Sản xuất saponin bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo Đinh lăng (Polyscisa fruticosa L. Harms)

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 135­141<br />  DOI: 10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> SẢN XUẤT SAPONIN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SEO ̣<br /> ĐINH LĂNG (Polyscisa fruticosa L. Harms)<br /> <br /> Đỗ Tiến Vinh1, Mai Thị Phương Hoa1, Lê Thị Như Thảo2, <br /> Nguyên Hoang Trang Nha<br /> ̃ ̀ ̃3, Trần Văn Minh3*<br /> Trường Đại học Nguyễn Tất Thành<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Nông Lâm thanh phô Hô Chi Minh <br /> 2<br /> ̀ ́ ̀ ́<br /> 3<br /> Trường Đại học Quốc tế thanh phô Hô Chi Minh, *drminh.ptntd@yahoo.com<br /> ̀ ́ ̀ ́<br /> <br /> TÓM TẮT: Lá in vitro chồi đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) được nuôi cấy phát sinh tạo mô <br /> sẹo trên môi trường MS có bổ sung 2,4­D 2 mg/l, kinetin 1 mg/l, sucrose 30 g/l cho tỷ lệ tạo sẹo <br /> 94,63 %. Môi trường MS có bổ sung 2,4­D 1 mg/l, kinetin 0,5 mg/l, sucrose 30 g/l, coconut water <br /> 10 % thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh khối mô sẹo với tốc độ  tăng sinh 19,83. Mô sẹo có màu <br /> trắng, xốp và tăng sinh nhanh. Bổ sung yeast extract, chitosan, casein hydrolysate vào môi trường <br /> tăng sinh cho thấy bổ sung yeast extract 150mg/l cho hàm lượng saponin tích tụ cao 3480,2 µg/g <br /> và tốc độ tăng sinh khối 17,58 lân.<br /> ̀  <br /> Từ khóa: Polyscias fruticosa, saponin, tích tụ, tốc độ tăng sinh, tăng sinh khối.<br /> <br /> MỞ ĐẦU Việc  ứng dụng công nghệ  nuôi cấy mô tế <br /> bào thực vật nhằm sản xuất các hợp chất thứ <br /> Cây   Đinh   lăng   (Polyscias   fruticosa  L. <br /> cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học  <br /> Harms) thuộc họ ngũ gia bì (Araliaceae), thuộc  <br /> thực vật. Masruri et al. (2007) [7] đã phát hiện <br /> nhóm cây dược liệu được sử dụng phổ biến  ở <br /> 3   hợp   chất   từ   vỏ   rễ   đinh   lăng   3­O­β­D­<br /> các Quần đảo Thái Bình Dương và vùng Đông  <br /> Glucopyranosyl   (1→2)­β­D­Glukopiranosyl,   3­<br /> Nam   Á   như   Indonesia,   Lào,   Malaysia,   Papua <br /> O­β­Drhamnopyranosyl   (1→2)­β­D­<br /> New Guinea, Philippines, Singapore, Thái Lan <br /> rhamnopyranosyl (1→3)­β­D­glucopyranosyl và <br /> và Việt Nam (Brickell, 2003) [2].<br /> 3­O­β­D­glucopyranosyl. Huan et al. (1998) [6]  <br /> Cây đinh lăng có công dụng trong các bài  đã định tính trong dịch chiết rễ, thân và lá đinh <br /> thuốc chống dị  ứng, chống mệt mỏi, giải độc  lăng   có   các   glycosid,   alkaloid,   tanin,   vitamin <br /> thức ăn và làm tăng sức dẻo dai của cơ  thể.   B1, khoảng 20 loại amino acid khác và phân <br /> Trong  đinh   lăng  có  hai   hợp   chất   chính  quan  lập được 11 triterpen. Trần Công Luận và nnk <br /> trọng là polyacetylen và saponin [9]. Ngoài ra,  (2001)   [16]   đã   định   tính   5   hợp   chất  <br /> còn   có   glucosides,   alcaloid   và   13   loại   amino  polyacetylen   từ   lá   đinh  lăng,   trong  đó   2  hợp <br /> acid trong đó lysin, systein, methionin là những  chất chủ  yếu: panaxynol và heptadeca 1,8(E)­<br /> amino acid không thể  thay thế  được [1]. Hợp  dien­4,6­diyn­3,10­diol   có   tác   dụng   kháng <br /> chất saponin, đặc biệt saponin triterpen có tác  khuẩn.