Phát hiện hai nhóm Escherichia Coli Epec và Eiec gây tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật PCR

Nguyễn Phú Hùng và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 65(03): 155 - 158<br /> <br /> PHÁT HIỆN HAI NHÓM ESCHERICHIA COLI EPEC VÀ EIEC<br /> GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR<br /> Nguyễn Phú Hùng1*, Phạm Thị Nhàn1<br /> Lê Thị Thu Hà1, Lê Thành Công1<br /> Phùng Đắc Cam2<br /> 1<br /> Trường Đại học Khoa Học – ĐH Thái Nguyên<br /> 2<br /> Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương)<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Escherichia coli là tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Đây là đối<br /> tƣợng gây viêm ruột theo nhiều cơ chế khác nhau. Dựa trên cơ sở này, E.coli gây tiêu chảy đƣợc<br /> phân thành các nhóm khác nhau là ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC, mỗi nhóm có một cơ chế<br /> sinh bệnh đặc trƣng. Dựa trên sự khác biệt trong cấu trúc genome của từng nhóm, trong nghiên<br /> cứu này, chúng tôi đã ứng dụng thành công kĩ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 2<br /> trong số 5 nhóm khác nhau của E.coli gây tiêu chảy từ các chủng chuẩn EPEC và EIEC. Đây là<br /> tiền đề quan trọng để chúng tôi tiến hành tối ƣu hoá và phát triển thành bộ sinh phẩm phát hiện<br /> nhanh tác nhân gây tiêu chảy là E.coli ở ngƣời. Ƣu điểm của kỹ thuật là này cho phép phát hiện<br /> tác nhân gây bệnh với độ đặc hiệu gần nhƣ 100%.<br /> Từ khóa: Tương đồng di truyền, tiêu chảy, PCR, nhiễm trùng bệnh viện, Ecoli.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tiêu chảy là một bệnh phổ biến trên toàn cầu,<br /> đặc biệt là ở các đang phát triển. Việt Nam là<br /> nƣớc nằm trong vùng nhiệt đới, điều kiện vệ<br /> sinh kém, vì vậy bệnh tiêu chảy khá phổ biến.<br /> Theo các nghiên cứu mới đây, bệnh tiêu chảy<br /> ở nƣớc ta đứng thứ nhất trong 10 bệnh phổ<br /> biến nhất và đứng hang thứ tƣ trong 10 bệnh<br /> có tỉ lệ tử vong cao nhất. Trẻ em là đối tƣợng<br /> dễ mắc tiêu chảy nhất, trung bình trẻ dƣới 5<br /> tuổi mỗi năm mắc tiêu chảy 2 – 2,2 lần [2],<br /> [3]. Có nhiều tác nhân sinh học khác nhau dẫn<br /> tới tiêu chảy ở ngƣời nhƣ: tác nhân là virus<br /> (ví dụ: virus rota, virus adeno, virus<br /> Norwalk…), kí sinh trùng (ví dụ: giun tròn,<br /> sán dây, sán lá, các loại đơn bào (protozoa) và<br /> vi khuẩn (Escherichia coli, Shigella, Vibrio<br /> cholera…). Để kiểm soát dịch tiêu chảy, công<br /> tác chẩn đoán, xác định tác nhân gây bệnh giữ<br /> một vai trò đặc biệt quan trọng. Trong số các<br /> tác nhân kể trên, E.coli là đối tƣợng đƣợc<br /> quan tâm và nghiên cứu nhiều. Các E.coli<br /> gây tiêu chảy đƣợc chia làm 5 nhóm là: E.coli<br /> gây bệnh đƣờng ruột(Enteropathology E.coli<br /> *<br /> <br /> *<br /> <br /> – EPEC); E.coli<br /> sinh độc tố ruột<br /> (Enterotoxigenic E.coli – ETEC); E.coli xâm<br /> nhập ruột (Enteroinvasive E.coli – EIEC),<br /> E.coli<br /> gây<br /> xuất<br /> huyết<br /> ruột<br /> (Enterohaemorrhagic E.coli – EHEC) và<br /> E.coli<br /> bám<br /> dính<br /> đƣờng<br /> ruột<br /> (Enteroaggregative E.coli – EAEC). Hiện đã<br /> có nhiều công trình nghiên cứu về chẩn đoán<br /> phân biệt các nhóm E.coli gây bệnh khác<br /> nhau đã đƣợc thực hiện[1], [4],[5], [10]. Trong<br /> báo này, chúng tôi đã tiến hành áp dụng kĩ<br /> thuật PCR đặc hiệu để xác định chính xác hai<br /> nhóm E.coli là EPEC và EIEC trong 5 nhóm<br /> nêu trên. Đây là một phần trong nghiên cứu<br /> của chúng tôi về ứng dụng kỹ thuật PCR để<br /> xác định 5 nhóm E.coli gây tiêu chảy ở ngƣời.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> Nguyên liệu nghiên cứu là các chủng E.coli<br /> chuẩn quốc tế do Giáo sƣ Phùng Đắc Cam,<br /> Phòng Vi khuẩn đƣờng ruột - Viện vệ sinh<br /> dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.<br /> Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số và<br /> các loại hóa chất chuyên dụng dùng cho các<br /> kỹ thuật sinh học phân tử có chất lƣợng tốt,<br /> do các hãng có uy tín cung cấp.<br /> <br /> Tel 0914791904, Email: hungnguyenphu@gmail.com<br /> <br /> 155<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Phú Hùng và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu bao gồm phƣơng<br /> pháp tách chiết DNA tổng số từ các chủng vi<br /> khuẩn làm nguyên liệu cung cấp cho các phản<br /> ứng PCR. Phƣơng pháp khuếch đại gen đích<br /> bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Kết quả tách DNA tổng của vi khuẩn E.coli<br /> Từ các chủng E.coli chuẩn quốc tế: EPEC,<br /> EIEC và chủng đối chứng EC đƣợc giữ trong<br /> ống thạch nghiêng, chúng tôi lấy một vài<br /> khuẩn lạc đem nuôi cấy trong môi trƣờng LB<br /> lỏng ở nhiệt độ 370C qua đêm. Dịch nuôi cấy<br /> đƣợc li tâm, thu sinh khối để tiến hành tách<br /> chiết và tinh sạch DNA tổng số. E.coli là vi<br /> khuẩn gram âm, do đó trong nghiên cứu này<br /> chúng tôi đã tiến hành tách chiết theo phƣơng<br /> pháp của Sambrock và cộng sự. DNA thu<br /> đƣợc trong quá trình tách chiết đƣợc kiểm tra<br /> bằng phƣơng pháp điện di và phƣơng pháp đo<br /> mật độ quang bằng máy quang phổ. Kết quả<br /> điện di DNA tổng số đƣợc trình bày trong<br /> hình 2.1. Từ kết quả điện di cho thấy, các<br /> phân tử DNA thu đƣợc ít bị đứt gãy, có một<br /> băng gọn duy nhất. Các băng xuất hiện với độ<br /> đậm khi nhuộm bằng ethidium bromide đã<br /> chứng tỏ phƣơng pháp tách chiết cho phép thu<br /> đƣợc một lƣợng DNA lớn. Tiếp theo chúng<br /> tôi tiến hành xác định nồng độ DNA bằng<br /> phƣơng pháp quang phổ làm cơ sở để pha<br /> loãng DNA đến nồng độ cuối cùng cho phản<br /> ứng PCR đặc hiệu. Kết quả điện di DNA tổng<br /> số đƣợc trình bày trong hình 1.