So sánh phương pháp hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ huỳnh quang đánh giá HER2 trong ung thu vú

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

82
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài trình bày về việc ứng dụng các phương pháp HMMD và FISH xác định tình trạng HER2/ung thư vú nhằm đưa ra kết quả chính xác nhất để bệnh nhân nhận được phác đồ điều trị thích hợp nhất. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: So sánh phương pháp hóa mô miễn dịch và lai tại chỗ huỳnh quang đánh giá HER2 trong ung thu vú

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH VÀ LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG ĐÁNH GIÁ HER2 TRONG UNG THU VÚ Đoàn Thị Phương Thảo*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Phan Đặng Anh Thư, Nguyễn Thị Hồng Nguyệt*, Lý Thanh Thiện*, Đặng Hoàng Minh* TÓM TẮT Giới thiệu: Ứng dụng các phương pháp HMMD và FISH xác định tình trạng HER2/ ung thư vú nhằm đưa ra kết quả chính xác nhất để bệnh nhân nhận được phác đồ điều trị thích hợp nhất. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Phương pháp HMMD: thực hiện trên máy tự động Ventana, sử dụng PATHWAY™ HER2 (clone CB11) là một kháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên c-2erbB trong các mẫu ung thư. Đã được FDA chấp thuận. Phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang (FISH): dùng bộ kit Path Vysion, cũng đã được FDA chấp thuận và ASCO and CAP khuyến cáo là “tiêu chuẩnvàng” cho đánh giá sự khuếch đại gen HER2. Kết quả: Khảo sát 264 trường hợp thực hiện đồng thời HMMD và FISH -Kết quả HMMD: tỉ lệ dương tính 3(+) 26,9%, nếu xem cả những trường hợp 2(+) là dương tính thì tỉ lệ HER2 (+) trên HMMD là 39,8%. Kết quả âm tính 60,2%. -Kết quả FISH: không khuếch đại là 67% và khuếch đại là 33%. Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 2,0 là ngưỡng để đánh giá có khuếch đại. Khuếch đại giáp biên 6,1%, khuếch đại thấp 9,5%, khuếch đại cao 17,4%. Trong nghiên cứu này, thống kê Cramer’s V = 0,94 với p=0,001, cho thấy mối quan hệ giữa hai phương pháp này tương quan mạnh và giữa hai phương pháp có sự khác biệt nhỏ, đặc biệt là nhóm HMMD 2(+). Từ khóa: Hóa mô miễn dịch, Lai tại chỗ huỳnh quang, HER2 ABSTRACT COMPARISON METHODS IMMUNOHISTOCHEMISTRY AND FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION ASSESSMENT HER2 GENE IN BREAST CANCER Doan Thi Phuong Thao, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Thi Hong Nguyet, Ly Thanh Thien, Dang Hoang Minh, * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 174 - 181 Introduction: Application of IHC and FISH methods to determine HER2 status in breast cancer in order to provide the most accurate results for patients receiving treatment most appropriate Methods: IHC: Immunohistochemical analysis was performed as specified by the autoimmunostainer using the Pathway kit. The slides then were placed on an autoimmunostainer using the primary monoclonal antibody and polymer detection system supplied by Ventana. FISH: FISH was performed as specified by the manufacturer, with a guideline to improve the accuracy of HER2 testing in invasive breast cancer of ASCO and CAP. The PathVysion kit includes a Spectrum Orange-labeled DNA probe specific for the HER2 gene locus and a Spectrum Green-labeled probe