So sánh trình tự gen GmDREB1 của hai giống đậu tương địa phương Cúc vàng Yên Sơn và Cúc lông Phú Bình

Chu Hoàng Mậu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 85(09)/2: 125 - 130<br /> <br /> SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB1 CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG<br /> ĐỊA PHƢƠNG CÚC VÀNG YÊN SƠN VÀ CÚC LÔNG PHÚ BÌNH<br /> Chu Hoàng Mậu1*, Nguyễn Vũ Thanh Thanh 2,<br /> Phạm Minh Duy2, Hoàng Văn Mạnh3<br /> 1*<br /> <br /> Đại học Thái Nguyên, 2 Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên,<br /> 3<br /> Viện Khoa học sự sống - ĐH Thái Nguyên<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Nhân tố phiên mã DREB là loại protein liên kết đƣợc tổng hợp đáp ứng tình trạng mất nƣớc, có<br /> thể tƣơng tác với yếu tố đáp ứng sự khử nƣớc có trình tự lặp lại C (DRE / CRT), chứa trong vùng<br /> promoter của nhiều gen cảm ứng với stress từ ngoại cảnh và do đó có thể kiểm soát sự biểu hiện<br /> của các gen này ở thực vật, làm tăng khả năng chịu hạn, chịu nhiệt độ thấp và chịu nồng độ muối<br /> cao. Yếu tố đáp ứng sự mất nƣớc (DRE) với trình tự lõi A / GCCGAC và yếu tố CRT đƣợc xác<br /> định là một nhân tố tác động cis quan trọng trong biểu hiện của nhóm gen chịu hạn, chịu lạnh và<br /> chịu muối. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả so sánh trình tự gen GmDREB1<br /> của hai giống đậu tƣơng địa phƣơng (Cúc Vàng Yên Sơn-CYS và Cúc lông Phú Bình-CPB) có<br /> khả năng chịu hạn khác nhau. Đoạn mã hóa của gen GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CYS dài 704<br /> bp, còn đoạn mã hóa của gen GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CPB dài 705 bp. So sánh trình tự<br /> nucleotide cho thấy, hệ số tƣơng đồng về gen GmDREB1 của 2 giống đậu tƣơng nghiên cứu là<br /> 99,2%. Độ tƣơng đồng về trình tự amino acid trong protein GmDREB1 ở hai giống đậu tƣơng<br /> CYS và CPB là 98,2%. Cần tiếp tục nghiên cứu về gen GmDREB1 làm cơ sở cho việc xác định<br /> chỉ thị phân tử và thiết kế vector mang cấu trúc gen GmDREB1 nhằm phục vụ chuyển gen tạo<br /> cây đậu tƣơng có khả năng chịu hạn tốt.<br /> Từ khoá: đậu tương địa phương, chịu hạn, gen GmDREB1, Glycine max, nhân tố phiên mã.<br /> <br /> MỞ ĐẦU*<br /> Nhóm gen mã hoá các protein DREB-nhân tố<br /> tham gia quá trình phiên mã đƣợc cho rằng có<br /> liên quan đến khả năng chịu hạn của thực vật<br /> nói chung và của đậu tƣơng nói riêng . Nhóm<br /> DREB có trình tƣ̣ cis : DRY, A/GCCGAC.<br /> Hai nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã DREB 1<br /> và DREB 2 bám đặc hiệu vào trình tự DRY .<br /> Nhóm DREB1 điều khiển tính chịu hạn , mặn<br /> và lạnh. Năm 2004, Chen và đtg đã phân lập<br /> gen DREB1 ở đậu tƣơng từ mRNA và đăng<br /> ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số<br /> AY802779, chiều dài của gen vùng mã hóa<br /> amino acid dài 705 bp [2]. Năm 2009, nhóm<br /> tác giả Charlson và đtg đã nghiên cứu phân<br /> lập gen DREB1 ở đậu tƣơng từ DNA tổng số<br /> có kích thƣớc 705 bp với mã số FJ965342<br /> trên NCBI [1].