<br /> dụng   ức   chế   tạo   thành   malonyl   dialdehyd <br /> Với nhu cầu sử  dụng các loài dược liệu <br /> trong   quá   trình   peroxyd   hóa   chống   stress   và <br /> làm thuốc ngày càng tăng, do khai thác liên tục <br /> triệu   chứng   trầm   cảm   [6],   chống   ung   thư,  <br /> trong nhiều năm không chú ý tới bảo vệ  tái <br /> chống   oxy   hóa,   kháng   khuẩn   và   kháng   nấm <br /> sinh, cộng với nhiều nguyên nhân khác đã làm <br /> [1]. Hàm lượng saponin tích lũy thay đổi phụ <br /> cho nguồn tài nguyên dược liệu Việt Nam bị <br /> thuộc vào: điều kiện tự  nhiên, thời vụ, điều <br /> giảm sút nghiêm trọng, nhiều loài đang đứng <br /> kiện canh tác, việc nuôi trồng đòi hỏi diện tích <br /> trước nguy cơ  bị  tuyệt chủng. Cac d ́ ịch chiết  <br /> lớn và phải mất từ  3­5 năm mới có thể  thu <br /> từ   lá  sim,   ngải   cứu,   đinh   lăng   và   bách   bộ <br /> hoạch [8].<br /> không  ức chế  sự  sinh cytokin khang viêm IL­<br /> ́<br /> <br /> <br /> 135<br /> 10, chứng to chung la nh<br /> ̉ ́ ̀ ưng dich chiêt khang<br /> ̃ ̣ ́ ́   Phương   phap: ́   Thí   nghiệm   được   bố   trí <br /> viêm tiêm năng [10]<br /> ̀ .  Dựa vào đặc điểm hình  theo   khôí   ngẫu   nhiên   hoàn   toàn   (CRD).   Thí <br /> thái, dược chất và phân tích di truyền là cơ sở  nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình tam  <br /> khoa  học  cho  phép  chọn   giống   Đinh  lăng  lá  giác   chứa   50   ml   môi   trường   nuôi   cấy,   mỗi <br /> nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms có nguồn từ  bình được nuôi cấy 5­10 mẫu va 1 g/chai (đôì ́ <br /> Hưng Yên) vào sản xuất thuốc [11]. Đã  xây  vơí   thí  nghiêm<br /> ̣   nhân   sinh   khôí   mô   seo).<br /> ̣   Kết <br /> dựng và thẩm định phương pháp định lượng   quả   nghiên   cứu   được   xử   lý   thống   kê   bằng <br /> oleanolic   acid   trong   cao   khô   đinh   lăng   bằng  SAS 9.1.<br /> HPLC  [3].  Nghiên cứu  phát  triển nguồn  gen  Phương   pháp   xác   định   hàm   lượng   saponin  <br /> cây  đinh   lăng  lá   nhỏ  Polyscias   fruticosa  L.  bằng HPLC<br /> Harms  ở  miền Đông Nam Bộ  [12]. Và bước <br /> đầu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây  Chuẩn bị mẫu phân tich o ́ leanolic acid: Cân <br /> 150 mg mẫu vào  ống COD, chiết siêu âm 4 <br /> đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms) <br /> [5].  lần   với   10   mL   ethylacetatat   chứa   1   %   acid  <br /> formic.   Thổi   khô   ethyl   acetat.   Hòa   tan   phần <br /> Những   tính   chất   sinh   học   đặc   sắc   của  cặn   bằng   pha   động,   lọc   qua   màng   lọc   0,45 <br /> Polyscias   fruticosa  được   phát   hiện   qua   nuôi  micro trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.