Quy trình sản xuất enzym amilase

Chia sẻ: Trịnh Thành Công | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

345
lượt xem 82
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế khá lớn. Ngoài số enzyme đã được sử dụng rộng rãi và lâu đời( amylaza, prôteeaza…), còn có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Quy trình sản xuất enzym amilase

Tiểu luận Quy trình sản xuất Enzyme Amilase
LỌC HÓA DẦU A-K55 Bài thảo luận công nghệ sinh học đại cương: QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE Nhóm: Trịnh Thành Công 1021010050 1. Nguyễn Văn Tùng 1021010405 2. Nguyễn Trọng Hoàng 1021010142 3. Lê Tuấn Thành 1021010309 4. Đỗ Tất Quang 1021010275 5. Mục lục: Phần 1: Giới Thiệu  Enzyme amylase là gì?  Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme α- amylase Phần 2:Quy trình sản xuất enzym α amylase  Môi trường sản xuất enzyme amylase  Nguyên liệu sản xuất enzyme amylase  Quy trình sản xuất nấm mốc giống  Phương pháp sản xuất  Quy trình lên men công nghiệp tạo enzyme amylase Phần 3: Ứng dụng Phần 4:Kết luận Phần 1: Giới thiệu Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế khá lớn. Ngoài số enzyme đã được sử dụng rộng rãi và lâu đời( amylaza, prôteeaza…), còn có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế.Trước đây, các enzyme dung nghiên cứu hoặc áp dụng trong sản xuất, thường thu nhận từ động vật, thực vật. Nhưng vài chục năm gần đây, người ta đã chú ý đến một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền, đó là nguồn enzyme từ vi sinh vật. Thực ra đây là một nguồn enzyme rất quen thuộc đối với một số nước phương đông( Trung Quốc, Nhật Bản….). Page 1 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 Để mở rộng việc sử dụng các enzyme vào thực tế ở nước ta và đáp ứng yêu cầu của một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu tách và chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho việc tổng hợp mạnh mẽ enzyme của chúng, thu nhận chế phẩm enzyme. Như chúng ta đã biết, tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô, sắn, còn riêng nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thủy phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn giản nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid…. Quá trình thủy phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hóa và gian đoạn đường hóa. Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất ta áp dụng hai cách: Thủy phân tinh bột bằng acid và bằng enzyme. Để thủy phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thủy phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzyme để thủy phân tinh bột là một kết quả tất yêu của lịch sử phát triển. Enzyme amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzyme amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật, vi sinh vật. Enzyme amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở quy mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chụi nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được chiết tách từ vi sinh vật, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng. Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thủy phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch, hạt bắp nản mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắt, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta. Do đó, đây là một lợi thế và hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển. Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm mềm vải…. I.Tổng quan về enzyme amylase Enzyme amylase là gì? Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: RR’ + H-OH RH + R’OH Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Page 2 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 *Endoamylase( enzyme nội bào) *Exoamylase( enzyme ngoại bào)  Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase( hay α-dextrin 6 – glucosidase): khử gián tiếp là Transglucosylase( hay oligo-1,6- glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân liên kết bên trong của mỗi polysaccharide. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen  Tinh bột là nhóm carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì…, trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin (Meyer, 1940). Các loại tinh bột đều có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lương quan trọng. -Amylase có trọng lượng phân tử từ 50.000 – 160.000. Da, được cấu tạo từ 200-1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α – 1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh. -Amylopectin có trọng lượng phân tử từ 400.000 đến hang chục triệu Da, được cấu tạo từ 600 – 6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α – 1,4- glucoside và α – 1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch bị đun nóng( 60-85ºC) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột. Dưới tác dụng của enzyme amylase tinh bột sẽ bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân căt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và Đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose. -Carbohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng trong cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose. Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột. Glucose là một loại carbohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ  thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, VSV, glucogen được cấu tạo từ glucose nối với nhau bởi liên kết α – 1,4-glucoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α – 1,6-glucoside. Glycogen có mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 triệu – 3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan. I.Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme α- amylase Page 3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 I.1.Đặc tính của enzyme α- amylase α- amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α- amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α- amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng khối lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: α- amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. • Trọng lượng phân tử của α- amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da( Knir 1956; • Fisher, Stein, 1960) Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. • Protein của các α- amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline • Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH= 4,2-5,7( Bernfeld P, 1951) • α- amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α- amylase đều có chứa 1-30 • nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt độ của enzyme( Modolova, 1965). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α- amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α- amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+ . Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại khác như: Li+, Na+ , Cr³+, Mn²+, Zn²+, Co²+, Sn²+ không có ảnh hưởng mấy đến α- amylase. Không giống các α- amylase khác, amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol enzyme (Akabori et amiloza, 1965). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme. Thành phần amino ( g/100g protein Thành phần amino ( g/100g protein acid acid alamine 6,8 Isoleucine 5,2 glycine 6,6 prolin 4,2 valine 6,9 phenylalanine 4,2 leucine 8,3 tyrosine 9,5 trytophan 4,0 trionin 10,7 xetrin 6,5 cystein 1,6 glutamic acid 6,9 amide amide Bảng: Thành phần amino acid của α- amylase ở nấm mốc Aspergillus α- amylase của nấm mốc chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase và glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 (Hanrahan, Caldwell, 1953) Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau: G5→G4 + G1; G6 → G2 + G4 hay 2G3 (chính) hoặc G5 + G1 (ít) Page 4 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 α- amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α- 1,6 glucoside của amylopectin nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzyme α- amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotrioxe. Khi dùng nồng độ α- amylase VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α- amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87%. Điều kiện hoạt động của α- amylase từ các nguồn khác thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α- amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vung pH từ 4,5-5,8 ). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6- 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác nhau. α- amylase của Asp.oryzae bền vững đối với acid hơn là α- amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH = 3,6 và 0°C, α- amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α- amylase vi khuẩn bị bất hoại đến 50%, trong khi đó hoạt lực α- amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α- amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5,0 – 5,5; α- amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5 – 2,8. Ở 0ºC và pH=2,5 nó chỉ bị bất hoại hoàn toàn sau 1 giờ. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α- amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α- amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50ºC và bị vô hoạt ở 70ºC (Kozmina, 1991 ). Trong dung dịch đệm pH = 4,7, α- amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40ºC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 – 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 –85%. Ở 50ºC trong 2 giờ α- amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự). I.2. Cơ chế tác dụng của enzyme α- amylase α- amylase ( 1,4 α- glucan – glucanhydrolase ). α- amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm rất giống nhau. α- amylase có khả năng phân tách các liên kết α – 1,4glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả. α- amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm.  