<br /> Năm 2010, Stolf-Moreira và đtg đã xác định<br /> mức độ biểu hiện của nhân tố phiên mã<br /> GmDREB1 của đậu tƣơng trong điều kiện hạn<br /> [7]. Trình tự gen GmDREB1 của giống đậu<br /> *<br /> <br /> tƣơng Xanh lơ - Ba bể (Bắc Kạn) với kích<br /> thƣớc 717 bp, vùng mã hóa amino acid dài<br /> 705 bp cũng đã đƣợc nhóm chúng tôi phân<br /> lập, xác định trình tự và đăng ký trên Ngân<br /> hàng gen quốc tế [4]. Với định hƣớng nghiên<br /> cứu tìm kiếm sự sai khác trong cấu trúc gen<br /> GmDREB1 ở các giống đậu tƣơng có khả<br /> năng chịu hạn khác nhau, trong nghiên cứu<br /> này chúng tôi trình bày kết quả so sánh trình<br /> tự gen GmDREB1 của hai giống đậu tƣơng<br /> địa phƣơng (Vàng Ngân Sơn-CYS và Cúc<br /> lông Phú Bình-CPB) có khả năng chịu hạn<br /> khác nhau. Đoạn mã hóa của gen GmDREB1<br /> ở giống đậu tƣơng CYS dài 704 bp, còn đoạn<br /> mã hóa của gen GmDREB1 ở giống đậu<br /> tƣơng CPB dài 705 bp. So sánh trình tự<br /> nucleotide cho thấy, hệ số tƣơng đồng về gen<br /> GmDREB1 của 2 giống đậu tƣơng nghiên cứu<br /> là 99,2%. Độ tƣơng đồng về trình tự amino<br /> acid trong protein GmDREB1 ở hai giống đậu<br /> tƣơng CYS và CPB là 98,2%.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Tel: 0913.383.289; Email: mauchdhtn@gmail.com<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 125<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Chu Hoàng Mậu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Sƣ̉ dụng hạt của giống đậu tƣơng đị a phƣơng<br /> Cúc Vàng Yên Sơn-Tuyên Quang (CYS) và<br /> Cúc lông Phú Bình-Thái Nguyên (CPB) do<br /> Viện nghiên cƣ́u Ngô Đan Phƣợng cung cấp<br /> năm 2009 làm vật liệu nghiên cứu.<br /> Tách chiết DNA tổng số theo Gawel và Jarret<br /> (1991) [ 4], nhân gen DREB 1 bằng kỹ thuật<br /> PCR với cặp mồi DREB 1soyF/DREB1soyR<br /> đƣợc thiết kế dƣ̣a trên trình tự củ a hai gen<br /> mang mã số AY 802779 và FJ 965342 trên<br /> Ngân hàng gen quốc tế (NCBI). Trình tự cặp<br /> mồi là:<br /> Tên mồi<br /> DREB1soyF<br /> DREB1soyR<br /> <br /> Trình tự mồi<br /> <br /> 85(09)/2: 125 - 130<br /> <br /> Để phục vụ việc nhân gen DREB1, chúng tôi<br /> tách DNA tổng số từ hệ gen của hai giống đậu<br /> tƣơng nói trên. Kết quả tách DNA đạt chất<br /> lƣợng tốt, hàm lƣợng đủ để làm các nghiên<br /> cứu tiếp theo.<br /> Sau 30 chu kỳ phản ƣ́ng, sản phẩm PCR đƣợc<br /> kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.<br /> Kết quả điện di đã nhận đƣợc một đoạn DNA<br /> đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 717 bp (hình<br /> 1), hàm lƣợng của sản phẩm PCR đủ lớn để<br /> thực hiện việc tách dòng gen DREB1. Độ dài<br /> của đoạn DNA vừa nhân đƣợc cũng phù hợp<br /> với lý thuyết khi chúng tôi thiết kế mồi.<br /> <br /> 5’ GGA TCC ATG TTT ACC TTG AAT C 3’<br /> 5’ GAA TTC TTA AAT TGA GAA ATT CCA 3’<br /> <br /> Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel<br /> agarose 1,0% trong đệm TAE 1X với sƣ̣ có<br /> mặt của marker chuẩn , nhuộm bản gel trong<br /> ethydium bromide và soi dƣới ánh đèn cƣ̣c<br /> tím. Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch (thôi gel)<br /> bằng bộ kít AccuPrep PCR Purification<br /> (Bioneer-Hàn Quốc). Sản phẩm sau khi tinh<br /> sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách<br /> dòng pBT và sau đó biến nạp vào tế bào khả<br /> biến E.coli chủng DH5α. Sau khi kiểm tra sản<br /> phẩm chọn dòng bằng phản ứng clony-PCR,<br /> plasmid đƣợc tách bằng bộ Kit AccuPrep<br /> Plasmid mini Extraction.<br /> Trình tự nucleotide của gen GmDREB1 đƣợc<br /> xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tƣ̣<br /> động tại Viện Công nghệ sinh học.<br /> Kết quả xác định và so sánh trình tự<br /> nucleotide đƣợc xƣ̉ lí bằng phần mềm<br /> BioEdit, DNAstar.