zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Báo cáo khoa học

Sử dụng Multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter Pylori

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Báo xấu

110
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cho đến nay, các nhà nghiên cứu đều thống nhất cho rằng, gần một nửa dân số trên thế giới bị nhiễm vi khuẩn Helicobacter pylori [7,2]. Loại vi khuẩn Gram-âm này đã gây ra rất nhiều rối loạn nghiêm trọng về tiêu hoá, bao gồm viêm loét dạ dày và hành tá tràng với biểu hiện nặng nhất là ung th− dạ dày [4]. Cũng như nhiều năm trước đây, ngày nay, việc phát hiện và chẩn đoán các bệnh do nhiễm khuẩn Helicobacter pylori vẫn còn là mối quan tâm của các nhà khoa học, vì vi khuẩn hết...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sử dụng Multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter Pylori

TCNCYH 22 (2) - 2003 Sö dông multiplex PCR ®Ó ph¸t hiÖn vi khuÈn Helicobacter pylori NguyÔn ThÞ Thanh Lîi vµ NguyÔn ThÞ Hång H¹nh ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc - Trung t©m Khoa häc tù nhiªn vµ C«ng nghÖ quèc gia ë ViÖt Nam, vi khuÈn Helicobacter pylori cã thÓ mang c¸c kiÓu gien kh¸c nhau do gien cã thÓ bÞ ®ét biÕn hoÆc khiÕm khuyÕt. V× thÕ, viÖc ph¸t hiÖn chóng b»ng nh©n b¶n mét gien (PCR ®¬n) cã thÓ cho c¸c kÕt qu¶ ©m tÝnh gi¶. Multiplex PCR nh»m khuyÕch ®¹i ba gien m· ho¸ cho c¸c protein ®éc tÝnh CagA, Urease B vµ HP1125 cña vi khuÈn Helicobacter pylori ®· ®−îc nghiªn cøu vµ cã thÓ sö dông trong thùc tÕ l©m sµng ë ViÖt Nam. I. §Æt vÊn ®Ò mét protein mµng ngoµi cña vi khuÈn - ®−îc lùa chän cho thö nghiÖm. Cho ®Õn nay, c¸c nhµ nghiªn cøu ®Òu thèng nhÊt cho r»ng, gÇn mét nöa d©n sè trªn thÕ giíi Môc tiªu nghiªn cøu lµ ®¸nh gi¸ kh¶ n¨ng bÞ nhiÔm vi khuÈn Helicobacter pylori [7,2]. sö dông Multipex PCR trong chÈn ®o¸n vi khuÈn Helicobacter pylori trong c¸c mÉu bÖnh Lo¹i vi khuÈn Gram-©m nµy ®· g©y ra rÊt nhiÒu rèi lo¹n nghiªm träng vÒ tiªu ho¸, bao gåm phÈm cña bÖnh nh©n. viªm loÐt d¹ dµy vµ hµnh t¸ trµng víi biÓu hiÖn II. §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nÆng nhÊt lµ ung th− d¹ dµy [4]. nghiªn cøu Còng nh− nhiÒu n¨m tr−íc ®©y, ngµy nay, 1. §èi t−îng viÖc ph¸t hiÖn vµ chÈn ®o¸n c¸c bÖnh do nhiÔm Sinh thiÕt cña ng−êi bÖnh bÞ loÐt d¹ dµy khuÈn Helicobacter pylori vÉn cßn lµ mèi quan ch−a qua ®iÒu trÞ kh¸ng sinh ®−îc lÊy b»ng t©m cña c¸c nhµ khoa häc, v× vi khuÈn hÕt søc m¸y néi soi èng mÒm 2T-10 (Olympus-NhËt ®a d¹ng vÒ mÆt sinh häc [3,5]. Mét vµi nghiªn b¶n) vµ ®−îc gi÷ trong m«i tr−êng vËn chuyÓn cøu cho thÊy, nÕu c¸c cÆp primers thiÕt kÕ cho (theo Seelinger H.P.J vµ Schroter G.,1990) vµ ph¶n øng PCR ®Ó ph¸t hiÖn vi khuÈn H. pylori ®−îc b¶o qu¶n ë -800C. ë c¸c n−íc ph−¬ng T©y kh«ng hiÖu lùc khi ph¸t 2. Ph−¬ng ph¸p hiÖn c¸c chñng ch©u ¸ [8]. 