Quá trình thủy phân tinh bột bởi α- amylase là quá trình đa giai đoạn: Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất nị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylase và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh) Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra – trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α- amylase cho tới disaccharide và Page 5 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 monosaccharide gồm 6-7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α- amylase luôn phân cắt amylase thành từng đoạn 6 – 7 gốc glucopiranose 1 ). Sau đó, các poliglucose này bị phân tách tiếp tạo nên các mạch polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và moltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylase chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α- amylase lên amylosepectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α- 1,6 – glycoside ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α- amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α- amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α- amylase là tính chất đặc chưng cảu nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hay amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:  Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột -------------------------> dextrin phân tử lượng thấp  Giai đoạn đường hóa: Dextrin ----------> tetre và trimaltose -----------> di & monosaccgaride Amylase ---------> oligosaccharide --------------> poliglucose Maltose ----------> maltotrioso -------------------> maltotetrose Phần 2.Quy trình sản xuất enzym α amilase I.Môi trường sản xuất enzyme amylase I.1.Môi trường lỏng Ở môi trường lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng ( môi trường ) và pha khí ( không khí ). Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường. Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV. Hình 1: Lên men trong môi trường lỏng ở quy mô phòng thí nghiệm Nuôi cấy VSV thu nhận enzyme trên môi trường lỏng theo phương pháp cấy bề mặt thường được tiến hành trong các khay có chiều cao khoảng 12-15 cm, chiều rộng và chiều dài được thiết kế tùy theo kích thước phòng nuôi sao cho thuận tiện Page 6 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 trong thao tác. Ở đây người ta quan tâm nhiều đến chiều cao môi trường lỏng. Nếu chiều cao môi trường lỏng quá lớn, VSV sẽ không có khả năng đồng hóa hết các chất dinh dưỡng ở phía đáy khay nuôi cấy. Nếu chiều cao môi trường nhỏ, sẽ thiếu thành phần chất dinh dưỡng, hiệu suất thu nhận enzyme sẽ không cao. Trong nghiều nhà máy, người ta thường tạo môi trường trong kháy nuôi cấy có chiều cao môi trường từ 5-7 cm là hợp lý. I.2.Môi trường đặc(bán rắn) Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng môi trường đặc . Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV. VSV không chỉ phá triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại , không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển. Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý. Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường. Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn(môi trường đặc ) này rất thích hợp cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae. A B H ì n h 2 : L ê n m e n t r ê n m ô i trường rắn. A: lên men kỵ khí t r o ng n ồ i b ằ n g đ ấ t n u n g, B : lên men hiếu khí II. Nguyên liệu sản xuất enzyme amylase . II.1 Nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy. Page 7 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốckhác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả.Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt kháckhi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảokhối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyênliệu. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề sâu (Sử dụng môi trường hoàn toàn lỏng): Nguyên liệu nuôi cấy phổ biến là dịch đường như glucose, fructose, sacarose, pepton,… nồng độ thích hợp khoảng 10 - 15%. II.2 Chủng vi sinh vật dùng trong sản xuất amylase. •Chủng nấm mốc Asp. Oryzae, Asp.niger… -Enzyme chiết xuất từ nấm mốc: dễ dàng loại bỏ các khuân ty của nấmtrong môi ̉ trường sản xuất enzyme. -Enzyme amylase thô nằm trong dung dịch lọc. •Các chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus … -Enzyme chiết xuất từ vi khuẩn: cần tốc độ cao, làm lạnh bằng máy li tâmcho việc này. -Đổ môi trường nuôi cấy vi khuẩn vào ống máy li tâm, và quay trong 20 phút ở 5.000 vòng/phút. Phần gạn nôi trên măt, là chiết xuất enzyme thô ̉ ̣ Bảng 1: Tính chất của amylase thu nhận từ các nguồn khác nhau.