<br /> cấy nuôi cấy tạo mô sẹo và dịch huyền phù tế <br /> bào [15]. Hoạt chất oleanolic acid glycosides   Chuẩn bị  mẫu phân tich saponin t<br /> ́ ổng số: <br /> Cân 150 mg mẫu vào bình cầu cổ nhám. Thêm <br /> trong dịch chiết sinh khối tế bào qua nuôi cấy <br /> trong bioreactor ở Viện Sinh lý thực vật (Viện  50 mL nước nóng và ủ tại 90 oC trong 10 phút. <br /> Thêm 7,5 mL HCl đậm đặc và đun hoàn lưu <br /> Hàn lâm  Khoa học Moscow)  đã  thương  mại <br /> hóa dưới thương hiệu “Vitamal”  được  uống  cách thủy trong 2 giờ. Tiếp theo, chiết 4 lần x  <br /> 100  mL  dicloromethan.   Pha   dicloromethan  cô <br /> hàng ngày đặc trị  tính thích  ứng và miễn dịch <br /> môi trường [4]. Trong bài báo này, chúng tôi   quay tới gần cạn, phần còn lại được thổi khô <br /> hoàn toàn bằng dòng khí N2. Hòa tan phần cặn <br /> nghiên cứu khả năng tích lũy saponin bằng kỹ <br /> thuật nuôi cấy mô sẹo. bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 micro <br /> trước khi tiêm.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để  định lượng saponin tổng số, các nhánh <br /> đường   gắn   trên   aglycone   được   thủy   phân <br /> ̣<br /> Vât liêu đ̣ ược sử  dụng là  la ́ non  cây   đinh <br /> trong môi trường acid để  chuyển hết về dạng <br /> ̣<br /> lăng môt năm tuôi đ ̉ ược cung câp t́ ừ bô s ̣ ưu tâp ̣  <br /> aglycone.  Do  đó,  saponin  tổng  số   được   định <br /> giông<br /> ́   Phong ̣   Công   nghệ   sinh   hoc̣  <br /> ̀   thí  nghiêm<br /> lượng thông qua oleanolic acid. <br /> thực vât, Khoa Khoa hoc nông nghiêp va Công<br /> ̣ ̣ ̣ ̀  <br /> nghệ   sinh   hoc,<br /> ̣   trương̀   Đaị   hoc̣   Nguyên ̃   Tât́  Quy trình HPLC phân tách và định lượng  <br /> Thanh. La non đ<br /> ̀ ́ ược căt thanh t<br /> ́ ̀ ưng manh 1 x 1<br /> ̀ ̉   oleanolic acid và saponin.<br /> cm va nuôi cây trên môi tr<br /> ̀ ́ ương tao mô seo.<br /> ̀ ̣ ̣ Pha   tĩnh:   cột   ACE3   C18  (4,6  x  150  mm,  <br /> Môi trường khoang c ́ ơ  bản  được sử  dụng  kích thước hạt 3,5 micro).<br /> trong   nghiên   cứu   là  Murashige­Skoog   (MS),  Pha   động:   đệm   triethylamine/   HCl   pH3   : <br /> Gamborg   (B5).   Các   chất   bổ   sung   vào   môi  MeOH tỉ lệ 10:90 v/v.<br /> trường   nuôi   cấy  gồm:   đường   sucrose,   2,4­D <br /> Tốc độ dòng pha động 0,5 mL/phút.<br /> (2.4­diclorophenoxyacetic   acid),   kinetin   (6­<br /> furfurylaminopurine), nước dừa (15%). Bước sóng 210 nm.<br /> Điều kiện nuôi cấy: Thi nghiêm đ<br /> ́ ̣ ược thực  Nhiệt độ cột 20oC.<br /> ̣ ̀ ̣<br /> hiên trong điêu kiên tôi, nhi<br /> ́ ệt độ  buồng  nuôi  ́ ́ ́ ̣<br /> Thiêt kê thi nghiêm<br /> 26+2oC, độ   ẩm phòng 70%, môi trường nuôi  Khảo sát môi trường khoáng cơ  bản nuôi <br /> cấy được khử  trùng  ở  1atm trong thời gian 20  cấy đến tạo mô sẹo đinh lăng: Lá non cây đinh <br /> phút. <br /> <br /> 136<br /> lăng  được nuôi cây trên các môi tr<br /> ́ ường  MS,  ̉ ược ghi nhân sau 25 ngay nuôi<br /> mg/l).  Kêt qua đ<br /> ́ ̣ ̀  <br /> 1/2MS, B5 và có bổ sung 2,4­D (0,5, 1, 2 mg/l),  cây.<br /> ́<br /> ́ ̉ ược ghi <br /> sucrose (30 g/l) và agar (8 g/l). Kêt qua đ Nghiên   cứu   ảnh   hưởng   của   số   lần   cấy <br /> ̣<br /> nhân sau 45 ngay nuôi cây.