2.1. Ph©n lËp vi khuÈn Helicobacter pylori ë ViÖt Nam, vi khuÈn Helicobacter pylori, tõ sinh thiÕt bÖnh nh©n. theo nghiªn cøu ®−îc ph©n lËp tõ c¸c bÖnh Sinh thiÕt cña bÖnh nh©n ®−îc nghiÒn kü, nh©n cã thÓ khiÕm khuyÕt gien cagA hoÆc gien sau ®ã dÞch nghiÒn ®−îc cÊy lªn m«i tr−êng Urease B [6]. Do thÕ, nÕu chØ tiÕn hµnh PCR th¹ch ®Æc tr−ng cho vi khuÈn H.pylori cã chøa ®¬n ®Ó nh»m ph¸t hiÖn mét gien th× c¸c kÕt qu¶ 7% m¸u ngùa vµ mét sè chÊt kh¸c nh− kh¸ng ©m tÝnh gi¶ cã thÓ x¶y ra. §Ó kh¾c phôc nh−îc sinh [2]. §Üa cã vi khuÈn ®−îc ®Æt trong b×nh vi ®iÓm nµy chóng t«i ®Ò nghÞ sö dông Multiplex hiÕu khÝ cña h·ng BBL (Becton Dickinson PCR ®Ó khuyÕch ®¹i ®ång thêi nhiÒu gien trong Microbiology System, Cockeysville) ë 370C. mét èng nghiÖm. Ph−¬ng ph¸p nµy cã −u ®iÓm Sau 48-72 ngµy, thu thËp vi khuÈn (chñng lµ nhanh, rÎ tiÒn vµ cho nhiÒu th«ng tin vÒ vi VNH-85) cho c¸c nghiªn cøu tiÕp theo. khuÈn h¬n lµ PCR ®¬n, ba gien m· hãa cho ba protein bÖnh lý: UreaseB, CagA vµ HP1125 - C«ng tr×nh nghiªn cøu nµy ®−îc thùc hiÖn t¹i ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc- Trung t©m Khoa häc tù nhiªn vµ C«ng nghÖ quèc gia. 1
TCNCYH 22 (2) - 2003 2.2. T¸ch chiÕt ADN tõ vi khuÈn vµ sinh F3:5’-CAG-CAT-ATG-AAA-AAG-ATT- thiÕt bÖnh nh©n. AGC-AG-3’ *) Tõ vi khuÈn: Vi khuÈn H. pylori ®−îc thu F4:5’-AAT-GCT-AAA-GAG-TTG-CGC- thËp tõ ®Üa nu«i cÊy vµ röa 2 lÇn b»ng 1xPBS. CAA-G-3’ T¸ch ADN cña vi khuÈn b»ng chÕ phÈm sinh Chu tr×nh nhiÖt cña ph¶n øng: 940C 1 phót., häc QIAmp Tissue Kit. 580C 1 phót., 720C 1 phót *) Tõ sinh thiÕt bÖnh nh©n: BÖnh phÈm ®−îc LÆp l¹i 35 –40 chu kú. nghiÒn trong dung dÞch 1 x PBS, sau ®ã ®−îc ñ +) Gien Hp1125 víi Proteinase CÆp måi ®−îc sö dông ®Ó khuyÕch ®¹i 540 K 20mg/ml ë 370C trong 2 giê. Sau khi bp cña ®Çu 5’ cña gien cã tr×nh tù lµ: ®−îc phenol ho¸ ®Ó lo¹i protein, ADN ®−îc tña L:5’-ATG-AAG-AGA-TCT-TCT-GTA- b»ng cån tuyÖt ®èi cã bæ sung Natri axetate TTT-AGT-T-3’ ®Õn nång ®é cuèi cïng 0,3M. §é s¹ch cña ADN ®−îc kiÓm tra b»ng ph−¬ng ph¸p ®iÖn di R:5’-TTA-CTT-CAC-TAA-TTT-GAT- trªn gel agaroza 0,8%., dung dÞch ®Öm 1xTAE. CCA-CT-3’ 2.3. PCR ®¬n vµ Multiplex PCR Chu tr×nh nhiÖt cña ph¶n øng: 940C 1 phót *) PCR ®¬n 550C 1 phót 5-10ng ADN ®−îc dïng lµm khu«n mÉu 720C 1 phót cho ph¶n øng khuyÕch ®¹i gien cagA+, Urease LÆp l¹i 35-40 chu kú. B vµ Hp1125. Ph¶n øng ®−îc thùc hiÖn trªn S¶n phÈm PCR cña tõng gen trªn ®−îc kiÓm m¸y PTC-100TM Programmable Thermal tra trªn gel agaroza 0,8%. §Öm ®iÖn di 1xTAE controller. *) Multiplex PCR +) Gien cagA+: Ph¶n øng ®−îc thùc hiÖn víi sù cã mÆt c¶ 3 CÆp måi F1, F2 ®−îc dïng ®Ó khuyÕch ®¹i cÆp måi cña 3 gien: cagA+, Urease B, Hp1125. ®Çu 5’ gien cagA+ kÝch th−íc 460 bp cã tr×nh tù Ph¶n øng PCR ®−îc tèi −u ho¸ trong thÓ tÝch sau: 25µl: 5ng ADN tæng sè ®−îc dïng lµm khu«n F1:5’-ACC-ATT-GAT-CAA-ACA-ACA- cho ph¶n øng, 1µM cña mçi cÆp måi, 2,5µl cña ACA-CC-3’ 