(Nguyễn Tiến Thắng, Gíao trình công nghệ enzyme 2008) Nguồn thu nhận Giới hạn pH(pH Khối luợng phântử Nhiệt độ tốiưu tối ưu) (Dalton) (oC) B. subtilis 4,5 – 6,5 48.000 60 B. licheniformis 5,0 – 9,0 22.500 90 B.stearothermophilus 4,0 – 5,2(3,0) 96.000 80 B. cereus 6,0 – 7,0 90.000 50 – 55 Pseudomonas 6,7 – 7,0 62.000 45 Tụy 6,0 – 7,0 45.000 Malt 4,5 – 9,5 (5,5) 52.000 70 Aspergilus oryzae 5,0 51.000 50 – 60 III..Quy trình sản xuất nấm mốc giống III.1.Nguyên liệu cho sản xuất mốc giống Gạo nếp:Nước 14% ,Glucid 79,4%, Lipid 1,5% và protein 8,2% trong đó Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein(oryzaine)và glubuline ngoài ra còn một ít lẫn Cozine và Prolamin. Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose và hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.Ngoài ra còn chứa một số vitamin như B1,B2,B6,PP và E. Page 8 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 Gạo tẻ:Nước 13,84%; Glucid 77,55%; Protein 7,35%; Lipid 0,52%; cellulose 0,18% và muối khoáng :0,54%. Bột Mì:Nước 11,6%; Glucid 72%; Lipid 4,8%,Protein 9%; cellulose 1,5% và muối khoáng 1,2%. Bắp mảnh:Nước 11,4%; Glucid 78,9%; Lipid0,8%; Protein8,5%,cellulose 0,4% và muối khoáng 0,4%. III.2.Chuẩn bị mốc giống Nuôi cấy giồng bao gồm: -Trong ống thạch nghiêng hay giữ giống trong ống nghiệm -Trong bình tam giác (nhân giống nhỏ) -Trên sàng, khay (nhân giống lớn) III.2.1.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng Sau khi phân lập thành công trên môi trường chọn lọc từ đĩa petri cấy chuyển những mốc sợi sang (hay lấy nấm mốc từ ống giống) ống thạch khác.Yêu cầu ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết, không được lẫn lộn bất kỳ một loài VSV nào khác.Môi trường thạch nghiêng phải đảm bảo đầy đủ dinh dưỡng. III.2.2.Nuôi cấy giống trong bình tam giác Cách làm môi trường trong bình tam giác: -Môi trường gạo:gạo tẻ loại tốt, nấu cơm như nấu bình thường, hạt cơm chín đều không qúa nhão và không qúa khô.Độ ẩm khoảng 45% để nguội bớp rời thành từng hạt cho vào bình tam giác thành lớp dày khoảng 1cm. Đậy nút bình tam giác bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng ở P = 1atm trong vòng 30-45 phút. -Môi trường ngô mảnh: Ngô mảnh có kích thước khoảng 0,2-0,5 mm cho nước vào theo tỷ lệ 90% trọng lượng so với ngô, trộn đều trong khay để 1-2 giờ cho ngấm nước đều. Bóp tơi cho vào bình tam giác khác thành lớp dày 1cm. Đậy nút bình bằng giấy chống ẩm. Hấp thanh trùng đồng thời làm chín ở P = 1atm, 1200C, trong thời gian 60 phút, lấy ra để nguội lắc cho khỏi vón cục. -Môi trường cám: Chọn cám tốt, mới nhưng loại thô không cần mịn hạt, sau đó làm tương tự như đối với ngô mảnh. Thường sử dụng các bình tam giác dung tích 0,3-0,5 lít hay 1 lít có cổ rộng. Sau khi chuẩn bị môi ttrường trong bình thuỷ tinh ta tiến hành nuôi cấy nấm mốc. Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng cho vào các ống nghiệm. Sau đó, đổ nước vô trùng cho bào tử hoà vào trong nước đồng thời cấy chuyển chúng sang bình tam giác. Trung bình cứ một ống nghiệm có thể cấy chuyển sang 2-3 bình tam giác có dung tích 1 lít, lắc cho giống phân bố đều trong môi trường và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện thích ứng. Thường nuôi khoảng 5-6 ngày là được. Yêu cầu cơ bản trong giai đoạn này là làm sao tạo được nhiều bào tử mạnh khoẻ. Trường hợp nào thấy bình bị nhiễm thì phải loại bỏ ngay. III.2.3.Nuôi cấy mốc trên khay Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay: Nguyên liệu thường dùng là ngô mảnh có kích thước 0,2-0,5mm. Trộn với nước theo tỷ lệ 80-90% trọng lượng so với ngô nếu hấp dưới áp lực cao. Trộn xong để khoảng 3-4 giờ cho ngô ngấm nước Page 9 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 đều rồi hấp chín. Thời gian hấp khoảng 3-4 giờ, dài hơn so với thời gian hấp cám hay gạo. Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, không được quá bết hoặc quá khô. Độ ẩm còn lại 45-50% là vừa. Cách gieo cấy và nuôi mốc trên khay: Nguyên liệu dỡ ra, làm nguội nhanh. Nếu ít có thể bóp bằng tay cho tơi ra, nếu nhiều cho qua máy đánh tơi và dùng quạt thổi. Sau khi làm nguội đến 26-280C thì trộn nước giống từ bình tam giác vào với tỷ lệ 0,5-1% hoặc với tỷ lệ cao hơn. Sau khi trộn giống, ủ môi trường vào khay thành luống cao (0,3m). Đặt ở nhiệt độ 30-320C, độ ẩm 85-100%. Thời gian ủ 6-8 giờ, nhiệt độ khối môi trường lên tới 34-360C và bào tử đã nảy mầm gần hết nhưng chưa thành sợi dài. Lúc này cần rải môi trường thành lớp mỏng 2-3cm cần giữ cho nhiệt độ môi trường không vượt quá 360C. Lượng nhiệt tỏa ra nhiều nhất ở khoảng 10-14 giờ sau khi trộn giống. Sau khi nuôi 34-36 giờ, nhiệt độ khối môi trường bắt đầu giảm, cần phải điều chỉnh nhiệt độ lên 34-350C, để duy trì sự hình thành bào tử của nấm mốc. Thời gian nuôi mốc giống trên khay thường vào khoảng 60 giờ. Nếu thấy hình thành bào tử chậm thì có thể kéo dài đến 70-72 giờ. Mốc giống khi lấy ra thường có độ ẩm 32-35 % có thể dùng ngay làm giống cho công đoạn sản xuất. Nếu không dùng ngay thì phải đem sấy khô đến độ ẩm 8%, giữ dùng dần hoặc là cung cấp giống cho các nơi sản xuất. Nhiệt độ phòng sấy không được quá 400C. Các bao mốc giống cần được bảo quản nơi thoáng, mát ( có thể bảo quản lạnh 4-50C ) tránh ánh nắng. Thời gian bảo quản tùy điều kiện có thể, từ 1-2 tháng hoặc lâu hơn. IV.Phương pháp sản xuất IV.1. Theo phương pháp nuôi cấy bề mặt IV.1.1 Quy trình công nghệ : Vi sinh vật Hấp thanh trùng: dưới áp suất hơi 1-1,5 atm trong thời gian 45-60 phút. Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vàomôi trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ. Khi cấy vào môi trường Page 10 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 dinhdưỡng, bào tử sẽ phát triển thành tế bào nấm mốc và tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn. Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay vớichiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy ở 28-32oC, không cần điều chỉnh pH. Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Quá trình pháttriển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt nàytrải qua các giai đoạn sau: •Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôicấy. - Nhiệt độ tăng rất chậm.oSợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. -Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi.oKhối môi trường còn rời rạc.oEnzyme mới bắt đầu đươc hình thành.•Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ.oToàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm có màu trắng xámoMôi trường được kết lại khá chặt.oĐộ ẩm môi trường giảm dần. -Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC.oCác chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấmsợi. -Enzyme amylase được tổng hợp mạnh. -Lượng O2trong không khí giảm và CO2sẽ tăng dần •Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. -Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽchậm lại. -Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môitrường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. IV.1.2 Thu nhận sản phẩm Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau: •Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi nghiền nhỏ để phá vỡ thành tế bào và làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. •Sử dụng những chất trợ nghiền (cát thạch anh và bột thủy tinh) khi nghiền.Trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khôở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV.Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzymα-amylase. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước,khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm giasúc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồimới cho gia súc ăn).Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vìtrong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy.Dùng cồn và sunfat amon để kết tủa enzyme.Trong khi tiến hành kết tủa,người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủađể tránh làm mất hoạt tính enzyme. •Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzyme thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ 4-70C. Theo thời gian, cácenzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọcthu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm > 70%W) IV.1.3 Ưu và nhược điểm Ưu điểm : Page 11 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 • Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện. Quy trình công nghệ thường không phức tạp. •Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiềuso với nuôi cấy chìm. •Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinhvật, enzyme và nước). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. • Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp.•Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý. Môitrường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bịnhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khuvực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. Nhược điểm : •Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. •Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng hoặc môitrường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích. IV.2. Theo phương pháp nuôi cấy bề sâu: IV.2.1 Quy trình công nghệ Vi sinh vật Hấp khử trùng ở nhiệt độ 118 – 1250C, thời gian 40 – 60 phút, để nguội dến nhiệtđộ bình thường và tiếp giống vi sinh vật vào môi trường, tỷ lệ giống đưa vào là 2 – 2,5 %. Sau đó quá trình nuôi cấy được thực hiện theo 2 phương pháp: nuôi cấy theochu kỳ hay nuôi cấy liên tục. • Nuôi cấy theo chu kỳ là phương pháp nuôi cấy trong 1 thiết bị lên men. Sau1 chu kỳ nuôi từ 2 – 4 ngày ở 28 – 320C người ta thu nhận toàn bộ dịch nuôicấy như là 1 loại chế phẩm enzyme thô. Phương pháp này không đòi hỏi kỹthuật cao nhưng năng suất thấp. • Nuôi cấy liên tục là để khắc phục tình trạng trên. Quá trình nuôi cấy liên tụccó thể nuôi cấy trong 1 thiết bị, cũng có thể thực hiện trong nhiều thiết bị.Phương pháp này có lợi là nếu chất lượng sản phẩm ra cuối cùng ra ta thunhận đuợc chưa đạt yêu cầu đặt ra ta có thể khắc phục bằng hai cách. -Cách thứ nhất: làm cho thời gian lưu của dung dịch và tế bào vi sinhvật trong thiết bị lâu hơn. -Cách thứ hai là: ta tiến hành hoàn lưu dịch lên men hòa chung vớidòng môi trường để tái lên men. IV.2.2 Thu nhận sản phẩm Page 12 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 Dung dịch sau khi nuôi cấy theo phương pháp bề sâu được tách khỏi sinh khối vàcác thành phần không hòa tan bằng phương pháp ly tâm. Dịch thu thường chứa 2 – 3% chất khô hòa tan. Hàm lượng chất này rất nhỏ, do đó ta cần phải cô đặc chúngcho đến khi khối lượng dịch giảm đi 5 – 10 lần ở điều kiện chân không. IV.2.3 Ưu và nhược điểm Ưu điểm: •Phương pháp nuôi cấy hiện đại dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao •Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổnghợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiệnnuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo vô trùng. Nhược điểm: •Đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanhtrùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quátrình nuôi cấy. •Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt,toàn bộ gây tổn thương lớn và thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. V.Quy trình lên men công nghiệp tạo enzyme amylase V.1. Nguyên liệu Nguồn tinh bột: Ở nước ta nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vô cùng đa dạng và phong phú.Ví dụ tinh bột từ gạo ( gạo tẻ, gạo nếp), ngô (bắp), sắn, …Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở quy mô công nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm. Do vậy, nguồn nguyên liệu cần được quan tâm và chú trọng về mức độ rẻ tiền và dể kiếm. Đây là một lợi thế rất quan trọng cho nhà sản xuất và cho cả người tiêu dùng để có giá thành thấp và được sản xuất đại trà.Sau đây, giới thiệu một số nguồn nguyên liệu dễ tìm: +Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo: Thành phần dinh dưỡng Đơn vị tính Hàm lượng/100g Protein g 6 Tinh bột g 82 Lipid (tổng số) g 0,8 Cellulse g 0,6 Nước g 10,2 Năng lượng kcal 361 (Viện Nghiên cứu dinh dưỡng thuộc Đại học Mahidol, Thái Lan,1999) - Protein của gạo chiếm khoảng 8-9%, chủ yếu là glutelin và glubuline. Ngoài ra còn cólẫn ít : cozine và prolamin. Lượng protein thoái hoá và biến tính dần trong quá trình bảo quản. - Glucid thì chủ yếu là tinh bột, đường, cellulose hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin, có chứa một ít chất khoáng như: P,K,Mg,…Ngoài ra còn có một số Vitamin:B1, B2, B6, PP, H, C, E và carotenoid. +Thành phần dinh dưỡng của ngô: (Cortez và Wild-Altamirano,1972) Thành phần dinh dưỡng / Bắp nếp Bắp ngọt 100g Page 13 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 Protein 9,1 12,9 Tinh bột 72,8 69,3 Lipid(tổng số) 2,2 3,9 Cellulose 1,8 2,9 Nước 11,2 9,5 Khoáng 2,9 1,5 Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu. Trong nhiều trường hợp, để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzym đươc tạo ra từ VSV. Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường. Chính vì thế ta thấy rằng nấm mốc Asp. oryzae không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường mà còn phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt môi trường. Hay nói cách khác, chủng nấm mốc Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai pha rắn và pha khí của môi trường.Trong trường hợp này, nó có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men bề mặt. +Thành phần dinh dưỡng của sắn(khoai mì): Sắn là loại củ chứa nhiều tinh bột, rất thích hợp là nguồn cơ chất cảm ứng cho quá trình tổng hợp enzym amylase ở nấm mốc Asp.oryzae. Củ sắn gồm ba phần chính: vỏ, thịt củ và lõi. Ngoài ra còn có cuống và rễ củ. -Vỏ gồm hai phần: Vỏ gỗ ở bên ngoài, cấu tạo chủ yếu là cellulose, thường chiếm khoảng 1,5-2% khối lượng củ, vỏ cùi cũng cấu tạo từ cellulose nhưng trong vỏ cùi còn có mủ sắn là các polyphenol, chiếm tới 