Sử dụng promoter mạnh Pgrac212 để tăng cường sự biểu hiện tiết amylase chỉ thị ở Bacillus subtilis

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 90-96<br /> <br /> SỬ DỤNG PROMOTER MẠNH Pgrac212 ĐỂ TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU HIỆN<br /> TIẾT -AMYLASE CHỈ THỊ Ở Bacillus subtilis<br /> Huỳnh Kiều Thanh1,2, Phan Thị Phượng Trang1, Trần Linh Thước1, Nguyễn Đức Hoàng1*<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *ndhoang@hcmus.edu.vn<br /> 2<br /> Công ty TNHH Công nghệ sinh học HT, tp. Hồ Chí Minh<br /> <br /> TÓM TẮT: Bacillus subtilis là mô hình nghiên cứu vi khuẩn gram (+) trong hơn 4 thập kỷ và được tổ<br /> chức FDA của Hoa Kỳ đánh giá là sinh vật an toàn GRAS (Generally Regarded as Safe). B. subtilis còn<br /> được sử dụng rộng rãi trong sản xuất protein công nghiệp với qui mô lớn bởi khả năng tiết protein hiệu<br /> quả ra môi trường nuôi cấy. Nhằm tăng khả năng sử dụng B. subtilis để biểu hiện protein tái tổ hợp, hệ<br /> thống vector biểu hiện pHT có mang promoter mạnh Pgrac ra đời. Promoter này được xây dựng dựa trên<br /> promoter mạnh phụ thuộc σA của operon groESL từ B. subtilis dung hợp với yếu tố điều hòa lac operator<br /> (lacO) từ Echerichia coli, cho phép điều hòa biểu hiện vượt mức protein nội bào lên đến 16% protein<br /> tổng. Gen amyQ mã hóa cho α-amylase (AmyQ) có nguồn gốc từ Bacillus amyloliquefasciens đã được sử<br /> dụng làm chỉ thị để tạo vector pHT43-amyQ mang promoter Pgrac (Pgrac-amyQ) và đã biểu hiện tương<br /> đối tốt trong B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N. Trong nghiên cứu này, promoter Pgrac212 được<br /> chọn lọc từ thư viện với hơn 80 promoter cải biên từ promoter Pgrac để tạo plasmid pHT1200 (Pgrac212amyQ) nhằm khảo sát khả năng tăng cường sự biểu hiện tiết của protein chỉ thị AmyQ. Kết quả cho thấy,<br /> thiết kế Pgrac212-amyQ cho khả năng biểu hiện tiết α-amylase hiệu quả hơn Pgrac-amyQ ở cả hai chủng<br /> B. subtilis 1012-có biểu hiện protease ngoại bào và B. subtilis WB800N-mang đột biến bất hoạt tám<br /> protease ngoại bào. Nghiên cứu này chứng tỏ Pgrac212 là một promoter mạnh có tiềm năng ứng dụng để<br /> biểu hiện các protein tiết khác trong B. subtilis.<br /> Từ khóa: Bacillus subtilis, α-amylase, protease ngoại bào.<br /> MỞ ĐẦU<br /> <br /> B. subtilis được sử dụng rộng rãi trong công<br /> nghiệp và nghiên cứu cơ bản vì (i) là vi khuẩn<br /> không gây bệnh và được tổ chức FDA của Mỹ<br /> đánh giá là sinh vật an toàn GRAS (Generally<br /> Recognized As Safe); (ii) môi trường nuôi cấy<br /> đơn giản, rẻ tiền và có khả năng lên men ở mật<br /> độ cao [12]; (iii) bộ gen được giải trình tự hoàn<br /> chỉnh và các gen thiết yếu đã được xác định [1].