10 x dÞch ®Öm, 200µM cña mçi dNTP, 2,5 ®¬n F2:5’-AGG-GGG-TTG-TAT-GAT-ATT- vÞ AmpliTaq DNA polymerase, thªm H2O (khö TTC-CAT-3’ ion vµ ®· khö trïng) ®Õn 25µl. Chu tr×nh nhiÖt cña ph¶n øng: Chu tr×nh nhiÖt cña ph¶n øng: 940C 1 phót 940C 1phót 580C 1 phót 500C 1 phót 30 gi©y 720C 1 phót 720C 2 phót LÆp l¹i 35-40 chu kú. LÆp l¹i 35 –40 chu kú. +) Gien ureaseB S¶n phÈm cña ph¶n øng Multiplex PCR CÆp måi F3, F4 ®−îc dïng ®Ó khuyÕch ®¹i ®−îc kiÓm tra trªn gel agaroza 0,8%. §Öm ®iÖn toµn bé gien ureaseB kÝch th−íc 1700 bp cã di 1xTAE. tr×nh tù lµ: 2
TCNCYH 22 (2) - 2003 III. KÕt qu¶ H×nh 2 lµ kÕt qu¶ ®iÖn di ®å cña c¸c s¶n phÈm PCR. 1. Sö dông ph−¬ng ph¸p PCR ®¬n ®Ó ph¸t hiÖn c¸c gien ureaseB, cagA vµ HP1125 Nh− ®· thÊy, ba gien cagA., Hp1125 vµ cña chñng vi khuÈn Helicobacter pylori Urease B ®· ®−îc khuyÕch ®¹i vµ cho c¸c s¶n phÈm cã ph©n tö l−îng nh− ®· chê ®îi: 1700 bp VNH - 85 (chñng ViÖt Nam). cho gien UreaseB., 540 bp cho gien HP1125 vµ C¸c kÕt qu¶ ph©n tÝch c¸c s¶n phÈm PCR 460 bp cho gien cagA. ®¬n cña ba gien cagA., Hp1125 vµ UreaseB ®−îc tr×nh bµy ë h×nh 1. Trong nghiªn cøu nµy, M1 c¸c gien ®−îc khuyÕch ®¹i cã ph©n tö l−îng kho¶ng 460 bp (cagA)., 540bp (Hp1125) vµ Kb 1700 kb (UreaseB) lµ nh÷ng kÝch th−íc chê ®îi. ¶nh ®iÖn di ®å 1 còng cho thÊy, kh«ng cã 2 mét b¨ng ADN nµo ®−îc khuyÕch ®¹i thªm, 1.5 1 ngoµi nh÷ng b¨ng cña cagA, Hp1125 vµ UreaseB, chøng tá c¸c cÆp måi thiÕt kÕ ®Æc 0.5 tr−ng cho ph©n tÝch. 2 M123 3 Kb H×nh 2- Ph¸t hiÖn ba gen Urease B (1)., Hp1125 (2) vµ cagA (3) b»ng ph−¬ng ph¸p Multiplex PCR 1.5 IV. Bµn luËn 1 Vi khuÈn Helicobacter pylori, chñng ViÖt Nam ®a d¹ng vÒ mÆt sinh häc. Chóng cã thÓ 0.5 khiÕm khuyÕt mét trong hai gien cagA vµ urease B [1]. Nguyªn nh©n do c¸c qu¸ tr×nh siªu ®ét biÕn x¶y ra trong hÖ gien cña vi khuÈn. H×nh 1- Ph¸t hiÖn c¸c gien cagA (1), HP1125 (2) Trong mét nghiªn cøu trªn h¬n mét tr¨m bÖnh vµ UreaseB (3) b»ng ph−¬ng ph¸p PCR ®¬n. nh©n, H¹nh vµ cs còng nhËn thÊy, tû lÖ c¸c chñng 2. Sö dông Multiplex PCR ®Ó ph¸t hiÖn Helicobacter pylori mang gien urease B khiÕm cïng mét lóc ba gien cagA, UreaseB vµ khuyÕt lµ kho¶ng 20%. T−¬ng tù nh− vËy, sè Hp1125 trong vi khuÈn c¸c chñng Helicobacter pylori kh«ng tæng hîp protein cagA chiÕm mét tû lÖ ®¸ng kÓ [H¹nh. H. pylori chñng VNH - 85 (chñng ViÖt KÕt qu¶ ch−a c«ng bè]. Nam). Víi nh÷ng lý do nh− trªn, ®Ó ph¸t hiÖn vi Sau hµng lo¹t c¸c thö nghiÖm ®Ó tèi −u ho¸ khuÈn Helicobacter pylori b»ng ph−¬ng ph¸p ph¶n øng Multiplex PCR, chóng t«i ®· khuyÕch PCR, kh«ng thÓ khuyÕch ®¹i mét gien riªng rÏ, ®¹i ®−îc c¶ ba gien trong mét èng nghiÖm. v× c¸c kÕt qu¶ ©m tÝnh gi¶ cã thÓ x¶y ra. Chóng t«i ®· tèi −u ho¸ c¸c ®iÒu kiÖn cña ph¶n øng 3