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Nhằm xác định chỉ thị phân tử liên quan đến<br /> khả năng chịu hạn, chúng tôi lựa chọn 2 giống<br /> đậu tƣơng địa phƣơng đã đƣợc đánh giá khả<br /> năng chịu hạn: Cúc Vàng Yên Sơn (chịu hạn<br /> tốt với chỉ số chịu hạn tƣơng đối là 13574,77)<br /> và giống Cúc lông Phú Bình (chịu hạn kém<br /> với chỉ số chịu hạn tƣơng đối là 5704,44) [4]<br /> để nghiên cứu phân lập và so sánh trình tự<br /> gen GmDREB1.<br /> Kết quả nhân gen DREB1 ở hai giống đậu<br /> tƣơng đị a phƣơng CYS và CPB<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> M<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 717 bp<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen<br /> GmDREB1 (M: marker 1 kb; 1. CYS; 2. CPB)<br /> <br /> Kết quả tách dòng gen DREB1 ở hai giống<br /> đậu tƣơng đị a phƣơng CYS và CPB<br /> Để xác định đƣợc trình tự gen GmDREB1,<br /> chúng tôi tiến hành tách dòng gen GmDREB1<br /> của 2 giống đậu tƣơng nghiên cứu. Sản phẩm<br /> PCR thu nhận ở trên đƣợc tiếp tục tinh sạch<br /> và ghép nối vào vector tách ḍng pBT nhờ<br /> enzym nối T4 ligase. Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C<br /> trong một giờ cho phản ứng xảy ra hoàn toàn,<br /> sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến<br /> chủng E.coli chủng DH5α và đƣợc cấy trải<br /> trên môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm<br /> men, NaCl, agarose) có bổ sung kháng sinh<br /> ampicillin (50µg/ml), X-gal (40mg/l) và<br /> IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ.<br /> Kết quả thu đƣợc có cả khuẩn lạc màu xanh<br /> và màu trắng. Chúng tôi lựa chọn các khuẩn<br /> lạc trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có<br /> kháng sinh ampicillin với nồng độ 50µg/ml,<br /> 126<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Chu Hoàng Mậu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> tốc độ lắc 200 vòng/phút ở 37 C, qua đêm. Tế<br /> bào tái tổ hợp đƣợc thu lại bằng cách ly tâm<br /> và tách chiết plasmid tái tổ hợp. Sau đó kiểm<br /> tra sản phẩm DNA plasmid bằng enzym giới<br /> hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel<br /> agarose 1%. Kết quả tách dòng gen GmDREB1<br /> cho thấy, băng 2700 bp là băng của vector pBT<br /> còn băng 717 bp là băng của gen GmDREB1.<br /> Sản phẩm tách plasmid đúng kích thƣớc, đảm<br /> bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ cho việc<br /> xác định trình tự nucleotide. Để khẳng định<br /> chính xác băng 717 bp là gen GmDREB1<br /> chúng tôi tiếp tục đọc trình tự gen này.<br /> Kết quả xác định và so sánh trình tự<br /> nucleotide của gen GmDREB1 ở hai giống<br /> đậu tƣơng đị a phƣơng CYS và CPB<br /> Để xác định chính xác trình tự nucleotide của<br /> gen GmDREB1 đã đƣợc tách dòng, chúng tôi<br /> tiến hành gửi đọc trình tự nucleotide trên máy<br /> 0<br /> <br /> 85(09)/2: 125 - 130<br /> <br /> đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@<br /> 3100 Advant Genetic Analyzer . Kết quả xác<br /> định trình tự đƣợc so sánh trên BLAST của<br /> Ngân hàng gen NCBI cho thấy, trình tự gen<br /> GmDREB1 mà chúng tôi phân lập có độ<br /> tƣơng đồng cao (trên 90%) so với trình tự gen<br /> GmDREB1 trên NCBI. Nhƣ vậy, trình tự gen<br /> GmDREB1 của 2 mẫu nghiên cứu đã đƣợc<br /> xác định chính xác.