />
<br />
3.<br />
<br />
4.<br />
5.<br />
<br />
Allegra CJ, Jessup JM, Somerfield MR, Hamilton SR, <br />
Hammond EH, Hayes DF, et al (2009). American Society of <br />
Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for <br />
KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal <br />
carcinoma to predict response to anti‐epidermal growth factor <br />
receptor monoclonal antibody therapy. J Clin Oncol; <br />
27(12):2091‐6. <br />
Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van Cutsem E, Siena S, <br />
Freeman DJ, et al (2008). Wild‐type KRAS is required for <br />
panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal <br />
cancer. J Clin Oncol.;26(10):1626‐34. <br />
Benvenuti S, Sartore‐Bianchi A, Di Nicolantonio F, Zanon C, <br />
Moroni M, Veronese S, et al (2007). Oncogenic activation of the <br />
RAS/RAF signaling pathway impairs the response of <br />
metastatic colorectal cancers to anti‐epidermal growth factor <br />
receptor antibody therapies. Cancer Res;67(6):2643‐8. <br />
Ciardiello F, Tortora G (2008). EGFR antagonists in cancer <br />
treatment. N Engl J Med;358(11):1160‐74. <br />
Di Fiore F, Blanchard F, Charbonnier F, Le Pessot F, Lamy A, <br />
Galais MP, et al (2007). Clinical relevance of KRAS mutation <br />
<br />
15.<br />
<br />
16.<br />
<br />
17.<br />
<br />
18.<br />
<br />
detection in metastatic colorectal cancer treated by Cetuximab <br />
plus chemotherapy. Br J Cancer;96(8):1166‐9. <br />
Domagala P, Hybiak J, Sulzyc‐Bielicka V, Cybulski C, Rys J, <br />
Domagala W (2012). KRAS mutation testing in colorectal <br />
cancer as an example of the pathologistʹs role in personalized <br />
targeted therapy: a practical approach. Pol J Pathol;63(3):145‐<br />
64. <br />
Edkins S, OʹMeara S, Parker A, Stevens C, Reis M, Jones S, et <br />
al. (2006) Recurrent KRAS codon 146 mutations in human <br />
colorectal cancer. Cancer Biol Ther;5(8):928‐32. <br />
Karapetis CS, Khambata‐Ford S, Jonker DJ, OʹCallaghan CJ, Tu <br />
D, Tebbutt NC, et al (2008). K‐ras mutations and benefit from <br />
cetuximab in advanced colorectal cancer. N Engl J <br />
Med;359(17):1757‐65. <br />
Kristensen LS, Kjeldsen TE, Hager H, Hansen LL (2012). <br />
Competitive amplification of differentially melting amplicons <br />
(CADMA) improves KRAS hotspot mutation testing in <br />
colorectal cancer. BMC Cancer.12:548. <br />
Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Berbeco R, Makrigiorgos <br />
GM (2008). Replacing PCR with COLD‐PCR enriches variant <br />
DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. <br />
Nat Med;14(5):579‐84. <br />
Lievre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, et al <br />
(2008). KRAS mutations as an independent prognostic factor in <br />
patients with advanced colorectal cancer treated with <br />
cetuximab. J Clin Oncol;26(3):374‐9. <br />
Oliveira C, Westra JL, Arango D, Ollikainen M, Domingo E, <br />
Ferreira A, et al (2004). Distinct patterns of KRAS mutations in <br />
colorectal carcinomas according to germline mismatch repair <br />
defects and hMLH1 methylation status. Hum Mol <br />
Genet;13(19):2303‐11. <br />
Roberts PJ, Der CJ (2007). Targeting the Raf‐MEK‐ERK <br />
mitogen‐activated protein kinase cascade for the treatment of <br />
cancer. Oncogene;26(22):3291‐310. <br />
Sartore‐Bianchi A, Martini M, Molinari F, Veronese S, <br />
Nichelatti M, Artale S, et al (2009). PIK3CA mutations in <br />
colorectal cancer are associated with clinical resistance to <br />
EGFR‐targeted monoclonal antibodies. Cancer Res;69(5):1851‐<br />
7. <br />
Sullivan KM, Kozuch PS (2011). Impact of KRAS Mutations on <br />
Management of Colorectal Carcinoma. Patholog Res <br />
Int:219309. <br />
Van Cutsem E, Nordlinger B, Cervantes A (2010). Advanced <br />
colorectal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for <br />
treatment. Ann Oncol;21 Suppl 5:v93‐7. <br />
Van Cutsem EJ, Oliveira J, Kataja VV (2005). ESMO Minimum <br />
Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and <br />
follow‐up of advanced colorectal cancer. Ann Oncol;16 Suppl <br />
1:i18‐9. <br />
Zuo Z, Chen SS, Chandra PK, Galbincea JM, Soape M, Doan S, <br />
et al (2009). Application of COLD‐PCR for improved detection <br />
of KRAS mutations in clinical samples. Mod Pathol.;22(8):1023‐<br />
31. <br />
<br />
<br />
<br />
Ngày nhận bài báo <br />
<br />
<br />
Ngày phản biện nhận xét bài báo: <br />
Ngày bài báo được đăng: <br />
<br />
<br />
08‐06‐2013 <br />
20‐06‐2013 <br />
15–07‐2013 <br />
<br />
<br />
<br />
<br />
54<br />
<br />
Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh <br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
