Phát hiện đột biến gen UNC13D gây hội chứng thực bào máu ở trẻ em bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013<br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN UNC13D  <br /> GÂY HỘI CHỨNG THỰC BÀO MÁU Ở TRẺ EM  <br /> BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA <br /> Hoàng Anh Vũ*, Nguyễn Văn Tân Minh**, Phan Thị Xinh*** <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Giới  thiệu: Hội chứng thực bào máu (HCTBM) nguyên phát ở trẻ em thường do đột biến gen gây nên. <br /> Trong một nghiên cứu trước đây trên 21 bệnh nhân trẻ em, chúng tôi chỉ phát hiện 1 trường hợp có đột biến gen <br /> perforin. <br /> Mục  tiêu: Nghiên cứu này nhằm khảo sát đột biến gen UNC13D trên 10 bệnh nhân  không  có  đột  biến <br /> perforin. <br /> Đối tượng và phương pháp: Toàn bộ 32 exon và vùng tiếp giáp exon – intron của gen UNC13D đã được <br /> khuếch đại và giải trình tự chuỗi DNA. <br /> Kết quả: Chúng tôi phát hiện 2 trường hợp có đột biến điểm c.3151G>A ở exon 31 trên genomic DNA. Đột <br /> biến tạo nên RNA không toàn vẹn do exon 30 nối trực tiếp với exon 32. Ngoài ra còn có 25 dạng đa hình thái <br /> đơn nucleotide được phát hiện. <br /> Kết luận: Nghiên cứu trên số mẫu lớn hơn để hiểu rõ phổ đột biến gen UNC13D trên bệnh nhân Việt Nam <br /> nên tiếp tục được tiến hành. <br /> Từ khóa: hội chứng thực bào máu, đột biến gen UNC13D, giải trình tự chuỗi DNA <br /> <br /> ABSTRACT <br /> DETECTION OF UNC13D MUTATIONS IN PEDIATRIC PATIENTS <br />  WITH HEMOPHAGOCYTIC LYMPHOHISTIOCYTOSIS BY DNA SEQUENCING <br /> Hoang Anh Vu, Nguyen Van Tan Minh, Phan Thi Xinh <br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 150 ‐ 155 <br /> Introduction:  Hemophagocytic  lymphohistiocytosis,  also  known  as  hemophagocytic  syndrome,  in  early <br /> childhood are commonly caused by gene mutations. In a previous study, we found only one performing mutation <br /> among 21 pediatric patients. <br /> Objective: In the present study, UNC13D mutations were analyzed in 10 wild type‐performing patients. <br /> Patients  and  methods:  Full  length  of  UNC13D  including  32  exons  and  exon‐intron  boundaries  were <br /> amplified and directly sequenced. <br /> Results:  Two  out  of  ten  patients  had  a  point  mutation  c.3151G>A  in  exon  31.  This  mutation  led  to  an <br /> abnormal  transcript  where  exon  30  joined  up  with  exon  32.  Moreover,  we  detected  25  single  nucleotide <br /> polymorphisms along the gen. <br /> Conclusion:  Further  study  with  more  samples  needs  to  be  done  to  know  the  spectrum  of  UNC13D <br /> mutations in Vietnamese patients. <br /> Key words: hemophagocytic lymphohistiocytosis, UNC13D gene mutation, DNA sequencing <br /> * Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược TPHCM <br /> ** Khoa Xét Nghiệm Huyết học, Bệnh viện Nhi Đồng II TPHCM <br /> *** Bộ môn Huyết học, Đại học Y Dược TP.HCM <br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Hoàng