specific for the alpha satellite DNA sequence at the centromeric region of chromosome 17 (CEP17). FISH and IHC results were compared with each other by means of Cramer's V statistics. Result: 264 cases performed simultaneously IHC and FISH. IHC: HER2 3(+) 26.9%, HER2 2(+) 12.9%, HER(-): 60.2% FISH: Non Amplified: 67.0%; Border Amplified: 6.1%; Low-Copy Amplified: 9.5%; High-Copy amplified: 17.4%; Correlation between IHC and FISH assays: IHC (-) cases : Non Amplified: 153/159 (96.2%); ∗ Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh – Đại Học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: ThS. Đoàn Thị Phương Thảo ĐT: 0938008418 Email: thaodoanthiphuong@ymail.com 174 Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Border Amplified: 4/159 (2.5%); Low-Copy Amplified: 2/159 (1.3%); High-Copy amplified: Non. IHC2+ cases: Non Amplified: 22/34 (64.7%); Border Amplified: 8/34 (23.5%); Low-Copy Amplified: 2/34 (5.9%); High-Copy amplified: 2/34 (5.9%). IHC 3+ cases: Non Amplified: 2/71 (2.8%); Border Amplified: 4/71 (5.6%); Low-Copy Amplified : 21/71 (29.6%); High-Copy amplified: 44/71 (62.0%). Cramer's V statistics = 0.94 with p=0.001 Conclusions: Correlation between IHC and FISH assays is intermediate. FISH should be done for all patients in need of treatment with Trastuzumab. Key words: IHC, FISH, HER2 ĐẶT VẤN ĐỀ Huỳnh Quang. Ung thư vú có 18% đến 30%(25,29), biểu hiện quá mức của HER2. Sự khuếch đại gen và/hoặc biểu hiện quá mức của thụ thể HER2 là yếu tố tiên lượng cho cả các trường hợp đã di căn hoặc chưa, tiên đoán đáp ứng hóa trị liệu và không đáp ứng nội tiết và là chỉ định cho điều trị kháng thể đơn dòng trastuzumab(6,15). Tầm quan trọng của tình trạng HER2 trong việc đưa ra quyết định điều trị, những bệnh nhân có kết quả dương tính giả sẽ không hưởng lợi từ các liệu pháp điều trị .nguy cơ gây độc cho cơ tim khi điều trị kháng thể đơn dòng(26) đã khiến các nhà nghiên cứu tập trung chú ý vào độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm khác nhau dùng để xác định tình trạng HER2. Các xét nghiệm đánh giá HER2 phải là định lượng hoặc bán định lượng, có khả năng lặp lại và phải là xét nghiệm phân biệt rõ ràng giữa các tế bào u có hoặc không khuếch đại/biểu hiện quá mức HER2(12,16). ĐỐI TƯỢNG -- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để xác định tình trạng HER2, những phương pháp dựa vào hình ảnh mô học như Hóa mô miễn dịch (IHC), lai tại chỗ huỳnh quang (FISH) đã thay thế được các phương pháp khác như Southern blot, xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết men (enzyme-linked immunosorbent assay), và PCR, những xét nghiệm này đòi hỏi phải sử dụng mô tươi, ly giải toàn bộ mẫu mô nên kết quả có thể không chính xác do sự trộn lẫn giữa mô ung thư và mô lành(18,13). Mục tiêu nghiên cứu Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm - Xác định tỉ lệ khuếch đại HER2 trong ung thư vú. - Đánh giá mức độ tương hợp giữa hai phương pháp Hóa Mô Miễn Dịch và Lai Tại Chỗ Đối tượng Tất cả bệnh nhân được chẩn đoán ung thư vú tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong năm 2009. Được thực hiện đồng thời hóa mô miễn dịch và FISH. Hóa Mô Miễn Dịch Thực hiện trên máy tự động Ventana, sử dụng PATHWAY™ HER2 (clone CB11) là một kháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên c2erbB trong các mẫu ung thư. Đã được FDA (Food and Drug Administration) chấp thuận(4). Người khảo sát HMMD độc lập với người khảo sát FISH Chúng tôi cho điểm theo thang điểm khuyến cáo của nhà sản xuất 0: màng tế bào ung thư xâm lấn hoàn toàn không bắt màu 1(+): màng tế bào ung thư xâm lấn bắt màu rãi rác, nhạt. 2(+): màng tế bào ung thư xâm lấn bắt màu hoàn toàn, mỏng, nhạt ≥30%. 