<br /> ̀ ́ truyền đến sự  tích tựu saponin trong mô sẹo <br /> Nghiên   cứu   ảnh   hưởng   của   2,4­D   và  đinh   lăng:   Mô   seọ   được   nuôi   câý   trên  môi <br /> kinetin đến tạo mô sẹo đinh lăng:  được thực  trường   MS   có 2,4­D   (1   mg/l),   kinetin   (0,5 <br /> hiện trên môi trường MS có bổ  sung kinetin  mg/l), agar (8 g/l), sucrose (30 g/l) va n ̀ ước dừa <br /> (0,5, 1, 2 mg/l), 2,4­D (0,5, 1, 2 mg/l), sucrose  ́ ̣<br /> (10 %). Xac đinh ham l ̀ ượng saponin ở cac lân cây<br /> ́ ̀ ́ <br /> ̉ ược ghi nhâṇ  <br /> (30 g/l) và agar (8 g/l).  Kêt qua đ<br /> ́ ̀ ừ 1­5. Kêt qua đ<br /> truyên t ́ ̉ ược ghi nhân sau 25 ngay<br /> ̣ ̀ <br /> sau 25 ngay nuôi cây.<br /> ̀ ́ nuôi cây.<br /> ́<br /> Nghiên   cứu  ảnh   hưởng   của   2,4­D   và  Các chỉ tiêu theo dõi<br /> kinetin đến nhân sinh khối mô sẹo đinh lăng:  Tỷ  lệ  tạo mô sẹo (%): Quan sát số  mẫu  <br /> ̣ ược nuôi cây trên môi tr<br /> Mô seo đ ́ ường MS có  tạo mô sẹo bằng mắt.<br /> bổ  sung kinetin (0,5, 1 mg/l), 2,4­D (0,5, 1, 2  <br /> mg/l),  sucrose (30 g/l) và agar (8 g/l).  Kêt qua<br /> ́ ̉  Hệ  số  tăng sinh = khối lượng mẫu sau thí <br /> được ghi nhân sau 25 ngay nuôi cây.<br /> ̣ ̀ ́ nghi ệm (g) / khối lượng mẫu ban đầu (g)<br /> <br /> Nghiên cứu ảnh hưởng của đường sucrose  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> và nước dừa đến nhân sinh khối mô sẹo đinh  Ảnh hưởng môi trường khoáng cơ  bản <br /> ̣ ược nuôi cây trên<br /> lăng:  Mô seo đ ́  môi trường  đến tạo mô sẹo đinh lăng<br /> MS có2,4­D (1 mg/l), kinetin (0,5 mg/l), agar <br />  <br /> Lá non được  sử  dụng làm mẫu nuôi cấy <br /> ̀ ổ  sung thêm các chất hữu cơ  như <br /> (8 g/l) va b<br /> tạo mô sẹo trên môi trường MS, 1/2MS và B5.  <br /> đường sucrose (10, 20, 30 g/l), nước dừa (5,  <br /> Kết quả bảng 1 cho thấy sau 45 ngày nuôi câý  <br /> ́ ̉ ược ghi nhân sau 25 ngay nuôi<br /> 10, 15%). Kêt qua đ ̣ ̀  <br /> cho   thấy   hầu   hết   các   môi   trường   đều   hình <br /> cây.<br /> ́<br /> thành mô sẹo. Trên môi trường MS có bổ sung  <br /> Nghiên  cứu  ảnh  hưởng   của  các  chất   bổ  tăng nồng độ  2,4­D từ  0,5 – 2 mg/l cho tỷ  lệ <br /> trợ đến quá trình nhân sinh khối và sự tích tựu   mẫu tạo mô sẹo cao nhất với la 83,68 % và ́  <br /> saponin trong mô sẹo đinh lăng: Mô seo đ ̣ ược  ̉ ̀<br /> thân 59,30 %. Kêt qua nay phù h<br /> ́ ợp vơi công bô<br /> ́ ́ <br /> nuôi cây trên<br /> ́  môi trường MS co ́2,4­D (1 mg/l),  cuả  Phạm   Thị   Tố   Liên,   Võ   Thị   Bạch   Mai  <br /> kinetin (0,5 mg/l), agar (8 g/l), sucrose (30 g/l),  ́ ̣<br /> (2007) [13] khi nuôi cây tao mô seo t ̣ ừ la đinh<br /> ́  <br /> nước dừa (10 %) và bổ  sung yeast extract (50,  lăng. Môi trường thích hợp cho nuôi cấy tạo <br /> 100, 150, 200 mg/l), chitosan (50, 100, 150, 200  mô sẹo ở mẫu lá MS có bổ sung 2,4­D 2 mg/l.