<br /> Sau khi so sánh trình tự gen, chúng tôi nhận<br /> đƣợc đoạn mã hóa của gen GmDREB1 ở hai<br /> mẫu đậu tƣơng CYS và CPB có chiều dài lần<br /> lƣợt là 704 bp (CYS) và 705 bp (CPB).<br /> Để xác định sự khác biệt về trình tự<br /> nucleotide, chúng tôi tiến hành so sánh trình<br /> tƣ̣ nucleotide của gen GmDREB1 phân lập từ<br /> hai giống đậu t ƣơng CYS và CPB. Mức độ<br /> tƣơng đồng về trình tự nucleotide đƣợc thể<br /> hiện ở hình 2.<br /> <br /> Hình 2. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB1 ở hai giống đậu tƣơng đị a phƣơng CYS và CPB<br /> <br /> Khi so sánh trình tự nucleotide của gen<br /> GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CYS và CPB,<br /> chúng tôi nhận thấy trình tự nucleotide của<br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> hai mẫu nghiên cứu có độ tƣơng đồng cao với<br /> hệ số tƣơng đồng là 99,2%. Trình tự<br /> nucleotide của giống đậu tƣơng CYS và CPB<br /> 127<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Chu Hoàng Mậu và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> chỉ sai khác 5 vị trí lần lƣợt là 60, 627, 634,<br /> 678, 700 (bảng 1).<br /> Bảng 1. Vị trí khác biệt về trình tự nucleotide của<br /> gen GmDREB1 ở CYS và CPB<br /> CPB<br /> CYS<br /> <br /> 60<br /> T<br /> C<br /> <br /> 627<br /> T<br /> G<br /> <br /> 634<br /> G<br /> C<br /> <br /> 678<br /> G<br /> T<br /> <br /> 700<br /> A<br /> -<br /> <br /> Đặc biệt, ở vị trí 700, giống CPB là<br /> nucleotide A còn giống CYS bị thiếu hụt mất<br /> nucleotide ở vị trí này nên kích thƣớc đoạn<br /> mã hóa của gen GmDREB1 ở giống CYS dài<br /> 704 bp, còn đoạn mã hóa của giống CPB dài<br /> 705 bp. Trình tự amino acid trong protein<br /> GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CYS với giống<br /> CPB đều dài 234 amino acid.<br /> So sánh trình tự amino acid trong protein của<br /> gen GmDREB1 ở giống đậu tƣơng CYS với<br /> giống CPB cho kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.<br /> <br /> 85(09)/2: 125 - 130<br /> <br /> Dựa trên dữ liệu về trình tự gen GmDREB1<br /> của 5 mẫu ở trên, chúng tôi thiết lập sơ đồ<br /> hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của<br /> năm giống đậu tƣơng (hình 4).<br /> Kết quả cho thấy, 5 giống đậu tƣơng đƣợc<br /> chia thành 3 nhóm: nhóm 1 gồm 3 mẫu<br /> AY802779, FJ965342, FR822736; nhóm 2<br /> chỉ có giống CPB; nhóm 3 chỉ có giống CYS.<br /> Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn<br /> trong protein GmDREB1 của 5 mẫu trên cho<br /> thấy hệ số trƣơng đồng về amino acid trong<br /> protein GmDREB1 tƣơng đối cao (97% 100%), trong đó CPB tƣơng đồng 100% so<br /> với FJ965342.<br /> Khi thiết lập hình cây, chúng tôi nhận đƣợc<br /> hình cây mô tả quan hệ di truyền của các mẫu<br /> có sự khác biệt với khi so sánh trình tự<br /> nucleotide (hình 5).<br /> <br /> Hình 3. So sánh trình tự amino acid trong protein GmDREB1 ở giống đậu tƣơng VNS và CPB<br /> AY802779.seq<br /> FR822736.seq<br /> FJ965342.seq<br /> CPB.seq<br /> CYS.s eq<br /> <br /> 0.4<br /> 0<br /> Nucleotide Substitutions (x100)<br /> <br /> Hình 4. Mối quan hệ di truyền của các giống đậu tƣơng dựa trên phân tích trình tự nucleotide<br /> của gen GmDREB1<br /> Bảng 3. Hệ số tƣơng đồng về amino acid trong protein DREB1 của CPB, CYS, FJ965342, AY802779,<br /> FR822736<br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 128<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Chu