Anh Vũ, ĐT: 0122‐2993537, email: hoangvuxinh@yahoo.com <br /> <br /> 150<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  <br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> Hội  chứng  thực  bào  máu  (HCTBM; <br /> hemophagocytic <br /> lymphohistiocytosis <br /> hay <br /> hemophagocytic  syndrome)  ở  trẻ  em  là  một <br /> dạng rối loạn di truyền được đặc trưng bởi hội <br /> chứng viêm thái quá, với sốt, gan – lách to, giảm <br /> tế bào máu ngoại biên và có thể biểu hiện triệu <br /> chứng  thần  kinh  trung  ương  đi  kèm(4).  Dù  có <br /> nhiều nguyên nhân khác nhau, những biểu hiện <br /> lâm sàng ồ ạt của hiện tượng viêm đa hệ thống <br /> và  diễn  tiến  tử  vong  nhanh  chóng  đối  với <br /> HCTBM không được điều trị đã thu hút sự quan <br /> tâm  của  những  chuyên  gia  về  huyết  học,  miễn <br /> dịch, bệnh truyền nhiễm và di truyền học. Đến <br /> nay,  HCTBM  vẫn  còn  được  xem  là  một  thử <br /> thách đối với những nhà khoa học trong việc tìm <br /> hiểu sự hình thành cũng như các bất thường của <br /> quá  trình  điều  hòa  phản  ứng  viêm  miễn  dịch <br /> trong  cơ  thể  con  người.  Bệnh  diễn  tiến  đến  tử <br /> vong trong vòng vài tuần nếu không được điều <br /> trị bằng thuốc ức chế miễn dịch và thuốc độc tế <br /> bào thích hợp để tạm thời kiểm soát bệnh. Hiện <br /> nay,  ghép  tế  bào  gốc  tạo  máu  được  coi  là <br /> phương  cách  duy  nhất  có  khả  năng  chữa  khỏi <br /> bệnh(6). <br /> Chẩn  đoán  sớm  HCTBM  rất  quan  trọng  vì <br /> điều trị ưu tiên hàng đầu là ghép tế bào gốc mà <br /> dự  hậu  của  bệnh  nhân  tùy  thuộc  vào  thời  gian <br /> từ  khi  mắc  bệnh  đến  được  ghép(8).  Theo  tiêu <br /> chuẩn chẩn đoán HCTBM mới(5), một chẩn đoán <br /> di truyền phân tử phù hợp là đủ cho một chẩn <br /> đoán xác định bệnh. HCTBM được phân thành <br /> ít  nhất  5  nhóm  theo  bất  thường  của  các  gen <br /> HPLH1,  perforin,  UNC13D,  STX11  và  STXBP2. <br /> Mặc  dù  đột  biến  gen  perforin  chiếm  tỷ  lệ  cao <br /> <br /> trong nhóm bệnh nhân thuộc các chủng tộc khác <br /> nhau  như  Nhật  Bản,  Thổ  Nhĩ  Kỳ,  Italia,  Bắc <br /> Mỹ(3),  nghiên  cứu  trước  đây  của  chúng  tôi  cho <br /> thấy đột biến gen này đóng vai trò rất nhỏ trong <br /> HCTBM  ở  người  Việt  Nam,  với  chỉ  1  trong  21 <br /> bệnh  nhân  có  mang  đột  biến(7).  Nhằm  tiếp  tục <br /> tìm hiểu cơ chế phân tử của HCTBM trên bệnh <br /> nhân Việt nam, chúng tôi tiến hành khảo sát đột <br /> biến gen UNC13D trên những bệnh nhân không <br /> có đột biến gen perforin. <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> Đối tượng nghiên cứu <br /> 10 bệnh nhi được chẩn đoán hội chứng thực <br /> bào máu theo tiêu chuẩn HLH‐2004 của Henter <br /> và  cộng  sự(5).  Các  bệnh  nhân  này  đã  được  xác <br /> định không có đột biến gen perforin trong nghiên <br /> cứu trước đây(7). Phân tích đột biến gen UNC13D <br /> được  phối  hợp  thực  hiện  tại  Trung  tâm  Y  sinh <br /> học phân tử ‐ Đại học Y Dược TPHCM và Khoa <br /> Di truyền học Phân Tử ‐ Bệnh viện Truyền máu <br /> Huyết học TP.HCM <br /> <br /> Tách chiết genomic DNA <br /> Chúng tôi dùng QIAamp DNA Kit (Qiagen, <br /> Mỹ) để tách chiết genomic DNA từ 200 μL máu <br /> ngoại vi theo hướng dẫn của nhà sản xuất. <br /> <br /> Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA <br /> RNA được tách chiết từ 5 mL máu ngoại vi <br /> bằng RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng <br /> dẫn  của  nhà  sản  xuất.  RNA  được  đo  nồng  độ <br /> bằng  máy  quang  phổ  kế  spectrophotometer. <br /> cDNA được tổng hợp từ 1 μg RNA với bộ hóa <br /> chất  SuperScript™  II  Reverse  Transcriptase <br /> (Invitrogen, Mỹ). <br /> <br /> Thiết kế mồi cho PCR (polymerase chain reaction) <br /> Các đoạn mồi được thiết kế bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của UNC13D mang <br /> accession number NG_007266 trong GenBank. Thông tin về các đoạn mồi được trình bày trong Bảng <br /> 1. <br /> Bảng 1: Thông tin về các đoạn mồi dùng trong PCR. <br /> Tên<br /> UNC-g1F<br /> UNC-g6R<br /> UNC-g7F<br /> <br /> 94<br /> <br /> Trình tự (5’---3’)<br /> ATAATCCTGTGGCTTCGCTG<br /> AGGACGACCTACTCATCTCA<br /> TGTGGTCACTTACTGCTTCG<br /> <br /> Vùng gen được khuếch đại<br /> <br /> Sản phẩm PCR (bp)<br /> <br /> Exon 1 – 6 (genomic DNA)<br /> <br /> 2059<br /> <br /> Exon 7 – 12 (genomic DNA)<br /> <br /> 1343<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  <br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> UNC-g12R<br /> UNC-g13F<br /> UNC-g20R<br /> UNC-g21F<br /> UNC-g25R<br /> UNC-g26F<br /> UNC-R6<br /> UNC-F1<br /> UNC-R2<br /> UNC-F3<br /> UNC-R4<br /> UNC-F4<br /> UNC-R6<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013<br /> CAAAGGGAACTCTGCTGAGA<br /> TCAGCCTGTACTGGTGGATG<br /> ACTACGCTTTGGAGGTCCAG<br /> TCTGTGCCTGGTGATGGTAG<br /> TACACCCCTCAGAACGGATG<br /> CGTCTTTGCTTCCTCCTCCG<br /> GGGAAGCCCCAGACCCTACA<br /> CTTCGCTGTCTTCACCCAG<br /> AAAGAGGACGGTGGCAGCCT<br /> ACGAGGTCACCCAGCACGAG<br /> TGTTGGCTGCCTGGCCTTGG<br /> CTTGCTGGGCCTGGTACAGG<br /> GGGAAGCCCCAGACCCTACA<br /> <br /> Thực hiện PCR <br /> Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 25 μL, <br /> các thành phần gồm  có  PCR  buffer,  dNTP  (250 <br /> μM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 <br /> μM  cho  mỗi  loại),  TaKaRa  TaqTM  HotStart <br /> Polymerase  (1,25  unit)  và  20  ng  genomic  DNA <br /> hoặc  cDNA.  Chu  kỳ  luân  nhiệt  được  thực  hiện <br /> trên máy GeneAmp® PCR system 9700 (Applied <br /> Biosystems,  Mỹ)  bao  gồm  giai  đoạn  biến  tính <br /> ban  đầu  ở  980C  trong  2  phút,  theo  sau  bằng  40 <br /> chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn <br /> mồi ở 600C trong 20 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở <br /> 720C trong 2 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo <br /> dài  sản  phẩm  ở  720C  trong  5  phút.  Riêng  PCR <br /> của  cặp  mồi  UNC‐g26F  và  UNC‐R6  (exon  26  – <br /> 32)  được  thực  hiện  gắn  mồi  và  tổng  hợp  chuỗi <br /> DNA ở 680C trong 3 phút. Sản phẩm PCR được <br /> phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,2% <br /> có  nhuộm  ethidium  bromide  và  quan  sát  dưới <br /> màn  soi  gel  Pringraph  (Atto,  Nhật  Bản),  tinh <br /> sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit và được <br /> kiểm  tra  lại  bằng  điện  di  trên  thạch  agarose <br /> 1,2%. <br /> <br /> Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA <br /> Sản  phẩm  PCR  đã  được  tinh  sạch  sẽ  được <br /> thực  hiện  phản  ứng  cycle  sequencing  với <br /> BigDye  V3.1  từ  Applied  Biosystems,  theo  2 <br /> chiều  xuôi  và  ngược  cho  mỗi  exon.  Sản  phẩm <br /> sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong <br /> Hi‐Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 phút <br /> trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được <br /> đọc  bằng  máy  ABI  3130  Genetic  Analyzer,  với <br /> <br /> Exon 13 – 20 (genomic DNA)<br /> <br /> 1700<br /> <br /> Exon 21 – 25 (genomic DNA)<br /> <br /> 2288<br /> <br /> Exon 26 – 32 (genomic DNA)<br /> <br /> 3526<br /> <br /> Exon 1 – 12 (RNA)<br /> Exon 12 – 21 (RNA)<br /> Exon 17 – 32 (RNA)<br /> <br /> 1061<br /> 1158<br /> 1879<br /> <br /> POP‐7  polymer  và  capillary  80  cm  (Applied <br /> Biosystems,  Mỹ).  Kết  quả  được  phân  tích  bằng <br /> phần  mềm  SeqScape.  Số  thứ  tự  của  các <br /> nucleotide  được  tính  theo  chuỗi  cDNA  bình <br /> thường  của  UNC13D  mang  accession  number <br /> NG_007266 trong GenBank. Thuật ngữ dùng để <br /> mô tả các thay đổi trình tự  DNA dựa theo den <br /> Dunen  và  cộng  sự(1).  Adenine  đầu  tiên  của  mã <br /> khởi  đầu  ATG  mang  số  +1,  “c.”  để  chỉ  cDNA, <br /> “IVS” chỉ intron: G của GT đầu tiên trong intron <br /> mang  số  +1,  G  của  AG  cuối  cùng  trong  intron <br /> mang số ‐1. <br /> <br /> KẾT QUẢ <br /> Xây  dựng  kỹ  thuật  giải  trình  tự  DNA  của <br /> gen UNC13D <br /> Gen  UNC13D  gồm  32  exon  với  tổng  chiều <br /> dài  khoảng  17,5  kb.  Để  khuếch  đại  toàn  bộ  32 <br /> exon  và  vùng  tiếp  giáp  exon  –  intron  của <br /> genomic DNA, chúng tôi thiết kế 5 cặp mồi, với <br /> các sản phẩm PCR trong khoảng 1343 – 3526 bp. <br /> Hình  1A  cho  thấy  mỗi  cặp  mồi  đã  khuếch  đại <br /> đặc  hiệu  các  vùng  exon  –  intron  của  gen <br /> UNC13D. <br /> Phản  ứng  reverse  transcriptase  PCR  cũng <br /> được  thực  hiện  để  kiểm  tra  đột  biến  ở  mức <br /> RNA.  Trong  hình  1B,  các  đoạn  cDNA  đã  được <br /> khuếch đại với kích thước tương ứng 1061, 1158 <br /> và 1879 bp. <br /> <br /> 152<br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 <br /> <br />  <br /> Các  sản  phẩm  PCR  sau  khi  được  tinh  sạch <br /> đã  được  tiến  hành  giải  trình  tự  chuỗi  DNA  để <br /> xác định các thay đổi trên gen UNC13D. Toàn bộ <br /> các kết quả giải trình tự chuỗi DNA đều cho kết <br /> quả đặc hiệu với các vùng gen UNC13D đã được <br /> khuếch đại. <br /> <br /> Phát hiện đột biến gen UNC13D trên bệnh <br /> nhân hội chứng thực bào máu <br /> Do hạn chế của kinh phí và thời gian, chúng <br /> tôi chỉ tiến hành khảo sát đột biến gen UNC13D <br /> trên 10 bệnh nhân đã được loại trừ đột biến gen <br /> perforin. Có tất cả 26 kiểu thay đổi trên exon và <br /> intron được phát hiện (Bảng 2). Hầu hết các thay <br /> đổi  này  là  những  SNP  đã  được  báo  cáo  trước <br /> đây(13),  ngoại  trừ  thay  đổi  IVS26+5C>G  thuộc <br /> intron 26 và thay đổi c.3151G>A thuộc exon 31. <br /> Chúng tôi không thể thực hiện khảo sát ở mức <br /> RNA  cho  bệnh  nhân  có  IVS26+5C>G  do  không <br /> có  mẫu  dự  trữ  thích  hợp  cho  nghiên  cứu  tiếp <br /> theo. <br /> <br /> IVS12-13C>T<br /> IVS18+36A>G<br /> IVS19+70T>C<br /> c.1744C>T<br /> c.1977C>T<br /> IVS21+5G>A<br /> IVS23-46C>T<br /> IVS25-8delC<br /> IVS26+5C>G<br /> c.2599A>G<br /> IVS28+48C>T<br /> IVS29+37C>G<br /> c.3151G>A<br /> IVS31+82G>A<br /> c.3198A>G<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Intron 12<br /> Intron 18<br /> Intron 19<br /> Exon 20<br /> Exon 21<br /> Intron 21<br /> Intron 23<br /> Intron 25<br /> Intron 26<br /> Exon 27<br /> Intron 28<br /> Intron 29<br /> Exon 31<br /> Intron 31<br /> Exon 32<br /> <br /> Leu582Leu<br /> Thr659Thr<br /> <br /> Lys867Glu<br /> <br /> Chưa rõ<br /> Glu1066Glu<br /> <br /> 3<br /> 3<br /> 3<br /> 1<br /> 2<br /> 1<br /> 3<br /> 3<br /> 1<br /> 1<br /> 2<br /> 1<br /> 2<br /> 1<br /> 3<br /> <br /> Trong  2  bệnh  nhân  có  thay  đổi  c.3151G>A, <br /> chúng tôi đã tiến hành khảo sát được bất thường <br /> ở  mức  RNA  cho  một  bệnh  nhân.  Hình  2  cho <br /> thấy  có  sự  cắt  bỏ  exon  31  trong  bản  phiên  mã <br /> RNA của bệnh nhân này. Hậu quả là protein bị <br /> đột  biến  có  13  amino  acid  mới  được  tạo  trước <br /> khi có hiện tượng cắt bỏ phần đuôi carboxyl. <br /> <br /> Bảng 2: Các thay đổi của gen UNC13D được phát <br /> hiện trong nghiên cứu này. <br /> Thay đổi<br /> nucleotide<br /> IVS1+30G>A<br /> IVS1+59C>T<br /> IVS2+67C>T<br /> IVS2-19G>A<br /> IVS2-16G>A<br /> IVS3+26C>G<br /> IVS3+69G>A<br /> c.279C>T<br /> IVS5+81G>A<br /> IVS5+122C>T<br /> c.888G>C<br /> <br /> Vị trí<br /> Intron 1<br /> Intron 1<br /> Intron 2<br /> Intron 2<br /> Intron 2<br /> Intron 3<br /> Intron 3<br /> Exon 4<br /> Intron 5<br /> Intron 5<br /> Exon 11<br /> <br /> Thay đổi<br /> Số trường<br /> amino acid hợp (n = 10)<br /> 3<br /> 3<br /> 3<br /> 2<br /> 1<br /> 2<br /> 1<br /> Pro93Pro<br /> 2<br /> 1<br /> 1<br /> Pro296Pro<br /> 1<br /> <br /> 153<br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh <br /> <br />  <br /> <br /> BÀN LUẬN <br /> Đột biến gen UNC13D lần đầu tiên được mô <br /> tả  vào  năm  2003  trên  những  bệnh  nhân  bị <br /> <br />