<br /> mg/l),   casein  hydrolysate  (50,   100,   150,   200 <br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến tạo mô sẹo đinh lăng<br /> Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)<br /> Môi trường nuôi cấy 2,4­D (mg/l)<br /> Lá Thân<br /> MS 0,5 68,63 c<br /> 50,49c<br /> MS 1,0 79,52 b<br /> 63,94a<br /> MS 2,0 83,68 a<br /> 59,30b<br /> ½ MS 0,5 50,49f 42,47d<br /> ½ MS 1,0 63,41 e<br /> 49,92c<br /> ½ MS 2,0 65,52 d<br /> 51,60c<br /> B5 0,5 38,69h 34,65f<br /> B5 1,0 42,56 g<br /> 38,55e<br /> B5 2,0 43,37 g<br /> 39,97e<br /> <br /> <br /> 137<br /> Ảnh   hưởng   kết   hợp   2,4D   và   kinetin   đến  hình thành rễ bất định; mô sẹo trên môi trường <br /> tạo mô sẹo đinh lăng có 2,4­D không có sự phát sinh hình thái. Tế bào <br /> mô sẹo trên môi trường có 2,4­D và kinetin có <br /> Trên môi trường nuôi cấy MS có bổ  sung <br /> màu trắng, xốp và tăng sinh nhanh. Môi trường  <br /> 2,4D và kinetin cho thấy chỉ  bổ  sung 2,4­D 2  <br /> nuôi cấy MS có bổ sung 2,4­D 2 mg/l và kinetin <br /> mg/l đạt tỷ  lệ  tạo sẹo 81,27 %, với chỉ  có bổ <br /> 1mg/l thích hợp cho sự tạo mô sẹo từ mô lá nuôi <br /> sung kinetin đạt tỷ  lệ  tạo sẹo 25,4 %,   bô sung<br /> ̉  <br /> cấy (bảng 2). Kêt qua nay phù h<br /> ́ ̉ ̀ ợp vơi công bô<br /> ́ ́ <br /> kết hợp 2,4­D 2 mg/l và kinetin 1 mg/l đạt tỷ lệ <br /> cuả  Phạm   Thị   Tố   Liên   &   Võ   Thị   Bạch   Mai <br /> tạo mô sẹo cao nhất 94,63 %. Mô sẹo trên môi <br /> ́ ̣<br /> (2007)  [13] khi nuôi cây tao mô seo t ̣ ừ la đinh<br /> ́  <br /> trường có bổ sung kinetin có dạng chặt và có sự <br /> lăng.<br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của BA và 2,4D  Bảng 3. Ảnh hưởng của 2,4D va kinetin ̀<br /> đến tạo mô sẹo đinh lăng đến nhân sinh khối mô sẹo đinh lăng<br /> Tỷ lệ mẫu  Hệ số <br /> 2,4­D  2,4­D  Kinetin <br /> BA (mg/l) tạo mô sẹo  tăng sinh <br /> (mg/l) (mg/l) (mg/l)<br /> (%) (lần)<br /> 0,0 0,0 0,00k 0,0 0,0 2,79h<br /> 0,5 0,0 68,67e 0,5 0,0 7,52f<br /> 1,0 0,0 76,84d 1,0 0,0 9,79c<br /> 2,0 0,0 84,34b<br /> 2,0 0,0 8,97de<br /> 0,0 0,5 0,00k<br /> 0,0 1,0 0,00k 0,0 0,5 5,64g<br /> 0,0 2,0 26,40j 0,0 1,0 4,82g<br /> 0,5 0,5 66,43f 0,5 0,5 8,08ef<br /> 0,5 1,0 63,45g 0,5 1,0 7,34f<br /> 0,5 2,0 55,79i<br /> 1,0 0,5 13,95a<br /> 1,0 0,5 69,25e<br /> 1,0 1,0 61,37h 1,0 1,0 10,21c<br /> 1,0 2,0 60,74h 2,0 0,5 11,43b<br /> 2,0 0,5 88,78a 2,0 1,0 9,76cd<br /> 2,0 1,0 80,24c<br /> 2,0 2,0 69,94e<br /> <br /> Bảng   4.  Ảnh   hưởng   của   đường   sucrose   và  10 15 13,87ef<br /> nươc d<br /> ́ ưa đ̀ ến nhân sinh khối mô sẹo đinh lăng 20 5 14,35e<br />  Đường  Nước dừa  Hệ số tăng  20 10 15,58cd<br /> sucrose (g/l) (%) sinh (lần) 20 15 16,32bc<br /> 0 0 4,65l 30 5 16,68b<br /> 10 0 10,64i 30 10 19,83a<br /> 20 0 12,74gh 30 15 20,14a<br /> 30 0 14,63de<br /> 0 5 6,84k Ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến nhân <br /> 0 10 8,25j sinh khối mô sẹo đinh lăng<br /> 0 15 8,62j Mô sẹo hình thành trên môi trường MS có <br /> 10 5 11,87h bổ sung 2,4­D 2 mg/l và kinetin 1mg/l được sử <br /> 10 10 13,25fg dụng trong nghiên cứu tăng sinh khối trên môi <br /> <br /> 138<br /> trường nuôi cấy tăng sinh khối MS có bổ sung  Ảnh   hưởng   của   yeast   extract,   casein  <br /> 2,4­D và kinetin. Kết quả  cho thấy khả  năng  hydrolysate và chitosan đến nhân sinh khối <br /> tăng sinh khối đạt 13,95 lần trên môi trường   và tích tựu saponin trong mô sẹo đinh lăng<br /> MS có bổ sung 2,4­D 1 mg/l và kinetin 0,5 mg/l <br /> Trên môi trường nuôi cấy tăng sinh  MS + <br /> (bảng 3). Hình thái khối mô sẹo tăng sinh có <br /> 2,4­D 1 mg/l + kinetin 0,5 mg/l + sucrose 30 g/l + <br /> màu trắng và xốp hơn so với mô sẹo mới bắt  <br /> nước   dừa   10   %   bổ   sung   yeast   extract,   casein <br /> đầu nuôi cấy.  