Sinh học phân tử - Southern blot

Chia sẻ: Trâu Quân | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:36

Thêm vào BST

Báo xấu

199
lượt xem 63
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đây là phương pháp cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn ADN nào đó, trong hỗn hợp các đoạn ADN khác nhau Do E.M.Southern đề xuất vào năm 1975, tại đại học Edingburd.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sinh học phân tử - Southern blot

Sinh học phân tử Southern blot Thực hiện: www.themegallery.com LOGO Đỗ Đức Anh Ng.Thị Điểm Ng.Phan Thị Hoàng Kim Hồng Vĩnh Thành Mai Hoàng Yến
Nội dung seminar I Giới thiệu về phương pháp Southern Blot 1 Khái niệm II Lai phân tử 2 Các kiểu lai phân tử 3 Các yếu tố ảnh hưởng 1 Nguyên lí và điều kiện III Southern blot 2 Mẫu dò 3 Qui trình IV Ứng dụng LOGO
Southern blot I. Giới thiệu chung về phương pháp Southern blot. - Đây là phương pháp cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn ADN nào đó, trong hỗn hợp các đoạn ADN khác nhau - Do E.M.Southern đề xuất vào năm 1975, tại đại học Edingburd. - Được triển khai nhờ 1 số kĩ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như: • Tách chiết gen. • PCR • Thẩm tích các phân tử acid nucleotide lên màng lai (blot). • Lai phân tử ( lai với mẫu dò đặc hiệu) • … LOGO
II. Lai phân tử 1. Khái niệm  Là hiện tượng 2 mạch DNA sau khi đã tách rời, sẽ kết hợp lại với nhau ở điều kiện nhiệt độ được làm giảm từ từ, kết hợp với điều kiện thí nghiệm thích hợp.  Đặc điểm: – Đặc hiệu tuyệt đối: sự bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự hoàn toàn bổ sung cho nhau. – Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA  ptử DNA-DNA, RNA-RNA, các phân tử lai DNA-RNA LOGO
Southern blot Các kiểu lai phân tử Lai trong Lai tại chỗ pha lỏng Lai trên pha rắn LOGO
LAI TRÊN PHA RẮN Nguyên tắc -1 trình tự bổ Sự lai phân tử sung. xảy ra do: 1 trình tự cần Chuyển động biết được gắn nhiệt. trên gía thể Nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ LOGO
CÁC YẾU TỐ KĨ THUẬT TRONG LAI TRÊN PHA RẮN Màng Nitrocellulose: Màng Nitrocellulose: Màng nylon được sử dụng được sử dụng đầu tiên, được sử dụng đầu tiên, phổ biến: nay ít dùng, do: nay ít dùng, do: Có thể tiếp nhận Độ bền cơ học Độ bền cơ học 500µg/cm2. kémkhó thao tác. kémkhó thao tác. Không thể tách rời Không thể tách rời giữ DNA chắc hơn. các phân tử lai trên các phân tử lai trên Ít đứt gãy màng để lai trở lai màng để lai trở lai với một mẫu dò với một mẫu dò Cho phép lai nhiều khác. khác. lần với mẫu dò khác nhau LOGO
Southern blot Diagram Lai trên màng rắn Thuận lợi: Khó khăn: Dễ dàng trong Định lượng thao tác. phân tử kém Dễ dàng tách chính xác trình tự không lai Hiệu quả lai ra khỏi phân tử lai. thấp (vận tốc Ngăn cản sự tái lai chậm đi 10 bắt cặp giữa 2 lần so với vận mạch đơn của tốc lai trên pha cùng một phân tử. lỏng). LOGO
III. PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT Diagram Nguyên lí Nguyên lí - dựa trên nguyên - Dựa vào nguyên tắc tắc biến tính và bổ sung giữa các cặp mucleotide: AT, GC hồi tính của phân (các đoạn tử DNA polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung) LOGO
Southern blot Phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hóa chất gây biến tính DNA (NaOH, Formaldehyt). Đòi hỏi một đoạn DNA (RNA) đã biết được sử dụng làm mồi “Probe” được đánh dấu Nguyên tắc Nguyên tắc Các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR LOGO
TẠO MẪU DÒ Diagram Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR Tạo mẫu dò nhờ Plasmid Thiết lập mồi và đánh dấu phóng xạ vào các mồi. Cắt Plasmid và ADN đã tách Biến tính mẫu ADN thành các chiết từ tế bào bởi cùng một sợi đơn. loại Enzym. Gắn mồi vào các sợi đơn. Gắn ADN vào Plasmid trong Tổng hợp các sợi ADN mới. điều kiện môi trường phù hợp. Biến tính để tách chuỗi mới vừa Thực hiện biến nạp vào trong tổng hợp thành các sợi đơn. tế bào vi khuẩn. Tiếp tục quay về gắn mồi vào Nhân các tế bào vi khuẩn và các sợi đơn. chọn lọc. Tách plasmid từ các tế bào chọn lọc. Tách mẫu dò (đoạn ADN). Đánh dấu mẫu dò LOGO
Southern blot đồng vị phóng xạ (P32) Phát quang sinh … học Đánh dấu probe Enzyme polynucleotide Kéo dài mồi kinase Phương pháp hóa học LOGO
ĐÁNH DẤU ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ DNA dùng để tạo mẫu dò Tạo ra các vết khía sau đó bổ xung các nucleotide tự do trong đó có các nucleotide, đã được đánh dấu phóng xạ. DNA polymerase I được cho vào ống và bám vào các vết cắt. Polymerase bắt đầu sửa chữa DNA theo chiều 5' 3'. DNA này sau đó được bằng nhiệt độ làm biến tính sợi kép thành hai sợi đơn. LOGO
ĐÁNH DẤU BẰNG PHÁT QUANG SINH HỌC - Mẫu dò được đánh dấu bằng enzyme peroxidase. - Sau khi cho màng lai tiếp xúc với mẫu dò (được đánh dấu phát quang sinh học), cơ chất của perpxidase bị biến đổi, ánh sáng phát ra sẽ được in trên phim  thu nhận được kết quả LOGO
QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT Giai đoạn 3 Giai đoạn 2 Giai đoạn 1 Lai với probe Chuyển DNA và kiểm tra Tách chiết và từ agarose gel bằng kỹ thuật làm biến tính lên màng lai phóng xạ tự DNA thành ghi các sợi đơn LOGO
LOGO
LOGO
Giai đoạn 1 Tách chiết DNA cần nghiên cứu Cắt DNA nghiên cứu bằng enzyme cắt giới hạn Tiến hành điện di hỗn hợp DNA vừa được cắt, trên gel agarose Làm biến tính các dải băng DNA trên gel agarpose dd NAOH 0,4M thành các sợi đơn LOGO
LOGO
GIAI ĐOẠN II - Màng được sử dụng là màng nitocellulose hoặc màng nylon. - Nguyên tắc: dựa vào nguyên tắc mao dẫn • Đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên chuyển các mảnh DNA từ gel lên màng và bám chặt vào màng ( thời gian chuyển dựa vào các phương pháp chuyển khác nhau). - Cách tiến hành: • Đặt gel lên giá chuyển máy Blotting để chuyển nguyên vẹn các sợi ADN biến tính. • dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0,4M. • màng lai sẽ giữ cố định các đoạn ADN được chuyển lên từ gel điện di LOGO