Hoàng Mậu và Đtg<br /> CPB<br /> CYS<br /> FJ965342<br /> AY802779<br /> FR822736<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> CPB<br /> 100<br /> <br /> CYS<br /> 98,2<br /> 100<br /> <br /> FJ965342<br /> 100<br /> 98,2<br /> 100<br /> <br /> 85(09)/2: 125 - 130<br /> <br /> AY802779<br /> 99,5<br /> 97,8<br /> 99,5<br /> 100<br /> <br /> FR822736<br /> 98,7<br /> 97,0<br /> 98,7<br /> 98,2<br /> 100<br /> <br /> FR822736.pro<br /> CPB.pro<br /> AY802779.pro<br /> FJ965342.pro<br /> CYS.pro<br /> <br /> 1.3<br /> 0<br /> Nucleotide Substitutions (x100)<br /> <br /> Hình 5. Mối quan hệ di truyền của các giống đậu tƣơng dựa trên phân tích trình tự amino acid<br /> trong protein GmDREB1<br /> <br /> Hình 5 cho thấy, 5 mẫu so sánh trình tự<br /> amino acid trong protein GmDREB1 chia<br /> thành 2 nhóm: nhóm 1 gồm 4 mẫu<br /> AY802779, FJ965342, FR822736, CPB;<br /> nhóm 2 chỉ có mẫu CYS.<br /> Sự khác biệt về trình tự nucleotide và trình tự<br /> amino acid nói trên là cơ sở để chúng tôi mở<br /> rộng nghiên cứu về gen GmDREB1 ở các giống<br /> đậu tƣơng có khả năng chịu hạn khác nhau<br /> nhằm xác định chỉ thị phân tử phục vụ cho công<br /> tác chọn tạo giống đậu tƣơng chịu hạn.<br /> KẾT LUẬN<br /> Đã khuếch đại, chọn dòng và đọc trình tự<br /> đƣợc gen GmDREB1 của hai giống đậu tƣơng<br /> CYS (chiều dài là 704 bp) và CPB (chiều dài<br /> là 705 bp). Độ tƣơng đồng giữa trình tự gen<br /> GmDREB1 của giống đậu tƣơng CYS và CPB<br /> là 99,2%. Độ tƣơng đồng về trình tự amino<br /> acid trong protein GmDREB1 ở hai giống đậu<br /> tƣơng CYS và CPB là 98,2%. Thiết lập đƣợc<br /> sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền<br /> của 2 giống đậu tƣơng nghiên cứu với một số<br /> đậu tƣơng dựa trên các trình tự gen<br /> GmDREB1 và trình tự amino acid do gen<br /> GmDREB1 mã hoá trên Ngân hàng gen<br /> NCBI.<br /> LỜI CẢM ƠN: Công trình được thực hiện với<br /> sự hỗ trợ kinh phí của đề tài thuộc Dự án<br /> TRIG.<br /> <br /> [1]. Charlson D.V., Hu X., Okimoto B. và Purcell<br /> L.C. (2009), Glycine max cultivar Jackson drought<br /> responsive element binding. NCBI, Accession<br /> FJ965342,<br /> http://www.ncbi.nlm.nih.gov.<br /> [2]. Chen Y., Chen P. and de los Reyes B.G.<br /> (2004), Analysis of the expression of DREB1 gene<br /> orthologs in cultivated and wild species of<br /> soybean.<br /> NCBI,<br /> Accession<br /> AY802779,<br /> Http://www.ncbi.nlm.nih.gov.<br /> [3]. Gawel N. J., Jarret R. L., 1991: Genomic<br /> DNA<br /> isolation.<br /> http://www.<br /> Weihenstephan.de/pbpz/bambra/html/dna.htmn<br /> [4]. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh,<br /> Nguyễn Thị Minh Hồng, Hoàng Văn Mạnh, 2011,<br /> Đặc điểm của gien DREB1 phân lập từ giống đậu<br /> tƣơng địa phƣơng Glycine max (L.) Merrill) Xanh lơ<br /> Ba Bể (Bắc Kạn), Tạp chí sinh học, 33(1): 74-79.<br /> [5]. Stolf-Moreira R, Medri ME, Neumaier N,<br /> Lemos NG, Brogin RL, Marcelino FC, de Oliveira<br /> MC, Farias JR, Abdelnoor RV, Nepomuceno AL.,<br /> 2010: Genet Mol Res., 9(2):858-67.<br /> [6]. Nguyen, T.V.T., Chu, M.H., Hoang, M.V.<br /> and Nguyen, H.T.M. (2011), Glycine max cv.<br /> Xanhlo-Babe DREB1 gene for drought<br /> responsive. NCBI, Accession FR822736, .<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> 129<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br />