TCNCYH 22 (2) - 2003 PCR ®¬n hoÆc Multiplex PCR cho ba gien c¸c sinh thiÕt d¹ dµy cu¶ ng−êi ViÖt Nam. Sinh ureaseB., cagA vµ Hp1125. Chóng t«i ®Ò nghÞ häc. 23 (2): 51-54 sö dông ph−¬ng ph¸p Multiplex PCR ®Ó ph¸t 3. Atherton, J. C., Cao, P., Peek, R. M. J., hiÖn vi khuÈn Helicobacter pylori trong sinh Tummuru, M. K., Blaser, M. thiÕt d¹ dµy, trong ph©n vµ vi khuÈn ph©n lËp tõ J., Cover, T. L : Mosaicism in vacuolating ng−êi bÖnh ViÖt Nam. Ph−¬ng ph¸p cã gi¸ trÞ cytotoxin alleles of trong c¸c tr−êng hîp, c¸c sµng läc vi khuÈn Helicobacter pylori. Association of Helicobacter pylori b»ng test Urease cho kÕt qu¶ ©m tÝnh. specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J. Biol. Chem. V. KÕt luËn 1995, 270: 17771 - 17777. 1. Chóng t«i ®· khuyÕch ®¹i nhiÒu gien 4. Correa, P : Helicobacter pylori and trong mét èng nghiÖm b»ng ph−¬ng ph¸p gastric carcinogenesis. Multiplex PCR ®Ó ph¸t hiÖn vi khuÈn Helicobacter pylori. Amm J Surg Patho. 1995, 19 Suppl. 1: S37 - S43. 2. Multiplex PCR lµ ph−¬ng ph¸p ph¸t hiÖn 5. Cristina, N et al: Helicobacter pylori Helicobacter pylori cho kÕt qu¶ nhanh vµ ®Çy genotype may determine gastric ®ñ th«ng tin vÒ sù cã mÆt cña vi khuÈn trong histopathology. Amer. J . Pathology. 2001, 158 c¸c sinh thiÕt bÖnh nh©n. Ph−¬ng ph¸p cã thÓ : 647 - 654. ®−îc ¸p dông trong thùc tÕ l©m sµng cña ViÖt Nam. 6. Hazell, S. L. The role of Helicobacter pylori Urease: a contentious issue . Eur. J. Tµi liÖu tham kh¶o Gastroenterol. Hepato. 4. 1992, (Suppl. 1) : 55 - 1. NguyÔn ThÞ Hång H¹nh vµ NguyÔn ThÞ 59. Thanh Lîi : Sù tån t¹i cña c¸c chñng 7. Hopkins, R. J. and Morris, Jr. J. G.: Helicobacter pylori khiÕm khuyÕt gien urease B Helicobacter pylori: the missing link in ë c¸c bÖnh nh©n viªm loÐt vµ ung th− d¹ dµy perspective. Am. J. Med. 1984, 97: 265 - 277. ViÖt Nam. §¹i héi lÇn thø hai héi nghÞ khoa 8. Van de Ende, A., Pan, Z, J., Bart, R. W., häc ho¸ sinh y d−îc n¨m 2001-C¸c b¸o c¸o van de Hurst., Feller, M., Xio, S.D., Tytgat, G khoa häc.Tr. 106-113. and Dankert, J (1998). cagA- postive 2. TrÇn C«ng T−íc, TrÇn Quúnh Hoa, Helicobacter pylori population in China and the NguyÔn ThÞ Hång H¹nh, Bïi Ph−¬ng ThuËn vµ Netherland are distinct. Infect. 2001, Immun. Lª V¨n Phñng. Sù cã mÆt cu¶ vi khuÈn 66 : 1822 - 1826. Helicobacter pylori mang cagA+status trong Summary Multiplex PCR and detection of three genes of Helicobacter pylori Bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of many gastric disorders. That is why, its correct detection is necessary. However, monitoring the bacteria by amplifying only one gene has used to give false-negative results due to the biodiversity of the bacteria. The conditions for Multiplex PCR amplifying three virulent genes of the bacteria such as cagA., ureaseB and Hp1125 were optimized. It is recommended to detect Helicobacter pylori in clinical setting in Viet nam. 4

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học

320 tài liệu

1236 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.