85-90% polyphenol của củ sắn . -Thịt chứa nhiều tinh bột, ít protein và một lượng dầu, lượng polyphenol ở đây có khoảng 10-15%, nhưng các polyphenol gây trở ngại khi chế biến, đặt biệt là để sắn chảy mủ sẽ làm cho bột sắn biến màu, thay đổi mùi vị khó ăn trực tiếp khi luộc, khó thoát nước khi sấy hay phơi khô sắn lát hay săn bột. -Thành phần hoá học tươi của sắn: Tinh bột:20-34%; protein: 0,8-1,2%; chất béo: 0,3-0,4%; cellulose: 1-3,1%; chất tro: 0.54%; polyphenol: 0,1-0,3%; và nước: 60- 74,2% . V.2. Quy trình công nghệ sản xuất enzyme amylase trong công nghiệp Thuyết minh quy trình: Nguyên liệu: Trong phương pháp lên men bề mặt, cấu trúc chính là cám mì, cám gạo. Hai loại này là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi nấm không cần bổ xung thêm chất khác nữa. Tuy nhiên do là phế liệu của công nghệ xay xát, nhưng làm cũng tương đối đắt tiền. Hơn nữa trong Page 14 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 quá trình nuôi nấm, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay thế hoặc pha trộn thêm một số cấu tử rẻ tiền hơn. Mặt khác cấu tử bổ sung vào (trấu, mạt cưa,…) để làm tăng độ xốp giúp cho hệ sợi nấm phát triển tốt hơn tận dụng tối đa nguồn cơ chất để sinh ra hoạt lực enzyme cao nhất. Đặc biệt chú ý, cám không được chứa tinh bột dưới 20-30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%. Hấp thanh trùng: Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai, cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1,5 atm trong thời gian 45-60 phút. Để thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quả, cũng như tạo điều kiện cho nấm sợi phát triển, trước khi thanh trùng, người ta thường dùng HCl hay H2SO4 để điều chỉnh pH môi trường.Sau khi thanh trùng môi trường được làm nguội người ta bắt đầu nuôi cấy để thu nhận enzyme. Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ, giống mốc có thể nuôi cấy riêng ở phòng thí nghiệm hay tại các phân xưởng nhân giống hoặc là giống thương phẩm có bán ở nơi cung cấp giống. Các loại giống này thường chứa nhiêu bào tử. Khi cấy vào môi trường dinh dưỡng, chúng sẽ phát triển thành tế bào nấm mốcvà tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn.Tỷ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5-20% so với khối lượng của môi trường. Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí.Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28-320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển. Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường. Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau: -Nhiệt độ tăng rất chậm. -Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. -Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. -Khối môi trường còn rời rạc. -Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Page 15 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường trong lòng môi trường. -Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường. -Môi trường được kết lại khá chặt -Độ ẩm môi trường giảm dần -Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C. -Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi. -Enzyme amylase được tổng hợp mạnh. -Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-300C là tốt nhất. Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau: -Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. -Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C,trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó luợng enzym amylase tạo ra sẽ giảm xuống . Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. Thu nhận sản phẩm:Kết thúc qúa trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzym amylase, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzym thô (vì ngoài thành phần enzym ra, chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nước trong môi trường). Để đảm bảo cho chế phẩm enzym thô α-amylase không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzym đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không). Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm. Để đảm bảo hoạt tính enzym không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-400C. Enzym α-amylase ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-70 độ C. Page 16 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải qúa trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzym. Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau: -Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi nghiền nhỏ.Mục đích của qúa trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô.Khi thành tế bào được phá vỡ ,các enzym nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.Phần lớn enzym amylase ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường.Khi ta nghiền nhỏ, enzym thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. -Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp này đượcdùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV. Trích ly:Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym α- amylase. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn). Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzym ra khỏi vật chất này. Qúa trình kết tủa enzym α-amylase: Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzym nhờ những tác nhân gây tủa.Trong công nghệ tinh chế enzym, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác. Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym. Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Page 17 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon. Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzym thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4- 7OC) theo thời gian, các enzym sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W). Ở trạng thái này enzym rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyn α-amylase ở 40OC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W ( thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương). Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzym α- amylase ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzym ngoài enzym amylase ta quan tâm, chẳng hạn enzym α- amylase này còn chứa hoạt tính protase có tính acid và cellulose do đó muốn thu nhận được enzym có độ tinh khiết cao hơn ta phải tinh chế enzym α-amylase kết tủa bằng các qúa trình lọc Gel hay sử dụng phương pháp cố định enzym ,… V.3. Thu nhận enzym α-amylase từ nấm mốc Aspergillus Oryzae V.3.1. Sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase từ nấm Khi nuôi VSV tạo amylase có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hoặc ngoài môi trường. Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối. Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme amylase kết thúc ở pha logarit cùng đồng thời với sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầu pha phát triển ổn định tiếp theo sau. Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng. Trong trường hợp này, sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn. V.3.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzyme V.3.2.1.Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh dưỡng Nguồn dinh dưỡng Nitơ hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryzae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylase. Hàm lượng thường sử dụng là 0,91%. Nari Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu qủa hơn so với các loại muối khác ( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat….). Cho nguồn Nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác .Ví dụ:Kết qủa thí nghiệm Fenikvova và cộng tác viên về việc sử dụng các nguồn Nitơ từ những muối khác nhau. Page 18 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE
LỌC HÓA DẦU A-K55 Bảng : Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp các enzyme amylase ( Sách Công nghệ enzym của Nguyễn Đức Lượng chủ biên, 2004) Nguồn Nitơ Liệu lượng muối, Hoạt động enzyme sau 6 ngày nuôi đối với 100ml % theo N α-amylase Glucomylase NaNO2 0,30 145 8000 NaNO3 0,15 26 3300 (NH4)2SO3 0,15 - - NH4NO3 0,15 98 4100 NH4NO3 0,30 45 4900 NH4H2PO4 0,30 5,5 8000 Ngoài ra cũng cần phải xác định tỷ lệ giữa nguồn carbon và Nitơ trong môi trường phù hợp cho mốc Asp.oryzae phát triển. Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và Nitơ có ý nghĩa lớn đối với sự sinh tổng hợp sinh khối của nấm Asp.oryzae và sự tạo thành amylase. V.3.2.2.Ảnh hưởng của Amino acid Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzym, trong đó có một số các amino acid không đồng nhất về giá trị dinh dưỡng nên sử dụng hỗn hợp amino acid sẽ có giá trị lớn hơn cho những chất lượng mới. Amino acid có ảnh hưởng tốt tới sinh lý của nấm mốc cũng như việc sinh tổng hợp enzym amylase do những nguyên nhân sau: -Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn carbon , nguồn Nitơ vừa là nguồn năng lượng. -Một số amino acid riêng lẻ (Glutamic acid ,Aspatic acid….) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác trong qúa trình chuyển amine hóa. Nhờ một số amino acid trước hết là glutamic acid, aspatic acid mà thực hiện đồng hóa dị dưỡng CO2 (Araiet al,1968). -Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như: Pantotenic acid, biotin, folic acid, …các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. Ngoài ra còn có những nhận xét cho rằng sự tổng hợp ARN trong tế bào một số VSV phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi ( Kurland, Marloe, 1962 ). Page 19 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE