Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước

Chia sẻ: 3 3 | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:30

Thêm vào BST

Báo xấu

179
lượt xem 42
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tham khảo sách 'phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước', tài liệu phổ thông, sinh học phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước

Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ THỰC PHẨM 1. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỰC PHẨM 1.1 Kế hoạch lấy mẫu Mật độ các vi sinh vật trong thực phẩm được qui đ ịnhgi ới h ạn v ới m ột s ố l ượng nh ật định tuỳ theo từng nhóm vi sinh vật cần phân tích và yêu c ầu của t ừng đ ối t ượng th ực ph ẩm cũng như các luật về vệ sinh an toàn thực phẩm. Đối với các vi sinh vật gây b ệnh thông th ường yêu cầu không được hiện diện trong một khối lượng thực phẩm xác định. S ố l ựơng vi sinh v ật được xác định trong thực phẩm có thể không bao gi ờ phản ánh chính xác s ố l ượng vi sinh v ật thực tế có trong mẫu, vì thế một khoảng giới hạn theo thông lệ được thi ết lập đ ể nhận bi ết các mẫu thực phẩm đạt hay không đạt yêu cầu vi sinh vật. Thông thường các kho ảng gi ới h ạn mật độ vi sinh vật trong thực phẩm được xác định bằng các kho ảng nh ư sau: Kho ảng ch ấp nhận khi mật độ vi sinh vật nằm dưới một thông số chấp nh ận (m), kho ảng sát mép gi ới h ạn khi mật độ vi sinh này lớn hơn giới hạn chấp nhận nhưng nhỏ hơn gi ới hạn trên (M). Kho ảng không chấp nhận khi mật độ này cao hơn giới hạn trên M. Gi ới hạn M th ường cao h ơn ít nh ất 10 lần so với thông số giới hạn m. Ví dụ tổng số vi sinh vật trong sản phẩm tr ứng đ ược thanh trùng Pasteur có yêu cầu như sau: n = 5, c = 2, m = 5 x 104, M = 106 Trong đó n là số mẫu thử nghiệm, c là số mẫu được phép nằm trong khoảng sát mép giữa m và M. Kế hoạch lấy mẫu loại 2 được dùng cho các thử nghiệm phân tích vi sinh v ật gây b ệnh. Theo kế hoạch này, số mẫu được lấy có thể 5,10, 20, 25 hay nhiều hơn để phân tích định tính nhằm phát hiện có hay không có sự hiện diện các vi sinh vật trong kh ối l ượng m ẫu th ử nghi ệm như trên. Sẽ không chấp nhận nếu có một trong số các mẫu trên có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh (n = 5,10,20 hay nhiều hơn, c = 0 và n = 0). S ố l ượng m ẫu th ử ph ụ thu ộc vào m ối nguy hiểm của từng loại thực phẩm nếu có sự hiện diện c ủa vi sinh v ật gây b ệnh. Th ực ph ẩm có mối nguy hiểm cao là những loại thực phẩm không qua gia nhi ệt tr ước khi s ử d ụng hay những thực phẩm có tính nhạy cảm cao, ví dụ thực phẩm dành cho người già và trẻ em … Lấy mẫu cho việc phân tích Salmonella: Số lượng đơn vị mẫu để phân tích Salmonella phụ thuộc vào các yếu tố đặc trưng của từng loại thực phẩm, có thể chia thành 3 nhóm thực phẩm chính như sau: - Nhóm thực phẩm dùng cho các đối tượng nhạy cảm với Salmonella nhưng không qua quá trình chế biến trước khi sử dụng, ví dụ thực phẩm dành cho người già, dành cho ng ười bệnh hay dành cho trẻ em. Trong nhóm này số lượng đơn vị mẫu phải lấy khoảng 60 đ ơn v ị mẫu. - Nhóm thực phẩm dành cho người trưởng thành. S ố lượng đ ơn v ị m ẫu đ ược l ấy th ường là 30 đơn vị. - Nhóm thực phẩm mà trong chế biến quá trình có qua giai đo ạn có th ể tiêu di ệt Salmonella. Bước chế biến này có thể diển ra trong quá trình sản xu ất hay ch ế bi ến t ại gia đình. Trong nhóm này, số lượng mẫu được lấy thường là 15 đơn vị. Mỗi đơn vị mẫu được lấy ít nhất 100g, thông thường được lấy nguyên m ột đ ơn v ị s ản phẩm. Đơn vị mẫu được lấy ngãu nhiên sao cho m ẫu đó đại di ện cho c ả lô s ản ph ẩm. Trong trường hợp phải tách mẫu vào trong các vật dụng lấy m ẫu ph ải luôn l ấy m ột m ẫu ki ểm ch ứng 53
để đảm bảo điểu kiện bảo quản mẫu tương tự với điều kiện khi lấy mẫu. Nếu m ột đơn vị sản phẩm không đủ khối lượng mẫu cần thiết, như trong trường hợp đ ơn v ị sản phẩm đ ược đóng gói nhỏ hơn 100g, khi đó mỗi đơn vị mẫu phải lấy nhiều hơn một đơn vị sản phẩm. Tại phòng thí nghiệm, các chuyên viên phân tích sẽ lấy đại di ện 25g (hay kh ối l ượng theo yêu cầu phân tích) từ các đơn vị mẫu để phân tích Salmonella. Trong trường hợp số đơn vị sản phẩm nhiều hơn số đơn vị mẫu, các đơn vị sản phẩm sẽ được tổ hợp một cách vô trùng và phân tích viên sẽ lấy đại diện khối lượng mẫu phân tích. 1.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản Giá trị của kết quả được phát hành bởi các phòng thí ngiệm phân tích phụ thu ộc rất nhiều vào phương pháp và qui trình lấy mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp cho từng tr ường h ợp cụ thể để mẫu được mang vể phòng thí nghiệm phản ánh đúng tình tr ạng sản ph ẩm c ần phân tích. Trong các nhà máy sản xuất, thông thường mẫu được lấy v ới m ột kh ối l ượng nh ỏ t ại nhiều thời điểm và công đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất, không nên l ấy m ột kh ối lượng lớn mẫu tại cùng một vị trí hay một công đoạn. Có thể tập trung l ấy m ẫu t ại công đo ạn thành phẩm nhiều hơn, nhưng trong một số trường hợp c ần thi ết có thể tập trung l ấy m ẫu t ại một vài công đoạn trọng yếu trong quá trình sản xuất. Dụng cụ lấy mẫu và thùng chứa mẫu: Thường sử dụng các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo, báo bao nylon để chứa mẫu. Không nên sử d ụng các bình b ằng thu ỷ tinh để chứa mẫu bởi vì có thể bị vở gây nhiễm mẫu hay gây tại nạn cho người phân tích. Dụng cụ lấy mẫu thường làm bằng các loại chất liệu khác khác nhau như v ật d ụng dùng để lấy mẫu đông lạnh là các khoan tay đã được vô trùng, hay các dao đ ược r ửa trong các dung dịch tẩy trùng. Không nên lấy vào các m ảng băng. S ử d ụng các thìa, kéo … đ ể cho m ẫu vào trong bình chứa. Đối với các thực phẩm đã đóng gói, lấy m ẫu t ừ các gói l ớn t ừ đó l ấy ra các đơn vị bao gói nhỏ hơn. Mẫu phải được lấy ít nhất khoảng 100-250g cho mỗi mẫu tuỳ theo các yêu c ầu phân tích, phải lấy tại nhiều vị trí trên sản phẩm hay trong cùng một công đo ạn sao cho m ột kh ối lượng nhỏ mẫu cũng đại diện cho sản phẩm đó. Đối với các loại mẫu thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh chủ yếu là trên bể mặt, vì th ế có th ể sử dụng các dụng cụ lấy mẫu bể mặt để quét trên bể mặt sản phẩm hay c ắt mẫu trên b ể m ặt với độ dày khoảng 2-3mm. Vận chuyễn và bảo quản mẫu: Các mẫu sau khi lấy được bảo quản một các độc lập với nhau trong các thùng bảo quản mẫu, làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan chảy trong suốt quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghi ệm. T ại phòng thí nghi ệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông hay được phân tích ngay trong thời gian có thể. Nếu không thể phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở –20 oC cho đến khi phân tích. Nếu các mẫu không thể bảo quản đông, thì phải bảo quản trong tủ l ạnh 0-4 oC không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp, hay th ực ph ẩm khó h ư hỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích. 1.3 Rã đông trước khi phân tích Phải sử dụng kỹ thuật rã đông trong điểu kiện vô trùng trước khi phân tích m ẫu. Trong trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được rã đông trong các d ụng c ụ chứa như khi mang đến phòng kiểm nghiệm. Tránh các tr ường h ợp chuyển m ẫu sang các bình chứa thứ hai khi rã đông. Thông thường nhiệt độ rả đông là 2-5 oC trong khoảng 18 giờ, nếu cần 54
phải rã đông nhanh có thể thực hiện ở 45 oC trong vòng 15 phút. Khi rã đông ỡ nhiệt độ cao, phải liên tục lắc bình chứa mẫu để tăng tốc độ rã và nhiệt độ của mẫu được đồng nhất. 1.1 Đồng nhất mẫu Sự phân phối của các vi sinh vật trong mẫu không đồng đều nhau. Đ ể đ ảm bảo tính đồng nhất trong các mẫu phân tích, các mẫu lỏng được lắc kỹ trước khi phân tích. Các m ẫu rắn được lắc hay đão trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng trong điều kiện vô trùng. Sau khi đ ảm bảo mẫu được đồng nhất, lấy một lượng mẫu xác định để phân tích tùy theo yêu c ầu c ủa t ừng chỉ tiêu cụ thể, ví dụ đối với các chỉ tiêu định lượng trong 1 gam, kh ối l ượng m ẫu trích ra đ ể phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính như Salmonella khối lượng mẫu trích ra là 25 gam … 1.2 Cân mẫu Cân một lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu c ầu nh ư trên, cân chính xác khối lượng mẫu nhất định, sai số của phép cân này là ± 0.1g. Lượng mẫu trích để phân tích được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng. 2. LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC Tiêu chí của việc lấy mẫu là mẫu phải đại diện mức cao nhất của n ước c ần phân tích. Để đạt được mục đích này, người lấy mẫu cần phải tuân thủ các qui định và qui trình trong việc lấy mẫu và phân tích. 2.1 Dụng cụ chứa mẫu Các dụng cụ lấy mẫu nhằm để phân tích vi sinh vật là những chai lọ đã đã được súc r ửa cẩn thận, tráng lại lần cuối cùng bằng n ước c ất và kh ử trùng tr ước khi s ử d ụng đ ế l ấy m ẩu. Có thể sử dụng các túi nhựa đã được khử trùng để làm dụng cụ chứa mẫu. Khử chlorin và độc tính kim loại trong mẫu nước Thêm một nhân tố có tính khử vào trong trong các chai l ọ dùng đ ẩ ch ứa m ẫu đ ể kh ử chlorin hay các halogen khác. Trong trường hợp không có các tác nhân khử trong các lọ lấy mẫu, sau khi thu những mẫu nước có chứa chlorin các chai lọ lấy mẫu không đ ược đóng n ắp. Nhân tố khử thường được sử dụng đế khử chlorin trong nước là sodium thiosulphate, ch ất này trung hoà và khử các các haologen trong nước nhằm ngăn cản sự tác đ ộng c ủa chúng lên các vi sinh vật trong mẫu trong thời gian vận chuyển. Sự lo ại bỏ các nhân t ố tác đ ộng lên vi sinh v ật trong quá trình vận vận chuyển và bảo quản mẫu để sau khi phân tích qu ả số l ượng vi sinh v ật ph ản ánh đúng mật độ của chúng ngay khi lấy mẫu. Hàm lượng sodium thiocianate được cho vào trong các lọ sao cho sau khi lấy m ẫu chúng phòng thích vào trong nước với nồng độ 100mg/l. Trong chai l ấy m ẫu có th ể tích 120ml thêm vào 0,1ml dung dịch Na2S2O3 10% sẽ trung hoà hết chlorin trong mẫu với n ồng độ 15mg/l. đ ối với nước uống hàm lượng chất khử chlorin có thể sử dụng thấp hơn, khoảng 0,1ml dung d ịch Na2S2O3 nồng độ 3% trong lọ chứa 120ml mẫu. Nồng độ chất khử này phóng thích vào trong mẫu nước là 18ml/l sẽ trung hoà nổng độ chlorin trong m ẫu là 5ml/l. Trong tr ường h ợp m ẫu nước được khử trùng với hàm lượng chlorin cao, nồng đ ộ các ch ất cho vào trong các l ọ l ấy mẫu phải đạt 100ml/l. Các tác nhân khử chlorin được cho vào trong các l ọ l ấy m ẫu tr ước khi khử trùng. Có thể sử dụng phương pháp khử trùng ướt hay khử trùng khô đối v ới các d ụng c ụ lấy mẫu. Ngày nay có các túi lấy mẫu chứa sằn các tác nhân khử chlorin được bán t ại các c ủa hàng vật tư phòng thí nghiệm. 55
Trong trường hợp mẫu nước chứa các kim lo ại như đồng, kẽm và các kim lo ại n ặng … với hàm lượng cao hay nước thải, trong các dụng cụ lấy mẫu phải cho vào các tác nhân khử độc tính của các kim loại này. Tác nhân này đặc bi ệt c ần thi ết khi th ời gian v ận chuy ển m ẫu trên 4 giờ. Chất khử độc tính của kim loại nặng được sử dụng là muối sodium c ủa EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) với hàm lượng phóng thích vào trong m ẫu là 372ml/l. EDTA được điều chỉnh vể pH 6,5 trước khi dùng. EDTA cũng được cho vào trong các d ụng c ụ l ấy mẫu trước khi khử trùng, hàm lượng cho vào là 0.3ml dung dịch EDTA 15% đối v ới chai l ấy 120ml mẫu. Có thể kết hợp sodium thiocianat với EDTA trong cùng một dụng cụ lấy mẫu. Qui trình lấy mẫu Mẫu được lấy vào trong các dụng cụ lấy mẫu, không được lấy đầy chai mà mà ph ải chừa một khoảng không trong chai chứa mẫu để đảm bảo m ẫu đ ược tr ộn đ ều b ằng cách l ắc trước khi phân tích. Mẫu được lấy phải đại diện cho nước được thử nghiệm, phải sử dụng các biện pháp vô trùng để tránh các trường hợp mẫu bị nhiễm từ bên ngoài hay nhiễm chéo gi ữa các mẫu với nhau. Trong quá trình lấy mẫu, giữ chặc chai cho đ ến khi n ước đ ầy chai, gi ữ các nút hay nắp chai không được nhiễm trong khi lấy mẫu. Sau khi lấy đầy m ẫu ph ải nút mi ệng chai ngay. Cách thực lấy mẫu được tiến hành như sau: - Lấy mẫu từ các nguồn là sông, suối, hồ chứa bằng cách c ầm chai l ấy m ẩu trong tay, gần vị trí đáy chai, đưa cổ chai hướng xuống dưới và đưa sâu vào dưới mặt n ước. Xoay nhẹ để cổ chai hơi nghiên lên bề mặt nước và miệng chai hường về phía dòng chảy. Trong trường h ợp không có dòng chảy như nước trong hồ hay trong các bồn chứa phải tạo ra một dòng ch ảy nhân tạo bằng cách xoay chai theo hướng nằm ngang và đẩy chai di chuyển về phía theo h ương miệng chai. Trong trường hợp lấy mẫu khi đi trên thuyền, mẫu phải được lấy ở phía tr ước mũi thuyền. Nếu không thể lấy bằng cách thức này, có thể buộc một vật nặng vào bên d ưới đáy chai rồi đưa từ từ vào trong nước. Trong mọi trường hợp đều tránh chai l ấy m ẫu ti ếp xúc v ới bờ hay đáy của suối hai bồn chứa. - Có các dụng cụ đặc biệt cho phép mở nắp và lấy mẫu bên dưới mặt nước được sử dụng để lấy các mẫu nước sâu trong các hồ hay các bồn ch ứa. Có rất nhi ều bình l ất m ẫu sâu hoạt động theo nhiều cách khác nhau như phổ biến nhất là bình lấy m ẫu ZoBell-J-Z. Các d ụng cụ lấy mẫu nước tự động theo yêu cầu ngày nay cũng đã đ ược bán tại các c ủa hàng v ật t ư phòng thí nghiệm. - Lấy mẫu nước sinh hoạt: Nếu lấy mẫu nước từ các vòi của hệ thống cấp n ước dịch vụ, chọn những vòi cấp nước trực tiếp từ các đường ống chính, không nên lấy từ các thùng hay bồn chứa. Mở vòi nước thật lớn và để chảy ra ngoài từ 2-3 phút, trong th ời gian này nh ằm đ ề rửa sạch hệ thống vòi nước trước khi lấy mẫu, giảm vòi n ước để lấy m ẫu vào trong các bình chứa. Trong một số trường hợp cần phải làm sạch vòi trước khi lấy m ẫu, dung d ịch sodium hypochorite được cho chảy qua vòi trước khi lấy mẫu, sau khi khử trùng, phải mở n ước vòi cho chảy khoàng 2-3 phút trước khi lấy mẫu vài chai. Không lấy mẫu từ các dòng n ước chảy tràng bên ngoài vòi. Để ngăn ngừa các dòng n ước chảy tràn từ bên ngoài vòi vào trong m ẫu, có th ể dùng dụng cụ phễu lọc để ngăn ngừa các dòng nước tràn từ bên ngoài vào trong bình chứa mẫu. Cũng có thể loại bỏ sự nhiễm từ bên ngoài do các dòng n ước chảy tràn, cho n ước nóng ch ảy qua vòi khoảng hai phút, làm lạnh từ 2-3 phút sau đó lấy mẫu vào bình. Nếu lấy mẫu nước từ các giếng bơm tay, bơm nước để rửa vòi giếng kho ảng 5 phút trước khi lấy mẫu. Nếu giếng đào được trang bị máy bơm, cũng trực hi ện tương t ự như trên sau khi khời động máy. Trong trường hợp các gi ếng đào không có trang b ị máy b ơm, m ẫu đ ược 56
lấy trực tiếp từ giếng bằng cách buộc chai lấy mẫu vào một vật nặng ở bên dưới đáy. Ph ải thật cẩn thận để tránh sự nhiễm bẩn từ vật nặng hay nước trên bề mặt giếng. Trong trường hợp lấy mẫu nước uống, phải lấy mẫu ở giai đo ạn cuối c ủa quá trình sản xuất, các vị trí phân phối mẫu nước uống phải được chọn lọc để đảm bảo sự tích lũy có hệ thống trong suối mỗi tháng. Phải xem xét thật kỹ càng v ị trí c ủa h ệ th ống phân b ổ m ẫu, ngay cả tại các điểm chiết để đảm bảo chất lượng vi sinh vật thông qua toàn b ộ h ệ th ống đ ể đ ảm bào rằng không có các vị trính nhiểm vi sinh vật hay nhiểm chéo do qua trình tiên t ục c ủa h ệ thống như hiện tượng bể ống hay giảm áp lực trong qua trình kh ử trùng hay m ột nguyên nhân nào đó khác. Vị trí lấy mẫu có thể là vòi nước công c ộng, các n ơi kinh doanh ngành th ực ph ẩm, nhà hàng hay giếng nước các nhân … Nhưng đặc bi ệt quan trọng khi lấy m ẫu t ại các m ạng lưới cung cấp nước cho cộng đồng. Sự lấy mẫu, kế hoạch cũng như tầng su ất và v ị trí l ấy mẫu phải được lên chương trình có sự tham vấn của các chuyên gia vệ sinh y t ế công c ộng, và ngành cấp nước. - Lấy mẫu tại các nguồn cấp nước : Mẫu được lấy trực tiếp từ các từ sông, suối, lạch, ao, các giếng hay các hồ chứa sao cho chúng đại diện cho ngu ồn n ước cung c ấp cho con ng ười sử dụng. Mẫu không nên lấy quá gần bờ hay quá xa nơi đặt ống bơm nước, cũng không nên lấy mẫu quá sâu hay quá cạn so với vòi ống bơm. M ẫu đ ược l ấy càng g ần mi ệng ống b ơm, càng đại diện cho nguồn chất lượng của nguồn cấp nước. Kích cở mẫu: Thể tích mẫu phải đủ để đáp ứng các yêu c ầu phân tích t ại phòng thí nghiệm. Thể tích mẫu phải lấy không được nhỏ hơn 100ml. Mẫu sau khi lấy phải ghi đầy đủ và chính xác về ký hiệu, tên và các d ữ li ệu đ ược mô tả. Không tiến hành phân tích các mẫu không đầy đủ các dữ liệu yêu cầu. Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu: Nếu có thể, phân tích các chỉ tiêu vi sinh ngay sau khi l ấy m ẫu đ ể tránh nh ững s ự thay đổi không lường trước được. Nếu mẫu không thể phân tích ngay trong vòng 1 gi ờ sau khi l ấy mẫu, phải bảo quản trong các thùng lạnh trước khi vận chuyển đến các phòng thí nghi ệm. N ếu kết quả phân tích có liên quan đến pháp luật, phải sử dụng một ph ương ti ện v ận chuy ển đ ặc biệt để chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm trong khoảng thời gian 6 gi ờ v ới m ột qui trình b ảo quản đặc biệt. Nhiệt độ bảo quản nước uống, nước suối, hay nước bị ô nhiễm là dưới 10 oC và thới gian vận chuyển không quá 6 giờ. Bảo quản trong tủ lạnh tại các phòng thí nghi ệm cũng không dược quá 2 giờ. Trong điều kiện bắt buộc không thể vận chuyển mẫu về phòng thí nghi ệm nhanh hơn 6 giờ, phải xem xét đến việc trang bị các phương ti ện phân tích ngay t ại v ị trí l ấy mẫu hoặt sử dụng qui trình ủ chờ. Tuy nhiên các yêu cầu như trên khó được đáp ứng. Trên thực tế các chỉ tiêu yêu cầu thới gian vận chuyển và bào qu ản không quá 24 gi ờ. Không ch ấp nh ận các mẫu khi gởi đến phòng thí nghiệm bằng đường bưu điện và không đ ược b ảo qu ản theo các yêu cầu. Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu phải được lưu trữ đế sau khi phân tích dùng vào việc xử lý số liệu. 3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 3.1. Định nghĩa Vi sinh vật hiếu khí: là nhưng vi sinh vật phát triển để hình thành khu ẩn l ạc trong đi ều kiện có sự hiện diện của ôxy phân tử. 57
Số đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu – colony forming unit) là số khu ẩn lạc xu ất hi ện trong môi trường nụôi cấy. Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc cho phép ước đoán đ ược số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. 3. 2. Nguyên tắc Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng th ực ph ẩm bằng ph ương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng mẫu thành các n ồng đ ộ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi tr ường nuôi cấy. Các khuẩn lạc được hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem nh ư là chúng hình thành từ một tế bào đơn lẻ. Tuỳ theo các yêu cầu cụ thể trong việc phân tích, các đĩa môi trường sau khi c ấy m ẫu được ủ ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau. Theo yêu c ầu của các tiêu chu ẩn c ủa nhiều quốc gia, chỉ tiêu này được ủ ở 30oC trong khoảng thời gian khoảng 3 ngày. Tuy nhiên một số yêu cầu khác có thể ủ ở nhiệt độ 20 - 22oC trong cùng thời gian trên. Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, căn cứ vào độ pha loãng cũng như th ể tích cấy để qui về tổng số vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng m ẫu th ực ph ẩm. Ch ỉ tiêu t ổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng c ủa m ẫu về khía c ạnh vi sinh v ật, qua đó đánh giá khả năng hư hỏng, cũng như thời hạn bảo qu ản các sản phẩm th ực ph ẩm. Tổng số vi sinh vật hiếu khí còn là chỉ tiêu đánh giá mức đ ộ v ệ sinh trong quá trình ch ế bi ến, bảo quản thực phẩm, nước uống hay các sản phẩm khác. 3.3. Môi trườnng và vật liệu phân tích - Môi trừơng Plate Count Agar có pH 7.0 ± 0.2. Môi trường được phân phối vào trong các bình thuỷ tinh hay trong các ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. Bảo quản ở trong tủ lạnh từ 2–8oC. Trước khi sử dụng môi trường phải được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt. - Dung dịch pha loãng saline pepton water: gồm 8.5 gam NaCl và 1.0gam pepton. Dung d ịch được phân phối vào trong các bình chứa 0.5-1.0 lít và phân ph ối vào trong các ống nghi ệm với thể tích chính xác 9.0ml sau khi khử trùng 3.4 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích - Dùng các dụng cụ như kéo, kẹp đã được khữ trùng cân chính xác 10.0g mẫu vào trong bao PE. Tất cả các điều kiện làm việc và thao tác phải ti ến hành trong điều kiện vô trùng. Thêm vào lượng mẫu này 90 ml dung d ịch pha loãng Saline Pepton Water. Sau khi đồng nhất nhận được dung dịch m ẫu có độ pha loãng 10 -1.- Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu, thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất c ơ lý của m ẫu, nhưng không quá 2,5 phút. - Dịch mẫu ngay sau khi đồng nhất được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghi ệm ch ứa 9 ml dung d ịch pha loãng Saline Pepton Water , tránh tiếp xúc pipet với dung dịch pha loãng, đ ồng nh ất m ẫu trong ống nghiệm bằng máy lắc hoặc dùng pipet vô trùng khác hút đ ảo d ịch m ẫu lên xu ống 5 -10 l ần. Dùng pipet đó chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống thứ hai chứa 9 ml dung d ịch pha loãng. Ti ếp t ục như vậy sẽ có các dung dịch mẫu với các độ pha loãng 10 -2; 10-3; 10-4; …cho đến khi có đủ các nồng độ pha loãng cần thiết. 3.5. Cấy mẫu Chọn hai hay ba độ pha loãng liên tiếp sao cho trong 1 ml chứa 25-250 tế bào vi sinh vật đ ể c ấy. Dùng pipet vô trùng chuy ển 1 ml d ịch mẫu pha loãng đã chọn vào giữa đĩa petri vô trùng. Mỗi nồng độ cấy ít nhất vào 2 hay 3 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường Plate Count Agar đã đ ược đun ch ảy và đ ể ổn đ ịnh ở 45oC.Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chi ều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần ngay sau khi đổ môi trường. Đặt các đĩa trên m ặt phẳng ngang cho agar đông đặc. Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30.0 ± 1.0oC (hay 58
yêu cầu nhiệt độ khác) trong thời gian 72 giờ. Trong một số yêu cầu, nhiệt độ ủ đĩa và thời gian ủ có thể thay đổi.3.6. Đếm kết quả Đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đ ếm từ 25 đến 250 để tính kết quả. Số lượng tổng số vi sinh v ật trong 1 gam m ẫu đ ược tính nh ư sau: N A= (cfu/g) n1 x V1 x f1 + … + ni x Vi x fi Trong đó: A: số lượng vi sinh vật trong 1 gam mẫu N: tất cả các khuẩn kạc đếm được trên các đĩa đã chọn. ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong 1 đĩa. fi: độ pha loãng tương ứng. Ví dụ trong một trường hợp phân tích mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 Kết quả: Đĩa 1 235 26 Đĩa 2 246 21 235 + 246 + 26 A= ≅ 2.4 x 105(cfu/g) 2 x 1 x 0,001+ 1 x 1x 0.0001 Các kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí thường được biểu di ển d ưới dạng s ố mũ cùa cơ số thập phân. Trường hợp có các vi sinh vật mọc loang, tính m ỗi v ết loang là 1 khu ẩn l ạc. N ếu s ố khuẩn lạc loang chiếm hơn 1/3 đĩa thì phải ghi nhận điều này và đánh dấu kết quả nhận được. Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa >250, ví d ụ ở n ồng đ ộ 10 -5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa
Khi nâng cao nhiệt độ nuôi cấy lên 44oC có thể phân biệt Coliform phân với nhóm Coliform tổng số và nhóm không phải Coliform. Coliform đ ược đ ịnh nghĩa nh ư sau: Coliform phân là nhóm vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ ý, thuộc nhóm vi sinh v ật gram âm, không sinh bào tử và có khả năng lên men lactose và sinh hơi trong kho ảng th ời gian nuôi c ấy 24-48 gi ờ ở nhiệt độ 44oC. Nhóm Coliform phân là một phần của hệ vi sinh ruột đường ở người và các đ ộng v ật máu nóng khác, các nhóm vi sinh vật sau được li ệt vào nhóm Coliform phân: Escherichia; Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter. Nhóm vi sinh v ật này đ ược s ử d ụng nh ư y ếu t ố ch ỉ th ị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản và vận chuyển th ực phẩm, n ước u ống và môi trường. Các đặc điểm sinh hoá khác nhau để phân biệt các thành viên trong nhóm coliform phân như sau: 4.3. Nguyên tắc Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc. Sau khi ủ ở 37,0 + 1,0 oC 24 - 48 giờ, đếm số lượng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác đ ịnh l ại b ằng các ph ản ứng đ ặc trưng. Môi trường chọn lọc cho Coliform là môi trường chứa lactose, đây ngu ồn carbon duy nhất, đồng thời trong môi trường còn chứa muối mật là tác nhân ch ỉ ch ọn l ọc cho vi khu ẩn gram âm, chứa các tác nhân chỉ thị các dấu hiện điển hình khi vi sinh vật trao đổi các thành phần trong môi trường như neutral red, hay crystal violet. Khẳng định các dòng vi khuẩn cho hình dạng khuẩn lạc điển hình băng các môi trường canh chọn lọc như Brilliant green bile lactose. Để chọn lọc đối với các nhóm Coliform phân nhiệt độ nuôi c ấy là 44 oC trong 24-48 giờ. Đếm các khuẩn lạc đặc trưng cho Coliform phân, ngoài vi ệc kh ằng đ ịnh kh ả năng sinh h ơi t ừ lactose bằng các môi trường canh còn được khằng định khả năng t ạo indol trong môi tr ường canh chứa trypton ở 44oC. Để tránh các trường hợp không phát hiện được số lượng tế bào Coliform bị tổn thương hay suy yếu trong quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, khi ti ếp xúc v ới môi tr ường chọn lọc chùng sẽ bị chết hay không thể phát tri ển thành khuẩn l ạc, m ột môi tr ường không chọn lọc nhưng không chứa một nguồn carbon khác được sử dụng như Trypton Soy Agar. Môi trường này được cho vào sau khi cấy mẫu và ủ nhiệt độ 20-25 oC (nhiệt độ phòng) trong thời gian 1-2 giờ nhằm khôi phục những tế bào bị suy yếu tr ước khi cho môi tr ường ch ọn l ọc vào đĩa. Số lượng Coliform hay Coliform phân được xác định bằng số lượng khuẩn lạc đi ển hình đếm được, hệ số xác nhận và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa. 4.4. Môi trường - Tryptone Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các bình hay chai thu ỷ tinh, kh ử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút bằng nồi hấp. Bảo quản ở nhiệt độ 4-8 oC. Trước khi sử dụng, môi trường được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt. - Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thu ỷ tinh,đun ch ảy và làm nguội ở nhiệt độ 45oC trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng. Có thể sử dụng các môi trường khác như Desoxycholate agar cũng được chuẩn bị như trên. - Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) được phân ph ối vào trong các ống nghi ệm, m ỗi ống 10ml và có ống Durham đặt ngược bên trong. Khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi khử trùng phải đảm bảo không có bọt khí trong các ống Durham ngược. - E.C broth: được chuẩn bị tương tự như môi trường BGBL. - Canh trypton: được phân phối vào trong các ống nghi ệm, m ỗi ống 5ml. Môi tr ường kh ử trùng ở 121oC trong 15 phút. - Thuốc thử Kovac’s hay Ehrlish 60
4. 5. Qui trình phân tích Chuẩn bị mẫu: Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh v ật hi ếu khí. Nhưng quá trình pha loãng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng chứa kho ảng 0.5 mm, xung quanh khu ẩn l ạc có vùng tủa của muối mật. Giai đoạn xác định Trong trường hợp phân tích các mẫu thực phẩm có chứa các ngu ồn carbon khác không phải lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các ngu ồn carbon trong m ẫu đ ể lên men và có biểu hiện hình dạng khuẩn lạc tương tự Coliform, giai đoạn khẳng đ ịnh là c ần thi ết. Qui trình khẳng định được tiến hành như sau: chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ đã đếm với các hình dạng khác nhau, cấy chuyển sang các ống có chứa môi tr ường kh ẳng đ ịnh. BGBL đ ược s ử dụng khi khẳng định Coliform tổng số, E.C được sử dụng để khằng đ ịnh Coliform phân. U các ống nghiệm BGBL đã cấy ở nhiệt độ 37.0 + 1.0 oC và các ống nghiệm E.C broth ở 44oC trong thời gian 24-48 giờ. Kết quả dương tính khi vi khuẩn phát triển và sinh hơi trong môi tr ường nuôi cấy, hơi tạo ra được giữ lại trong các ống Durham ngược hay tụ lại trên bề m ặt ống nghiệm. Tỉ lệ xác nhận là tỉ số giữa khuẩn lạc cho kết quả dương tính v ới s ố khu ẩn l ạc kh ẳng định. Trong trường hợp khẳng định Coliform phân, các khuẩn lạc sinh h ơi trong môi tr ường E.C broth được thử nghiệm indol ở 44 oC. Tỉ lệ dương tính chỉ được tính cho các khuẩn lạc có khả năng sinh hơi và phản ứng indol dương tính. Báo cáo kết quả N A(coliform/coliform phân) = xR (cfu/g(ml)) n1v1f1 + … + nivifi Trong đó: N : tổng số khuẩn lạc đếm được ni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng v : Thể tích cấy vào mỗi đĩa fi : Độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R : Tỉ lệ xác nhận 61
Kết quả coliform hay coliform phân được làm tròn chẵn chục và được biểu diện d ưới dạng số mũ có cơ số thập phân. 5. ®Þnh tÝnh ESCHERICHIA COLI trong thc phm 5. 1 Ph¹m vi ¸p dơng Ph¬ng ph¸p nµy (tham chiu theo TCVN 5287, t¸i b¶n lÇn th 2, n¨m 1994) ® ỵc ¸p dơng cho tt c¶ c¸c lo¹i thc phm (®Ỉc biƯt lµ thc phm thđy s¶n ®«ng l¹nh) ®Ĩ x¸c ®Þnh s hi Ưn di Ưn cđa Escherichia coli. 5.2 §Þnh ngha Escherichia coli lµ d¹ng Coliform c ngun gc t ph©n, ph¸t triĨn ® ỵc 440C, sinh Indol, sinh axit, kh«ng sinh acetoin vµ kh«ng sư dơng citrat lµm ngun Cacbon. Escherichia coli ®ỵc ph¸t hiƯn do kh¶ n¨ng lªn men lactose vµ sinh h¬I 440C, c kt qu¶ nghiƯm ph¸p IMViC ++ --. 5.3.Nguyªn t¾c Ph¬ng ph¸p nµy dng ®Ĩ ®Þnh tÝnh vµ kt lun ph¸t hi Ưn hay kh«ng ph¸t hi Ưn E.coli trong mt khi lỵng mu x¸c ®Þnh. Cy mu vµo m«i trng t¨ng sinh (BGBL), ph©n lp trªn m«i trng ph©n lp (EMB) vµ kh¼ng ®Þnh b»ng c¸c thư nghiƯm sinh ha ph hỵp (nghiƯm ph¸p IMViC) . 5.4. DÞch pha lo·ng vµ m«i trng: - Dung dÞch Saline Pepton (SPW) - Brilliant green bile lactose broth (BGBL) - Th¹ch Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB) - Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP) - Canh Tryptone (hoỈc peptone) - Th¹ch Simmons Citrat - Thuc thư Methyl red 0.2% - Dung dÞch KOH 40% - Thuc thư -naphtol 5% - Thuc thư Kovac’s 5.5. Thit bÞ chÝnh - Tđ m 37.0 + 1.00C. - Tđ m 44.0 + 0.50C. 5.6. Quy tr×nh Chun bÞ mu: Chun bÞ mu vµ pha lo·ng t¬ng t nh ®Þnh lỵng Coliforms T¨ng sinh: Cy 1ml dÞch mu c nng ® 10-1 vµo ng nghiƯm c cha 10ml m«i trng t¨ng sinh (BGBL), đ 44.0 + 0.50C/24 gi. Ph©n lp Sau 24 gi, chn ng nghiƯm c ph¶n ng d ¬ng tÝnh (lµm ®ơc m«i trng vµ sinh h¬i), cy sang m«i trng ph©n lp (EMB), đ 37.0 + 1.00C/24 gi. Nhn d¹ng khun l¹c E.coli: Trªn m«i trng EMB: khun l¹c mµu tÝm, ¸nh kim, trßn, b ®Ịu, ®ng kÝnh kho¶ng 0.5mm. Kh¼ng ®Þnh Nh÷ng khun l¹c nghi ng ®ỵc thc hiƯn qua c¸c thư nghiƯm sinh ha (thc hi Ưn nghi Ưm ph¸p IMViC) 62
Chn Ýt nht 2 khun l¹c ®iĨn h×nh hay nghi ng m«i trng ph©n lp, cy chuyĨn sang m«i trng r¾n kh«ng chn lc (TSA) , đ 37.0 ± 1.0OC trong 18-24 gi. Thư nghiƯm sinh ha C¸c thư nghiƯm sinh ha ®ỵc dng ®Ĩ kh¼ng ®Þnh E.coli nh b¶ng díi ®©y TT Thư nghiƯm sinh ha Kt qu¶ 1 Indol + 2 Methyl red + 3 Voges Proskauer - 4 Kh¶ n¨ng sư dơng citrat - B¸o c¸o kt qu¶ Ph¸t hiƯn hay kh«ng ph¸t hiƯn E.coli trong 10g mu. 6. ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM 6.1 Định nghĩa E.coli là loài vi sinh vật thuộc nhóm Coliform phân, có hình que, gram âm, di đ ộng, có khả năng lên men và tạo acid và sinh hơi từ đường lactose ở 44 oC hay nhiệt độ thấp hơn, có khả năng sinh indol ở 44oC và 37oC, có phản ứng Voges Proskauer âm tính, không có khả năng sử dụng citrate như nguồn car bon duy nhất. Trong một số phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm, có những định nghĩa phân bi ệt số lượng E.coli khẳng định và số lượng E.coli giả định. Số lượng E.coli giả định được coi là những Coliform phân, chúng có phản ứng Indol dương tính, không ti ến hành kh ẳng đ ịnh các phản ứng khác. E.coli còn được gọi là faecal coli, chúng hiện diện thường xuyên trong ruột người và các loài động vật. Chúng phân bố rộng khắp trong tự nhiên, m ặt dù có ngu ồn g ốc t ừ phân, nh ưng sự hiện diện của chúng với một số lượng nhỏ trong thực phẩm không có nghĩa là thực phẩm đó bị nhiễm phân. Sự hiện diện của vi sinh vật trong thực phẩm, n ước u ống là d ấu hi ệu ch ỉ th ị s ự kém chất lượng về mặt vệ sinh. Khi xâm nhiễm một liều lượng lớn vào trong cơ thể ngưới và động vật, E.coli là loài phổ biến nhất gây viêm nhiễm đường tiểu, thỉnh thoảng có thể tìm thấy chúng gây l ở loét và tạo mủ, nhiễm trùng máu và có thể tìm thấy vi sinh vật này gây viêm não. Cho đến nay người các nhà khoa học đã tìm được ít nhất 4 loài gây bệnh đường ru ột cho người. Theo phân loại của Gorbach chúng được chia thành: enterobathogenic (EPEC); enterotoxigenic (ETEC), enteroinvasive (EIEC), và verotoxigenic (ETEC). Các ki ểu huy ết thanh của các dòng E.coli gây bệnh được liệt trong bảng 26.3 6.2 Nguyên tắc Cấy một thể tích xác định các nồng độ pha loãng thích hợp lên môi trường chọn lọc. Sau khi ủ ở 44oC trong khoảng thời gian 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình d ạng đặc tr ưng c ủa Coliform. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng các ph ản ưng sinh hoá. E. coli có các phản ứng sinh hoá đặc trưng như sau: indol dương tính, methyl red dương tính; Vogesproskauer âm tính và citrat âm tính. 6.3Môi trường Tryptone soya agar ( TSA ) (chuẩn bị tương tự phần coliform) Violet red bile agar ( VRB ) (chuẩn bị tương tự phần coliform) Escherichia coli broth (EC broth): được phân phối trong các nghiệm, mỗi ống chứa 10ml, cho vào bên trong ống durham ngược, hấp khử trùng bằng nồi hấp và làm ngu ội t ừ t ừ đ ể không 63
còn các bọt khí trong ống durham. Bảo quản các ống môi trường ở nhiệt đ ộ 2-8 oC cho đến khi sử dụng. Lactose tryptone lauryl sulphate broth (LST Broth ): (Chuẩn bị tương tự như EC broth). Tryptone broth (chuẩn bị tương tự phần coliform) Thuốc thử Kovac’s MR-VP broth: phân phối vào trong các ống nghiệm, m ỗi ống 5ml. Hấp kh ử trùng b ằng nồi hấp. Bảo quản 2-8oC cho đến khi sữ dụng. Simmon citrate: được chuẩn bị như là như là các môi tr ường thạch nghiêng trong các ống nghiệm. Môi trường sau khi pha chế có màu xanh lục. 6.4 Qui trình cấy mẫu Chuẩn bị và cấy mẫu:Tương tự như phần chuẩn bị mẫu cho kiểm nghiện coliform và coliform phân. Đọc kết quả: Chọn các đĩa có từ 10 - 100 khuẩn lạc. Đối với những đĩa có số khuẩn lạc nhiều thì kích thước các khuẩn lạc thường nhỏ và không rõ. Đếm những khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ sậm và có đường kính lớn hơn 0.5 mm, xung quanh có vùng tủa của muối mật. Giai đoạn xác định: Đối với mỗi dạng khuẩn lạc, chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển sang canh thang EC. U ở 44.0 ± 0.5oC trong khoảng 24 giờ, kết quả dương tính khi vi sinh vật có khả năng sinh sinh hơi trong môi trường, được biểu hi ện b ằng b ọt khí đ ược gi ữ l ại trong các ông durham hay đọng lại trên bề mặt môi trường. Chọn các ống canh thang EC có sinh hơi để c ấy chuyển sang các môi tr ường sau: canh thang Tryptone, canh thang MRVP, simmoncitrate. U các môi tr ường trên ở 44,0 ± 0.5oC trong khoảng 24 giờ. Thử phản ứng indol, methylred; vogesposkauer, citrate (xem phần th ử nghi ệm các phản ứng sinh hoá). Tỉ lệ xác nhận số lượng khuẩn lạc thử nghi ệm cho kết quả đúng là E.coli bằng tỉ số giữa số lượng khuẩn lạc xác nhận ban đầu và số lượng khuẩn lạc cho k ết quả là E.coli. Số lượng E.coli được tính như sau: N Số CFU E.coli = xR nxVxf Trong đó: N: số lượng khuẩn lạc coliform đã đếm V: thể tích mẫu cấy vào đĩa n: số lượng đĩa cấy cho một mẫu f: độ pha loãng của mẫu R: tỉ lệ xác nhận của E.coli Có thể tính số lượng E.coli giả định bằng cách tính tỉ lệ số lượng khuẩn lạc cho phản ứng indol dương tính, công thức tính tương tự như trên. Báo cáo kết quả: Kết quả E.coli được thể hiện bằng số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc E.coli trong một gram hay mililitre mẫu. Các phương pháp khác dùng trong định lượng E. coli: Ngoài phương pháp nuôi cấy theo qui trình như trên, E.coli còn được định lượng bằng phương phương pháp màng lọc nuôi cấy trên các môi trường chuyên bi ệt hay ph ương pháp MPN. Đến nay có những phương pháp màng lọc có th ể phân bi ệt đ ược s ố l ượng E.coli trong tổng số coliform. Các phương pháp miễn dịch học hay sinh học phân tử có th ể phân bi ệt các loài E.coli gây bệnh với các loài không gây bệnh khác. 64
7. ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC 7.1Định nghĩa Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, có hình cầu, gram dương, có phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng ti ết ra enzyme coagulase. Ngoài ra còn các đặc điểm như có phản ứng Dnase, phosphatease dương tính, có kh ả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất c ả các dòng S. aureus đều nhạy với novobiocine, có khả năng phát triển trong môi trường chứa đến 15% muối NaCl. Một số dòng S. aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan màu h ẹp so v ới đ ường kính c ủa khuẩn lạc. Hầu hết các vi sinh vật này đều sản sinh sắc tố vàng. Nhưng các sắc t ố này ít th ấy khi quá trình nuôi cấy còn non, sắc tố này thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi c ấy ở nhi ệt đ ộ phòng. Sắc tố được tạo ra nhiều hơn khi trong môi trường có hi ện di ện c ủa lactose hay các nguồn carbohydrate khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gảy và sử dụng chúng Hầu hết các dòng thuộc loài này có thể tổng hợp enterotoxin. Ngoài ra các loài S. intermedius, và S.hyicus cũng có thể tạo enterotoxin, nhưng hai loài này có ph ản ứng coagulase âm tính. Độc tố được sản sinh chỉ khi vi sinh vật phát tri ển trong môi tr ường có nhi ệt đ ộ trên 15oC, độc tố được sản sinh nhiều nhất khi chúng phát triển trong nhiệt độ 35-37oC. S. aureus phân bố khắp nơi, nhưng chủ yếu phân lập được từ da, màng nhầy của người và động vật máu nóng. Trong thực phẩm vi sinh vật đ ược nhi ễm vào ch ủ y ếu qua con đ ường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người. Nều có sự hi ện di ện v ới m ật đ ộ cao của sinh sinh vật này trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của quá trình chế bi ến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. 7.2 Nguyên tắc Cấy trang một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường th ạch ch ọn l ọc. Sau khi ủ, đếm số khuẩn lạc có những đặc điểm đặc trưng và không đ ặc tr ưng c ủa Staphyloccocus aureus. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase và các ph ản ứng đ ặc tr ưng khác. Kết quả được xác định bằng số lượng khuẩn lạc đã đ ếm, th ể tích c ấy, đ ộ pha loãng và hệ số xác nhận. 7.3 Môi trường Môi trường thạch máu Các thành phần cơ bản của môi trường được hoàn tan trong n ước, đun cho đến khi các thành phần hoà tan hoàn toàn. Khử trùng ở nhi ệt độ 121 oC trong 15 phút. Làm nguội môi trường đến 45-50oC trong bể điểu nhiệt. Thêm vào 5% thể tích máu cừu hay bê non d ưới 5 tháng tu ổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu được thêm chất chống đông citrat. Hoàn tan đ ều máu vào trong môi trường. Phân phối vào trong đĩa petri. Môi trường phải đ ược pha ch ế tr ước ít nh ất 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. Môi trường thạch máu không nên đ ổ quá dày để có thể nhận rỏ các vòng tan máu. Môi trưìơng thạch Baird Parker: Môi trường này có chứa lòng đỏ trứng tươi và potassium tellurite, đây là hai thành ph ần không chịu nhiệt, vì thể phải bổ sung vào môi trường sau khi kh ử trùng và làm ngu ội đ ến khoảng 60oC. Sau khi bổ sung đầy đủ các thành phần, môi trường được phân phối vào trong đĩa petri. Sau khi pha chế đĩa môi trường phải có màu vàng đục. Huyết tương thỏ (thử phản ứng đông huyết tương) 65
Huyết tương thỏ được cố định với 0.1% EDTA hay c ố định trong sodium oxalate. Phân phối vào trong các ông nghiệm nhỏ, mỗi ống 0,.3 ml. Có thể thử phản ứng này trên lam kính. 7.4 Tiến hành Xử lý và pha loãng mẫu: Cân 10,0± 0,1 gram mẫu trong túi vô trùng, thêm 90 ml dung dịch pha loãng, đồng nhất bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Chuẩn b ị dãy pha loãng thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa BP sau khi ủ có khoảng
Số khuẩn lạc đặc trưng cho kết quả ĐHT dương tính Ht = Số khuẩn lạc đặc trưng Số khuẩn lạc không đặc trưng cho kết quả dương tính Ha = Số khuẩn lạc không đặc trưng 8. PHƯƠNG PHÁP MPN ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUS Phương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong các mẫu có mật S. aureus thấp và có mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng ph ương pháp đ ếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loảng theo hệ số thập phân v ới ba đ ộ phaloãng liên ti ếp sao cho trong chuỗi pha loãng này sau khi c ấy vào các môi tr ường canh v ừa cho các k ết qu ả âm tính vừa cho kết quả dương tính, thường sử dụng các độ pha loảng 10-1; 10-2,10-3. Tuỳ theo mức độ yêu cầu của kết quả phân tích, có thể sử dung phương pháp MPN v ới hệ thống: 3 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-1 3 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-2 3 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-3 Hay hệ thống 5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-1 5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-2 5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-3 Môi trường canh được sử dụng là Mannitol Salt Broth hay Tryptose Soy Broth có 10% muối NaCl. Sau khi cấy, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48± 2 giờ. Chọn các ống dương tính, khi có các vi sinh vật phát triển làm đục canh trường để phân lập trên môi tr ường BP, các đĩa môi trường BP được ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi tr ường BP đ ể xác nhận S. aureus. Các đĩa cho kết quả S. aureus dương tính được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ thống các dãy cấy ban đầu. Tra bảng MPN đ ể có k ết qu ả đ ịnh l ượng S. aureus trong mẫu. 9. PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM 9.1 Định nghĩa Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có kh ả năng di đ ộng (tr ừ S. gallinarum và S.pullorum ), sinh acid từ glucose và mannitol nh ưng không lên men sacharose và lactose, không sinh indole và không phân gi ải ure. Hầu h ết các ch ủng đ ều sinh H 2S ( trừ S. typhi). Cho đến nay giống Salmonella có hơn được phát hiện có hơn 2300 serotypes. Các serotype này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa trên công thức kháng nguyên O (kháng nguyên somatic) và kháng nguyên lông H (flagella). Trong số các serotype trên, có m ột s ố serotype được đặc tên như Enteritidis, Typhi, Paratyphi, Typhimurium … h ầu h ết serotype không có tên được biểu diển dưới dạng công thức kháng nguyên. 9.2 Nguyên tắc Phương pháp được mô tả sau đây nhằm định tính Salmonella, kết quả được báo cáo là có hay không có Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Để đạt hiệu quả cao, quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua giai đoạn tiền tăng sinh. Điều này c ần thi ết vì 67
Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn th ương n ặng qua quá trình ch ế biến và sự tồn tại một số lượng lớn các lo ại vi khuẩn khác thu ộc h ọ Enterobateriaceae, các dòng này cạnh tranh và ức chế sự phát triển của Salmonella. Bốn giai đoạn cần tiến hành để phát hiện Salmonella: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Vi ệc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp đạc trưng cho Salmonella spp. 9.3 Dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy - Nước peptone đệm (Buffered peptone water) - Canh Rappaport-Vassiliadis soya pepton - Canh Selenite Cystein broth - Thạch Xylose lysine desoxycholate (XLD) - Thạch Brilliant green phenol red Thạch Triple sugar iron (TSI) - Canh Urea - Canh Lysine decarboxylase - Canh Ornithine decarboxylase - Canh Manitol (Phenol red broth base) - Canh Sucrose (Phenol red broth base) - Canh sorbitol (Phenol red broth base) - Canh Tryptone Thuốc thử Kovac’s Indole - Kháng huyết thanh Salmonella đa giá. 9.4 Qui trình phân tích Tiền tăng sinh Cân 25 g mẫu trong túi vô trùng, Thêm 225ml n ước peptone đệm, đ ồng nhất m ẫu. Th ời gian đồng nhất mẫu (15 hoặc 30 giây) tùy thuộc vào loại thực ph ẩm. ủ ở 37.0 oC± 1.0oC/18-24 giờ. Tăng sinh Trộn đều canh thang tiền tăng sinh trước khi chuyển 0,1ml sang 10ml canh thang tăng sinh chọn lọc Rappapport-vassliadis soya pepton. Trước khi cấy m ẫu, canh thang tăng sinh ph ải được ủ ấm đến nhiệt độ 42oC, nhiệt độ này là yếu tố quan trong cho việc tăng sinh t ối ưu. U mẫu trong bể điều nhiệt ở 42,0oC ± 0,2oC trong18-24h (có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ nữa nếu thấy cần thiết). Cấy và đọc kết quả trên đĩa Dùng khuyên cấy tròn ria dịch mẫu từ canh thang tăng sinh lên đĩa th ạch XLD và th ạch Brilliant green-phenol red để tạo những khuẩn lạc riêng r ẽ. ủ ở 37.0 oC± 1.0oC trong khoảng 18- 24 giờ. Trên thạch XLD: Khuẩn lạc điển hình trong suốt, hơi nhuốm đ ỏ, tâm đen, th ường có vùng đỏ hồng bao quanh, đặc biệt khi Salmonella phát triển mạnh. Trên thạch Brilliant green-phenol red: Khuẩn lạc đi ển hình trong, có vùng đ ỏ h ồng bao quanh. Khẳng định Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải được kiểm tra sinh hóa và kháng huyết thanh. Từ mỗi môi trường phân lập (XLD hay thạch Briliant green-phenol red) cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc (TSA). ủ ở 37.0 oC ± 1.0oC trong khoảng 18-24 giờ. - Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa: 68
Dùng các thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Salmonella. Các thử nghiệm chính gồm glucose, lactose, saccharose, H2S (trên thạch TSI hay KIA), urea, indol, VP, ornithine decarboxylase (ODC), lysine decarboxylase (LDC), mannitol, sorbitol. Thử nghiệm trên môi trường TSI hay KIA :Dùng kim cấy nhọn cấy vi sinh v ật đã đ ược làm thuần vào trong phần nghiêng và phần sâu c ủa môi tr ường. ủ ở 37.0 ± 1.0oC trong khoảng 18-24 giờ. Nắp ống nghiệm không nên vặn quá chặt để duy trì tình trạng hiếu khí và tránh lượng H2S ứ đọng quá nhiều. Sau khi nuôi cấy, Salmonella chuyển pH của môi trường sang kiềm trên phần nghiêng (màu đỏ) và sang acid ở phần sâu (màu vàng), có hay không có H 2S (xuất hiện những vệt màu đen trong môi trường). Thử nghiệm Lysin Decarboxylase: Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào môi trường canh Lysin decarboxylase. Vặn chặt nắp và nuôi ủ ở 37.0 ± 1.0oC trong khoảng thời gian 48 giờ nhưng phải kiểm tra sau 24 giờ. Salmonella làm kiềm môi trường Lisin decarboxylase, giữ nguyên màu tím của môi trường (phản ứng dương tính). Phản ứng âm tính khi môi tr ường chuyển thành màu vàng. Thử nghiện Urease: Dùng kim cấy vô trùng cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào môi trường canh urea phenol red broth. Nuôi ủ ở 37.0 ± 1.0oC trong khoảng 24 giờ kèm theo ống môi trường đối chứng không cấy vi sinh vật. Salmonella cho phản ứng âm tính với môi trường canh urea (không chuyển sang màu đỏ). Thử nghiệm trên môi trường Mannitol phenol red : Cấy vi sinh vật đã đ ược làm thu ần vào canh Mannitol phenol red. Không nên vặn chặt nắp ống nghiệm. Nuôi ủ ở 37.0 ± 1.0oC trong khoảng 48 giờ, nhưng phải kiểm tra sau 24 giờ. Salmonella làm acid hóa môi trường qua sự xuất hiện màu vàng (phản ứng dương tính). Thử nghiệm Indol: Cấy một lượng nhỏ vi sinh vật đã được làm thuần vào ống canh Tryptone. ủ ở 37.0± 1.0 oC /24 giờ. Chuyển 5 ml canh dịch sang 1 ống nghi ệm khác. Thêm vào 0.2 - 0.3 ml thuốc thử Kovac’s. Hầu hết Salmonella cho phản ứng âm tính, không có sự xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Thử nhiệm phản ứng Voges- Proskauer: Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào ống nghiệm chứa canh MR-VP và ủ ở 37.0 ± 1.0oC trong khoảng 24 giờ. Chuyển 1ml sang ống nghiệm có kích cở 13x100 mm. Thêm 0.6 ml (-napthol và 0.2 ml KOH 40%, l ắc đ ều. đ ể yên trong hai giờ. Salmonella cho phản ứng VP âm tính (không có sự xuất hiện màu đỏ hồng trong ống nghiệm). Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh Thử nghiệm kháng huyết thanh phải được tiến hành song song với m ẫu tr ắng (dung d ịch nước muối sinh lý) nhằm loại trừ khả năng ngưng kết giả. Dùng kháng huy ết thanh Salmonella polyvalent O và Salmonella polyvalent H. 9.5 Trình bày kết quả: Không có (hoặc có) Salmonella được phát hiện trong 25g mẫu. 9.6 An toàn Salmonella là vi khuẩn gây bệnh. Khi làm việc với các chủng chứng dương, kiểm nghiệm viên c ần th ận tr ọng và tuân th ủ các qui định về an toàn phòng thí nghiệm để tránh nhiễm bệnh hoặc làm lây lan mầm bệnh. 10. XÁC ĐỊNH SHIGELLA TRONG THỰC PHẨM 10.1 Định nghĩa Shigella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, Catalase dương (trừ Shigella dysenteriae), oxidase âm, lactose âm (trừ một vài chủng) và H 2S âm. Hầu như các chủng 69
Shigella không sinh hơi từ glucose. Ngoài ra hầu hết các loài thu ộc gi ống Shigella không th ể lên men và tạo acid từ Duciltol, không có enzym lisine decarboxylase. Giống Shigella gồm 4 loài như sau: Shigella dysenteriae: thuộc nhóm kháng huyết thanh A, trong đó có 10 serovar. Các dòng trong nhóm này không lên men được mannitol. Shigella flexneri thuộc nhóm kháng huyết thanh B bao gồm 6 serovar. Có th ể chia thành nhiều subserovar khác nhau, tuỳ theo sự hiện diện của các nhân tố kháng nguyên khác nhau trong nhóm này. Shigella boydii thuộc nhóm kháng huyết thanh C. Bao gồm 15 serovar. T ất c ả các dòng trong nhóm này đều lên men cà sinh acid từ mannitol. Shigella sonnei nhóm kháng huyết thanh D chỉ có một serovar khác biệt. Nhóm này lên men được mannitol. Shigella là vi sinh vật gây nên bệnh Shigellosis, đây là m ột bệnh nguy hi ểm có th ể lan truyền rất nhanh trong cộng đồng. Sự lan truyền phổ biết nhất là từ người sang ngưới. Nh ững trẻ em có điều kiện vệ sinh cá nhân kém, sống trong đi ều ki ện thi ếu th ốn ph ương ti ện v ệ sinh là điều kiện để lan tuyển dịch bệnh này. Shigella cũng được lan truyền qua đường thực phẩm và nước uống. Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm thực chủ yếu là từ nguyên liệu, từ nước, hay từ công nhân chế biến. Các loại thực phẩm thường xuyên phân lập đ ược Shigella là các món salad, thịt băm thủy sản … Liều lượng gây ngộ độ thực phẩn do Shigella rất thấp, có thể 10 tếbào/g sản phẩm củng có nguy cơ gây ngộ độc. Vì vậy việc kiểm soát Shigella ytrong thực phẩm phải rất nghiêm ngặt, đòi hỏi phương pháp kiểm nghiệm phải rất nhạy, các qui trình th ực hi ện ph ải kiểm soát chặt chẻ. 10.2 Nguyên tắc Một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường lỏng không ch ọn l ọc, sau đó được chuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc, dịch khuẩn sau khi tăng sinh ch ọn l ọc đ ược cấy phân lập trên ít nhất 2 đĩa môi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khu ẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh. 10. 3. Thuốc thử và môi trường 3 Môi trường chọn lọc và không chọn lọc: - Canh Tryotose soya - Canh Gram negative Môi trường chọn lọc: - Thạch MacConkey - Thạch Xylose lysine desoxycholate - Thạch Hektoen enteric Môi trường và thuốc thử sinh hoá: - Thuốc thử Oxidase - Thuốc thử catalase - Thạch Triple sugar iron - Môi trường thử nghiệm tính di động - Mannitol phenol red broth - Duciltol phenol red broth - Lisine decarboxylase broth Kháng huyết thanh: bao gồm các loại huyết thanh như sau: polyvalent A; B; C; D 10.4 Qui trình phân tích tiến hành 70
Tiền tăng sinh Lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225ml canh Tryptone soya. Sau khi đ ồng nh ất mẫu, đo pH và nếu cần chỉnh về pH 7.0 ± 0,2. Buộc chặt miệng túi và ủ ở 37.0 oC trong khoảng thời gian 16 - 20 giờ. Có thể cho m ẫu vào trong các bình tam giác, sau khi ch ỉnh pH ủ các bình này trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ và thời gian như trên. Tăng sinh chọn lọc Chuyển 0,1ml dịch tiền tăng sinh sang 10ml canh thang tăng sinh GN. ủ ở 37.0 oC trong thời gian 16 - 20 giờ. Phân lập: Dùng khuyên cấy cấy từ canh thang tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa ch ọn l ọc. Vi khuẩn Shigella là vi sinh vật rất nhạy cảm với điều kiện môi trường nuôi c ấy vì thế đ ế có th ể phát hiện được Shigella với hiệu suất cao nhất, nên sử dụng ít nhất hai lo ại môi tr ường phân lập khác nhau. Có các loại môi trường phân lập có c ường độ ch ọn l ọc khác nhau đ ược s ử d ụng cho Shigella như: Tergitol – 7 agar, XLD (Xylose lisine desoxycholate agar), Hektoen Enteric agar và MAC (Macconkey agar). Sau khi cấy, ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 37.0 oC trong thới gian 24-48 giờ. Biểu hiện của Shigella trên các môi trường phân lập như sau: Trên môi trường Tergitol – 7 agar: môi trường sau khi pha chế có màu xanh hơi vàng nhẹ, có màu đục sữa. Khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này có màu xanh nhạt. Trên môi trường MacConkey agar: Khuẩn lạc có màu nâu đỏ, trong suốt. Trên môi trường XLD: Khuẫn lạc Shigella có màu đỏ, trong suốt Trên môi trường Dexoxycholate citrate agar, môi trường có màu đỏ cam, hơi đục. Khuẩn lạc Shigella trên môi trường này có màu đỏ nhạt. - Trên Hektoen entric agar: Khuẩn lạc có màu xanh nhạt, trong xuốt. 10.5 Khẳng định bằng trắc nghiệm sinh hóa Từ các khuẩn lạc nghi ngở trên môi trường phân lập, chọn ít nhất 5 khu ẩn l ạc c ấy lên môi trường không chọn lọc (như TSA), ủ ở nhi ệt độ 37 oC trong thới gian 20-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh. Thử nghiệm sàn lọc Các dòng được nghi ngờ là Shigella được cấy vào môi trường TSI, ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Shigella cho phản ứng kiềm trên mặt nghiên và acid ở phần sâu. Không sinh h ơi và không có H2S được tạo thành trong môi trường. Các dòng có phản ứng như trên đ ược th ử nghi ệm đ ể khẳng định Shigella Thử nghiệm khẳng định Phản ứng đạc trưng của các dòng Shigella được thể hiện trong bảng sau: TT Thử nghiệm sinh hoá Phản ứng 1 Simmon citrate - 2 Arginine decarboxylase - 3 Lisine decarboxylase - 4 Urease - 5 Malonate - 6 MR + 7 VP - 8 Salicine - 9 Xylose - 71
11 Cellobiose - 12 Adonitol - 13 Ducitol - 14 Inositol - Bảng 1: Các phản ứng sinh hoá đạc trưng của Shigella spp Các vi sinh vật có các phản ứng sinh hoá đạc trưng như trên được kh ẳng đ ịnh là Shigella spp. Để xác định loài Shigella nhiễm vào trong mẫu, các phản ứng sinh hoá đạc trưng của từng loài như bảng sau: S. dysenteriae S. flexneri S. boydii S. sonnei Sinh gas từ - - -1 -1 Glucose Beta Galactose +/-1 - +/- + Ornithin - - -1 + decarboxylase Indol +/-2 +/-2 +/- - Acid from Dulcitol -4 -4 - - Lactose - -1 -1 +3 Mannitol - + + + Raffinose - +/- - +3 Saccharose - - - +3 Xylose - - +/- - 1: Các dòng S.dysenteriae 1 và S.sonnei phản ứng dương tính 2: S.dysenteriae 1; S. flexneri 6 luôn cho phản ứng âm tính; S.dysenteriae 2 có phản ứng dương tính 3: Phản ưng dương tính chỉ biểu hiện khi thời gian nuôi cấy quá 24 giờ. 4: S.dysenteriae và S.flexneri 6 có thể cho phản ứng dương tính. Phản ứng sinh hoá phân biệt các loài Shigella Xác định bằng thử nghiệm huyết thanh kháng : Thực hiện thử nghiệm kháng huyết thanh bằng huyết thanh đa giá A, B,C,D từ các lứa cấy trên môI tr ường th ạch không ch ọn l ọc. Phải tiến hành các đối chứng ấm tính trên nước muối sinh lý đ ể tránh hi ện t ượng ng ưng k ết giả có thể diễn ra. Trong một số trường hợp Shigella tạo thành kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên K) có thể làm che mất kháng nguyên O và làm cho phản ứng ngưng k ết không di ễn ra. Vì th ế khi không có biểu hiện ngưng kết, đun sôi dịch vi khuẩn trong kho ảng 30 phút đ ể lo ại b ỏ kháng nguyên bề mặt. Sau đó tiến hành thử nghiệm ngưng kết trở lại. 10.5 Báo cáo kết quả Phát hiện hay không phát hiện Shigella trong 25g mẫu. 10.6 Biện pháp an toàn Shigella là vi khuẩn gây bệnh rất nguy hiểm, có thể biểu hiện bệnh khi m ật đ ộ xâm nhiễm rất thấp. Vì thế khi làm việc với các chủng đối chứng dương tính người phân tích c ần phải thận trọng, các môi trường, mẫu vật sau khi nuôi c ấy phải được hấp ti ệt trùng tr ước khi rửa hay thải vào môi trường. 11. Vibrio cholerae vµ Vibrio parahaemolyticus 72