Kêt qua nay phù h<br /> ́ ̉ ̀ ợp vơi công<br /> ́  <br /> hydrolysate và chitosan nhằm nâng cao hiệu suất <br /> ́ ̉<br /> bô cua Slepyan et al. (1975b) [15] khi nuôi cây<br /> ́ <br /> tăng sinh khối và tích tụ  saponin. Kết quả  cho <br /> ̣<br /> tăng sinh khôi mô seo đinh lăng.<br /> ́<br /> thấy hiệu quả  rõ với việc bổ  sung yeast extract <br /> Ảnh   hưởng   của   đường   sucrose   và   nước  150 mg/l đạt hệ số tăng sinh 17,58 và hàm lượng <br /> dừa đến nhân sinh khối mô sẹo đinh lăng ̉<br /> saponin là 3480,2 µg/g (bang 5).  Sự bổ sung yeast <br /> Trên môi trường MS + 2,4­D 1 mg/l + kinetin  extract  ở nồng độ cao giúp tạo ra các tiền chất <br /> 0,5 mg/l có bổ sung đường sucrose va n ̀ ươc d́ ưà   nhưng lại gây cản trở  sự  phân chia tế  bào,  ở <br /> nhằm nâng cao hiệu suất nuôi cấy tăng sinh  nồng độ  150 mg/l thích hợp nó kích hoạt việc <br /> khối   tế   bào   mô   sẹo.   Qua   bảng   4,   bổ   sung   sản xuất, chuyển hóa các chất thứ cấp [14]. <br /> đường sucrose 30 g/l và nước dừa 10 % nâng <br /> hiệu suất tăng sinh khối rõ rệt 19,83 lần.<br /> <br /> Bảng 5.  Ảnh hưởng của yeast extract, chitosan, casein   hydrolysate  đến sự  tích lũy hàm lượng  <br /> saponin của mô sẹo đinh lăng<br /> Yeast extract  Hệ số tăng sinh <br /> Casein (mg/l) Chitosan (mg/l) Saponin (µg/g)<br /> (mg/l) (lần)<br /> 0 0 0 19,26a 1640,3e<br /> 50 0 0 18,94a 2562,7d<br /> 100 0 0 18,17ab 2920,3c<br /> 150 0 0 17,58b 3480,2a<br /> 200 0 0 17,30b 3026,0b<br /> 0 50 0 9,58c 396,2g<br /> 0 100 0 9,32c 695,2f<br /> 0 150 0 7,67d 378,8h<br /> 0 200 0 6,42e 210,2i<br /> 0 0 50 6,65de KPT<br /> 0 0 100 5,72e KPT<br /> 0 0 150 4,40f KPT<br /> 0 0 200 4,05f KPT<br /> <br /> Bảng 6. Sự tích lũy saponin ở các lần cấy <br /> truyền mô sẹo đinh lăng Ảnh   hưởng   của   số   lần   cấy   truyền   đến <br /> Hàm lượng saponin  hàm lượng saponin tích tựu trong mô sẹo <br /> Lần cấy truyền<br /> (µg/g) đinh lăng<br /> F1 1712,6d Hàm lượng saponin trong mô sẹo ở các lần <br /> F2 1640,3e cấy chuyền từ thứ nhất đến thứ ba có sự khác <br /> F3 2024,6b biệt nhưng sự  khác biệt này sai khác là hoàn  <br /> F4 2052,2a toàn ngẫu nhiên. Khả năng tổng hợp hoạt chất <br /> F5 1963,7c của tế  bào mô sẹo đinh lăng được duy trì  ổn <br /> <br /> 139<br /> định trong bốn lần cấy chuyền, đến lần cấy  môi trường MS + 2,4­D 2 mg/l + kinetin 1 <br /> chuyền thứ  năm thì hàm lượng saponin giảm   mg/l + sucrose 20 g/l. Quá trình nhân sinh khối <br /> 1963,7µg/g (bảng 6). Nên cần tiến hành dòng  mô sẹo cho kêt qua tôt nhât trên môi tr<br /> ́ ̉ ́ ́ ường  <br /> hóa tế bào thường xuyên để chọn được những  MS + 2,4­D 1 mg/l + kinetin 0,5 mg/l + đương ̀  <br /> dòng tế  bào có khả  năng tổng hợp hoạt chất  sucrose 30 g/l + nươc d́ ưa 10 %.<br /> ̀   Thế  hệ  cấy <br /> tốt nhất [15] chuyền tế bào mô sẹo thu nhận tốt nhất là thế <br /> KẾT LUẬN hệ  thứ  4 cho hàm  lượng saponin tích tựu là <br /> 2052,2  µg/g  trọng  lượng  khô.   Bổ   sung  yeast <br /> La cây đinh lăng t<br /> ́ ạo mô sẹo tôt nhât trên<br /> ́ ́ extract 150 mg/l vào môi trường nuôi cấy làm <br /> tăng khả  năng  tích lũy saponin là  3480,2  µg/g <br /> ̣<br /> trong mô seo. <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Bensita M.B., Nilani P., Madhu C. D., 1998. <br /> On   the   antipyretic,   anti­inflammatory, <br /> analgesic   and   molluscicidal   properties   of <br /> Polyscias   fruticosa  (L.)   Harms.  Ancient <br /> Science of Life, 8: 1­6.<br /> 2. Brickell   C.   H.,   2003.   American <br /> Horticultural   Society   A­Z   encyclopedia   of <br /> garden plants. Dorling Kindersley, London, <br /> pp. 818­819.<br /> 3. Chử  Thị  Thanh Huyền, Nguyễn Thị  Kiều <br /> Anh, Trịnh Thị  Nhung, Nguyễn Huy Văn, <br /> Lâm   Thị   Bích   Hồng,   2012.  Nghiên   cứu <br /> định   lượng   acid   oleanolic   trong   cao   khô <br /> đinh lăng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. <br /> Tạp chí Dược học, 457(10): 34­38; 25­30. <br /> 4. Furmanowa M., Nosov A. M., Oresnikov A. <br /> V., Klushin A. G., Starościak B., Śliwińska <br /> A.,   Guzewska   J.,   Bloch   R.,   2002. <br /> Antimicrobial   activity   of  Polyscias  <br /> filicifolia  cell   biomass   extracts.   Pharmazie <br /> 57: 424­426.<br /> 5. Hà Bích Hồng, Vũ Thị Thơm, Vũ Đức Lợi, <br /> Lê Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Hải, 2013. <br /> Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống <br /> in   vitro   cây  đinh   lăng  lá   nhỏ   (Polyscias <br /> fruticosa   L.   Harms).   Tạp   chí   Dược   học, <br /> 450(10): 25­30.<br /> 6. Huan V. D., Yamamura S., Ohtani K., Kasai <br /> R., Yamasaki K., Nham N. T., Chau H. M., <br /> 1998.   Oleane   saponins   from  Polyscias <br /> fruticosa. Phytochemistry 47: 451­457.<br /> <br /> <br /> <br /> 140<br /> 7. Masruri   E.   D.   I.,   Kristianingsih   E.   P.   U.,  12. Nguyễn   Thị   Ngọc   Trâm,   Nguyễn   Văn <br /> Rahman   M.   F.,   Rurini   R.,   2007.  Thiện,   Hoàng   Tuyết   Minh,   Phạm   Thị <br /> Indentification   of   triterpenoid   compound  Thùy, 2014.  Nghiên cứu phát triển nguồn <br /> from  Polyscias   fruticosa  Harms  gen cây đinh lăng lá nhỏ Polyscias fruticosa <br /> (Araliaceae)   root   bark.   International  (L.) Harms  ở miền Đông Nam Bộ. Tạp chí <br /> Conference on Chemical Sciences. Dược học, 462(10): 30­35.<br /> 8. Nguyễn Trần Châu, Đỗ  Mai Anh, Nguyễn  13. Phạm   Thị   Tố   Liên,   Võ   Thị   Bạch   Mai, <br /> Phương  Dung,  2007.  Nghiên cứu  một  số  2007.   Bước   đầu   nghiên   cứu   sự   tạo  dịch <br /> tác   dụng   dược   lý   thực   nghiệm   của   sản  treo   tế   bào   cây   đinh   lăng  Polyscias  <br /> phẩm cấy mô từ  cây đinh lăng  Polyscias  Fruticosa  L.   Harms.   Tạp   chí   phát   triển <br /> fruticosa Harm (Araliacea). Tạp chí Nghiên  khoa học và công nghệ 10(7): 11­13.<br /> cứu y học TPHCM 11(2): 126­131. 14. Sanchez­Sampedro   M.   A.,   Fernandez­Ta<br /> 9. Nguyễn Thị  Ánh Tuyết, Nguyễn Kim Phi  ´rrago J., Corchete P., 2005. Yeast extract <br /> Phụng, 2007. Khảo sát thành phần hóa học  and   methyl   jasmonate­induced   silymarin <br /> lá   cây   đinh   Lăng  Polyscias   serrata  Balf.  production   in   cell   cultures   of  Silybum <br /> (Araliaceae).  Journal   of   chemistry   45(1):  marianum  (L.)   Gaernt.   J.   Biotech.   (119): <br /> 102­105. 60­69.<br /> 10. Nguyêñ   Thị   Mai   Phương,   Trinh<br /> ̣   Tât́  15. Slepyan L. I., Dzhabava L. A., Loshchilina <br /> Cương,̀  Trân Thi<br /> ̀ ̣  Nhung, Dương  Thi Nu, ̣ ̣  I.   A.,   1975b.   Khimicheskoe <br /> ̣   Ngoc̣   Quang,  2013.  Xây   dựng   mô <br /> Đăng ifarmakologicheskoe   zuchenie   biomassy <br /> hinh<br /> ̀   sang̀   loc̣   chât́   khang<br /> ́   viêm   thông   qua  kultury   tkanei  Polyscias   filicifolia  ailey. <br /> ̣ ̉<br /> thu thê toll like 4 (TLR4) trên mang tê bao ̀ ́ ̀  Rast. Res. 11: 523­528.<br /> macrophage   chuôṭ .   Tạp   chí   Dược   học,  16. Trần   Công   Luận,   Hồ   Thị   Tuyết   Linh, <br /> 443(3): 05­10. Phạm   Thị   Xuân   Thắm,   Nguyễn   Thành <br /> 11. Nguyễn   Thị   Ngọc   Trâm,   Đặng   Trọng  Nguyên,   Nguyễn   Thượng   Dong,   2001. <br /> Lương, 2014. Nghiên cứu đa hình di truyền  Hợp   chất   Polyacetylen  trong lá  đinh lăng <br /> tập   đoàn   các   giống  đinh   lăng  (Polyscias  (Polyscias fruticosa L. Harms., Araliaceae). <br /> fruticosa L. Harms) có  ở  Việt Nam bằng  Tuyển  tập  Công   trình  NCKH   1987­2000. <br /> kỹ   thuật   RAPD.   Tạp   chí   Dược   học,  Nxb. Khoa học và Kỹ  thuật, Ha Nôi: 238­<br /> ̀ ̣<br /> 457(5): 25­30. 240.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> SAPONIN PRODUCTION BY CELL CULTURE TECHNIQUES <br /> OF Polyscias fruticosa L. Harms <br /> <br /> <br /> <br /> 141<br />  Do Tien Vinh1, Mai Thi Phuong Hoa1, Le Thi Nhu Thao2, <br /> Nguyen Hoang Trang Nha3, Tran Van Minh3<br /> 1<br /> Nguyen Tat Thanh University<br /> 2<br /> Nông Lam University HCMC <br /> 3<br /> International University, VNU­HCM<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> In vitro leaves of Polyscias fruticosa L. Harms were induced callus on MS medium supplemented with 2,4D <br /> 2mg/l,  kinetin 1mg/l,  sucrose 30g/l gave callus initiation percentage of  94.63%. Media cultivation of MS <br /> supplemented   with  2,4D   1mg/l,  kinetin   0.5mg/l,  sucrose   30   g/l,   coconut   water   10   %   was   favored   for <br /> proliferation of callus to reach the growth rate of 19.83. Callus cells were white, soft with the high growth <br /> rate. Supplement with yeast extract, chitosan, casein hydrolysate separately to proliferated medium to show <br /> that the yeast extract 150 mg/l gave the highest saponin accumulation of 3480.2 µg/g and reasonable growth <br /> rate of 17.58. <br /> Keywords: Polyscias fruticosa, accumulation, growth rate, proliferate, saponin<br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 142<br /> 143<br />