3(+): màng tế bào ung thư xâm lấn bắt màu hoàn toàn, dày, đậm, ≥30%. Tất cả những trường hợp nhuộm bào tương đều được nhuộm lại. Lai tại chỗ huỳnh quang (FISH)(30) FISH được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất. Bộ kit bao gồm đoạn dò PathVysion DNA Spectrum Orange-đặc hiệu cho gen HER2 và đoạn dò Spectrum Green đặc hiệu cho các trình tự DNA tại tâm động của nhiễm sắc thể 17 (CEP17). Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 175 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Luôn luôn cắt hai tiêu bản song song, nhuộm H&E và làm FISH. Trên tiêu bản H&E xác định chính xác vùng tế bào ung thư xâm lấn, đối chiếu với tiêu bản thực hiện FISH. Mẫu được cắt mỏng 4-μm, gắn lên tiêu bản đã được tráng organosilane. Số tín hiệu màu xanh lá cây sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội, và đa bội. Phương pháp thông kê Sử dụng phần mềm SPSS 17.0. KẾT QUẢ Khử protein màng nhân trong dung dịch Sau khi loại bỏ những trường hợp không đạt yêu cầu (tín hiệu huỳnh quang không rõ ràng), chúng tôi khảo sát 264 mẫu ung thư vú được làm đồng thời HMMD và FISH, được kết quả như sau: protease ở 37°C trong 6-7’, tùy mẫu (thay vì 10’, Các đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu theo quy định trong bao bì). Tuổi: tuổi trung bình 50,8 ± 11,1, trung vị 50 tuổi Khử sáp. Pretreate trong axit Clohydric 0.2N và natri thiocyanate theo quy định. Sau khi rửa, các tiêu bản được cố định trong formalin đệm trung tính 10’. Rửa sạch, sấy khô. Lai với hỗn hợp đoạn dò kép HER2/CEP17 trong vòng 18 giờ. Rửa sau lai, sấy khô, nhuộm tương phản nền với DAPI. Bảo quản tiêu bản ở -20°C và được khảo sát trong vòng 24 giờ. Cách đánh giá tiêu bản FISH Chúng tôi khảo sát FISH theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tín hiệu Spectrum Orange và Spectrum Green được đếm trong 20 nhân tế bào ung thư xâm lấn không chồng chất, trường hợp tỉ lệ chưa phân định được khuếch đại hay không hoặc giáp biên, chúng tôi đếm 40 nhân, 60 nhân ung thư. Tổng số tín hiệu màu cam (HER2) và tín hiệu màu xanh lá cây (CEP17) được ghi nhận và tính tỷ lệ HER2/CEP17. -Tỉ lệ HER2/CEP17 < 2,0: không khuếch đại. -Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 2,0: khuếch đại. -2,0 ≤ Tỉ lệ HER2/CEP17 < 2,5: khuếch đại GIÁP BIÊN. -2,5 < Tỉ lệ HER2/CEP17 < 5: khuếch đại THẤP. Nhóm tuổi Số ca Tỉ lệ % 20-29 4 1,5 30-39 32 12,1 40-49 86 32,6 50-59 94 35,6 60-69 26 9,8 70-79 18 6,8 >80 4 1,5 Tổng cộng 264 100,0 Loại Số ca Tỉ lệ NOS 244 92,4 Tiểu thùy 6 2,3 Nhú 4 1,5 Bã khô 4 1,5 Nhầy 6 2,3 Tổng cộng 264 100,0 Phân độ mô học ung thư Phân độ mô học: trong nhóm 244 ca NOS được đánh giá độ mô học theo bảng sau: Độ mô học Số ca Tỉ lệ NOS độ1 2 ,8 NOS độ 2 90 36,9 NOS độ 3 152 62,3 Tổng cộng 244 100,0 -Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 5: khuếch đại CAO. 176 Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Kết quả hóa mô miễn dịch