<br /> <br /> Hìnhquả<br /> 1. DNA<br /> tổng số<br /> củagen<br /> đối tƣợng<br /> nghiênnhóm<br /> cứu:<br /> Kết<br /> khuếch<br /> đại<br /> đặc hiệu<br /> EPEC<br /> 1. Chủng EPEC; 2 Chủng EIEC<br /> Cơ chế gây bệnh của nhóm này liên quan mật<br /> thiết tới khả năng bám dính, khu trú, truyền<br /> tín hiệu vào trong tế bào làm thoái hoá các vi<br /> nhung mao, làm rối loạn quá trình hấp thu<br /> <br /> 65(03): 155 - 158<br /> <br /> nƣớc và điện giải. Sự truyền tín hiệu vào tế<br /> bào do các protein mã hoá bởi các gen eae,<br /> esp B, espA, esp D, sep, esp nằm trên nhiễm<br /> sắc thể quy định. Trong đó protein đƣợc gọi<br /> là intimin có trọng lƣợng phân tử 97 kDa mã<br /> hoá bởi gen eae liên quan tới cơ chế gắn mật<br /> thiết đóng vai trò chủ yếu trong cơ chế gây<br /> bệnh của nhóm này. Trên cơ sở đó, chúng tôi<br /> đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu gen eae có kí<br /> hiệu và trình tự là:<br /> eae<br /> F:<br /> CACACGAATAAACTGACTAAAATG và<br /> eae<br /> R:<br /> AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT.<br /> Theo lý thuyết thiết kế, cặp mồi này cho<br /> phép khuếch đại một phân đoạn của gen eae<br /> có kích thƣớc 376 cặp nucleotide. Nhiệt độ<br /> bắt cặp mồi là 520C. Sản phẩm của phản ứng<br /> PCR đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp điện<br /> di trên gel agarose 1%.<br /> M<br /> <br /> 603<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 360<br /> <br /> 310<br /> Hình 2. Sản phẩm khuếch đại gen eae<br /> M. quả<br /> Macker<br /> cắt2,<br /> bằng<br /> Từ kết<br /> điện X<br /> di174<br /> hình<br /> cănHind<br /> cứ III<br /> vào kích<br /> Đối chứng<br /> EC,cho<br /> 2. EPEC<br /> thƣớc của 1.macker<br /> chuẩn<br /> thấy phân đoạn<br /> <br /> DNA đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi eae F và<br /> eae R có kích thƣớc khoảng 370 cặp<br /> nucleotide. Kích thƣớc này phù hợp với tính<br /> toán lý thuyết trong quá trình thiết kế mồi.<br /> Sản phẩm đƣợc nhân lên có tính đặc hiệu cao,<br /> không có sản phẩm phụ. Mặt khác tại đƣờng<br /> chạy số 1, chủng EC đƣợc sử dụng làm đối<br /> chứng âm đã cho kết quả âm tính. Nhƣ vậy,<br /> có thể khẳng định chúng tôi đã khuếch đại<br /> thành công gen eae đặc hiệu cho nhóm EPEC.<br /> Kết quả này của chúng tôi hoàn toàn phù hợp<br /> với các nghiên cứu trƣớc đó [5], [7].<br /> Kết quả khuếch đại gen đặc hiệu nhóm<br /> EIEC<br /> <br /> 156<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Phú Hùng và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 65(03): 155 - 158<br /> <br /> EIEC gây bệnh bằng cách xâm nhập vào các<br /> tế bào biểu mô đại tràng.<br /> Các gen mã hoá các protein liên quan đến<br /> quá trình xâm nhập nằm trên cả plasmid và<br /> nhiễm sắc thể. Plasmid của nhóm này đƣợc<br /> ký hiệu là pInv có trọng lƣợng phân tử là 140<br /> mDa chứa các gen mxi và ipa mã hoá cho các<br /> protein cần thiết cho quá trình xâm nhập gồm<br /> IpaA, IpaB, IpaC, IpaD, IpaH. Trong nghiên<br /> cứu này chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc cho<br /> nhóm EIEC dựa trên đặc hiệu của nhóm là<br /> IpaH. Trình tự của cặp mồi là:<br /> <br /> cộng sự, chúng tôi đã thu đƣợc DNA tổng số<br /> từ các đối tƣợng nghiên cứu với độ tinh sạch<br /> cao, không đứt gãy, phục vụ tốt cho quá trình<br /> PCR. Kết quả PCR đã nhân lên đƣợc hai băng<br /> với kích thƣớc khoảng 360 cặp nucleotide đặc<br /> hiệu cho gen eae của nhóm EPEC và phân<br /> đoạn thứ hai có kích thƣớc khoảng 620 cặp<br /> nucleotide đặc hiệu cho gen ipH của nhóm<br /> EPEC. Kết quả này là tiền đề quan trọng để<br /> chúng tôi tiến hành nghiên cứu, tạo bộ sinh<br /> phẩm chẩn đoán E.coli gây tiêu chảy trong<br /> nghiên cứu tiếp theo.<br /> <br /> IpaH F: GTT CCT TGA CCG CCT TTC CGA<br /> TAC CGT C và IpaH R: GCC GGT CAG CCA<br /> CCC TCT GAG AGT AC<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> M 1 2<br /> <br /> 873<br /> 603<br /> <br /> 620<br /> <br /> Hình 3. Sản phẩm khuếch đại gen ipaH<br /> M. Macker X 174 cắt bằng Hind III<br /> 1. Đối chứng EC<br /> 2. EPEC<br /> <br /> Phân tích hình ảnh điện di sản sản phẩm PCR<br /> (hình 3) cho thấy, mẫu đối chứng âm (EC) đã<br /> không có sản phẩm đƣợc khuếch đại với cặp<br /> mồi ipHF và ipHR mà chúng tôi thiết kế đặc<br /> hiệu cho nhóm EIEC. Tuy nhiên, tại đƣờng<br /> chạy số 2 của mẫu chuẩn EIEC, chúng tôi đã<br /> nhận đƣợc kết quả dƣơng tính, đã có một<br /> băng DNA duy nhất với kích thƣớc khoảng<br /> 620 cặp nucleotit, tƣơng ứng với kích thƣớc<br /> lý thuyết khi thiết mồi. Có thể khẳng định kết<br /> quả của chúng tôi thu đƣợc là hoàn toàn phù<br /> hợp với nhiều công bố của các tác giả khác<br /> trên thế giới [4], [8], [9].<br /> KẾT LUẬN<br /> Bằng phƣơng pháp tách DNA tổng số trên đối<br /> tƣợng vi khuẩn gram âm của Sambrock và<br /> <br /> [1].Adrienne W. Paton and James C. Paton (1998),<br /> “Detection and Characterization of Shiga Toxigenic<br /> Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays<br /> for stx1, stx2, eaeA, Enterohemorrhagic E. coli<br /> hlyA, rfbO111, and rfbO157”, J Clin Microbiol,<br /> Vol. 36, Pp: 598-602.<br /> [2].Phùng Đắc Cam (2009), Bệnh tiêu chảy, Nxb<br /> Y học.<br /> [3].Hoàng Thủy Long (2007), Kỹ thuật xét nghiệm<br /> vi sinh vật y học, Nxb Văn hoá.<br /> [4].Jaims P. Natoro, Jaims B. Kaper (1998),<br /> “Diarrheagenic Escherichia coli” Cnilical<br /> Microbiology Review, Vol. 11, No. 1. Pp 142–201.<br /> [5].Hornitzky MA, Bettelheim KA, Djordjevic SP<br /> (2001), “The detection of Shiga toxin-producing<br /> Escherichia coli in diagnostic bovine faecal<br /> samples using vancomycin-cefixime-cefsulodin<br /> blood agar and PCR”, FEMS Microbiol Lett, Vol.<br /> 198, No. 1, Pp 17 – 22.<br /> [6].Seker E, Kuyucuoğlu Y, Sareyyüpoğlu B,<br /> Yardımcı H (2009), “PCR Detection of Shiga<br /> Toxins, Enterohaemolysin and Intimin Virulence<br /> Genes of Escherichia coli O157:H7 Strains<br /> Isolated from Faeces of Anatolian Water Buffaloes<br /> in Turkey”, Zoonoses Public Health.<br /> [7]. Ooka T, Terajima J, Kusumoto M, Iguchi A,<br /> Kurokawa K, Ogura Y, Asadulghani M,<br /> Nakayama K, Murase K, Ohnishi M, Iyoda S,<br /> Watanabe H, Hayashi T (2009), “Development of<br /> a multiplex PCR-based rapid typing method for<br /> enterohemorrhagic Escherichia coli O157<br /> strains”, J Clin Microbiol, Vol. 47, No.9, Pp,<br /> 2888-2894.<br /> <br /> 157<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Phú Hùng và cs<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> [8]. S Stacy-Phipps, JJ Mecca and JB Weiss<br /> (1995), “Multiplex PCR assay and simple<br /> preparation method for stool specimens detect<br /> enterotoxigenic Escherichia coli DNA during<br /> course of infection” J Clin Microbiol, Vol. 33, No.<br /> 5, 1054-1059<br /> [9]. Pina M. Fratamico, Connie E. Briggs,<br /> Danielle Needle, Chin-Yi Chen, and Chitrita<br /> DebRoy (2003), “Sequence of the Escherichia coli<br /> O121 O-Antigen Gene Cluster and Detection of<br /> <br /> 65(03): 155 - 158<br /> <br /> Enterohemorrhagic E. coli O121 by PCR<br /> Amplification of the wzx and wzy Genes” J Clin<br /> Microbiol, Vol. 41, Pp: 3379-3383.<br /> [10]. Sensitivities and Specificities of Premier<br /> (1998), “E. coli O157 and Premier EHEC Enzyme<br /> Immunoassays for Diagnosis of Infection with<br /> Verotoxin<br /> (Shiga-Like<br /> Toxin)-Producing<br /> Escherichia coli”, J Clin Microbiol. Vol. 36, Pp:<br /> 1608-1611.<br /> <br /> DETECTION OF TWO GROUP OF DIARRHEAGENIC ESCHERICHIA COLI<br /> IN HUMAN EPEC AND EIEC BY PCR TECHNIQUE<br /> Nguyen Phu Hung12, Pham Thi Nhan1,<br /> Le Thi Thu Ha1, Le Thanh Cong1<br /> 1<br /> College of Science – Thai Nguyen University<br /> Phung Dac Cam2<br /> 2<br /> National Institute of hygiene and epidemiology2<br /> <br /> SUMMARY<br /> Escherichia coli is an underestimated diarrheal pathogen in almost countries in the wold. This<br /> organism may cause gastroenteritis by many different mechanisms, and on the basis of this,<br /> diarrheagenic E. coli has been subdivided into different groups are ETEC, EHEC, EIEC, EPEC,<br /> EAEC. Each of groups has a special pathogenic mechanisms. On the basis of genomic structure of<br /> these every strains, in this this study, has been applied successfully PCR technique with two pairs<br /> of primers to detect 2 of 5 different types of diarrheogenic Escherichia coli are EPEC and EIEC<br /> from standar samples. This is important prime to deverloping diagnosistic technique for<br /> diarrheagenic E. coli. The advantages of this technique are that it allows to screen and diagnose<br /> these pathogens with its sensitivity and specificity nearly 100%.<br /> Key words:E.coli, PCR, diarohea hopitol Infections, Genetic Similarity<br /> <br /> 2<br /> <br /> Tel 0914791904, Email: hungnguyenphu@gmail.com<br /> <br /> 158<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.Lrc-tnu.edu.vn<br /> <br />