Bảng 1: Kết quả hóa mô miễn dịch Nghiên cứu Y học Kết quả FISH Số trường hợp Tỉ lệ % Không khuếch đại 177 67,0 HMMD Số trường hợp Tỉ lệ % Khuếch đại giáp biên 16 6,1 Âm tính 159 60,2 Khuếch đại thấp 25 9,5 2+ 34 12,9 Khuếch đại cao 46 17,4 3+ 71 26,9 Tổng cộng 264 100,0 Tổng cộng 264 100 Tỉ lệ dương tính 3(+) là 71 trường hợp (26,9%), nếu xem cả những trường hợp 2(+) là dương tính thì tỉ lệ HER2 (+) trên HMMD là 39,8%. Không khuếch đại gen HER2 là 67% và khuếch đại là 33%. Tỉ lệ HER2/CEP17 = 2,0 là ngưỡng để đánh giá có khuếch đại. Khuếch đại giáp biên 16 trường hợp (6,1%). Kết quả FISH Khuếch đại thấp 25 trường hợp (9,5%). Bảng 2. Kết quả FISH Khuếch đại cao 46 trường hợp (17,4%). Tương hợp giữa hai kết quả Kết quả FISH Âm tính Kết quả HMMD 2+ 3+ Tổng cộng Không khuếch đại Khuếch đại giáp biên Khuếch đại thấp Khuếch đại cao Tổng cộng Số ca 153 4 2 0 159 % IHC 96,2 2,5 1,3 0 100 Số ca 22 8 2 2 34 % IHC 64,7 23,5 5,9 5,9 100 Số ca 2 4 21 44 71 % IHC 2,8 5,6 29,6 62,0 100 Số ca 177 16 25 46 264 % IHC 67,0 6,1 9,5 17,4 100 Cramer’s V = 0,649 với p= 0,001 Đánh giá sự tương quan giữa hai kết quả của HER22(+)/HMMD. hai phương pháp HMMD và FISH, chúng tôi Nhóm HMMD âm tính có 6/159 trường hợp dùng phép thống kê Cramer’s V là phương khuếch đại gen HER2 chiếm 3,8%, trong đó có 2 pháp thông kê đánh giá mức độ quan hệ mật trường hợp khuếch đại thấp và 4 trường hợp thiết của hai mẫu. Thống kê Cramer’s V có hai khuếch đại giáp biên, không có khuếch đại cao. giá trị 0 và 1, giá trị 0 cho biết không có mối Nhóm HMMD 3(+) có 2/71 trường hợp quan hệ nào và giá trị 1 cho biết mối quan hệ không khuếch đại gen HER2 chiếm 2,8% và giữa hai phương pháp là hoàn hảo. khuếch đại cao 62%. Trong nghiên cứu này, Cramer’s V = 0,649 Nhóm HMMD 2(+) đây là nhóm khó tiên với p=0,001, cho thấy mối quan hệ giữa hai đoán có khuếch đại gen hay không, bắt buộc phương pháp này tương quan khá và giữa hai phải làm thêm FISH. Trong nhóm này có 12/34 phương pháp có sự khác biệt nhỏ về xác định khuếch đại gen HER2 chiếm 35,3%. tình trạng HER2, đặc biệt là nhóm Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Cấp Cứu Trưng Vương 177 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học So sánh tỉ lệ đa bội nhiễm sắc thể 17 với HMMD Bảng 4 So sánh tỉ lệ đa bội nhiễm sắc thể 17 với HMMD Số trường hợp Tỉ lệ % Âm tính 7 58,4 3+ 5 41,6 Tổng cộng 12 100 Tỉ lệ đa bội nhiễm sắc thể 17: 12/264 trường hợp, chiếm 4,5%. So sánh trung bình bản sao HER2 với tỉ lệ HER2/CEP17 Bảng 5 So sánh trung bình tín hiệu HER2 với tỉ lệ HER2/CEP17 Trung bình bản sao HER2/nhân ≤4 >4 Tổng cộng Không Số ca khuếch đại % 165 12 178 92,7% 7,3% 100 Khuếch đại Số ca 0 87 86 0% 100,0% 100 165 99 264 62,4% 37,5% 100 % Tổng cộng Số ca % Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng bộ kít Path Vysion, đánh giá đồng thời cả HER2 và CEP 17. Mục đích chính của nghiên cứu không phải là so sánh sự khuếch đại gen giữa các phương pháp, nhưng chúng tôi cung cấp số liệu này để cho thấy sự cần thiết phải chọn những bộ kít có cùng đánh giá CEP 17 và HER2, Nếu như định nghĩa là số bản sao HER2/nhân ≥ 4 được xem là trị số tuyệt đối(30) có khuếch đại gen thì trong nghiên cứu này có đến 99 trường hợp. Sau khi tính tỉ lệ số bản sao HER2/CEP17 thì kết quả có 13/94 trường hợp là không khuếch đại do tỉ lệ HER2/CEP17