<br /> Bên cạnh đó, B. subtilis là vi khuẩn gram (+)<br /> cho phép tiết protein trực tiếp ra môi trường<br /> nuôi cấy [12]. Tuy vậy, hiệu quả tiết protein<br /> ngoại lai chưa cao là một hạn chế cho việc sử<br /> dụng B. subtilis trong ứng dụng công nghiệp. Ba<br /> trở ngại có thể kể đến là (i) sự nhận diện và<br /> phân cắt protein ngoại lai của protease ngoại<br /> bào; (ii) sự bất ổn định của plasmid [9]; (iii)<br /> thiếu hệ thống biểu hiện hiệu quả [4]. Các<br /> chủng đột biến mất protease được thiết kế để<br /> giảm tác động của protease ngoại bào lên<br /> protein mục tiêu mà nổi bật là chủng B. subtilis<br /> WB800N đã bất hoạt tám protease ngoại bào<br /> được sử dụng trong nghiên cứu này [3]. Bên<br /> <br /> 90<br /> <br /> cạnh đó, sự ra đời của hệ thống vector pHT với<br /> cơ chế sao chép theo kiểu θ (theta) đã khắc phục<br /> sự không ổn định về mặt cấu trúc. Vector<br /> pHT01 mang promoter Pgrac được dung hợp từ<br /> promoter groESL có nguồn gốc từ B. subtilis<br /> với lac operator (lacO) từ E. coli được điều hòa<br /> cảm ứng bằng IPTG cho khả năng biểu hiện<br /> protein mục tiêu gấp 50 lần so với promoter<br /> Pspac được thiết kế trước đó [8]. Năm 2007, hai<br /> vector pHT43-mang trình tự tín hiệu tiết SamyQ<br /> của α-amylase và pHT01-không mang trình tự<br /> tín hiệu tiết đã được thương mại và phân phối<br /> bởi Công ty CNSH MoBiTec (CHLB Đức).<br /> Gen amyQ mã hóa cho α-amylase (AmyQ)<br /> có nguồn gốc từ B. amyloliquefasciens được sử<br /> dụng phổ biến làm chỉ thị trong các nghiên cứu<br /> biểu hiện tiết vượt mức ở B. subtilis [2, 6].<br /> Trong một nghiên cứu trước đó, chúng tôi đã<br /> dùng AmyQ làm chỉ thị để khảo sát khả năng sử<br /> dụng vector pHT01 chứa promoter Pgrac trong<br /> chủng B. subtilis WB800N [11]. Trong bài báo<br /> này, amyQ được sử dụng làm chỉ thị để tạo các<br /> plasmid mới nhằm chứng minh khả năng cải<br /> <br /> Huynh Kieu Thanh et al.<br /> <br /> thiện mức độ biểu hiện tiết trong B. subtilis nhờ<br /> promoter Pgrac212 [7]. Pgrac212 là một<br /> promoter cải biên từ promoter Pgrac nhờ có<br /> thêm vùng làm bền mRNA. lacO của Pgrac<br /> đóng vai trò kiểm soát sự biểu hiện đồng thời là<br /> nhân tố làm bền đầu 5’-stem-loop, việc thay đổi<br /> một số trình tự trên lacO để giảm năng lượng tự<br /> do (∆G) và thêm vào 13 nucleotide (13 spacer)<br /> vào giữa vùng lac operator và RBS (ribosome<br /> binding site) nhằm tăng độ bền của mRNAvà<br /> giúp lượng mRNA đích được tạo ra trong tế bào<br /> ở mức cao [7]. Plasmid pHT1200 mang gen<br /> amyQ và trình tự tín hiệu tiết SamyQ dung hợp<br /> với promoter Pgrac212 được tạo thành để khảo<br /> sát khả năng tăng cường biểu hiện tiết của αamylase chỉ thị ra môi trường nuôi cấy, so sánh<br /> với pHT43-amyQ mang promoter Pgrac. Sự<br /> biểu hiện của amyQ khi không cảm ứng và có<br /> cảm ứng bằng IPTG được thực hiện ở các nồng<br /> độ và thời điểm khác nhau. Kết quả cho thấy,<br /> promoter Pgrac212 biểu hiện α-amylase tiết<br /> mạnh hơn cho phép cảm ứng biểu hiện protein<br /> tái tổ hợp ở nồng độ thấp. Bên cạnh đó,<br /> Pgrac212 có chỉ số cảm ứng cao hơn Pgrac.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Chủng vi sinh vật, plasmid, kháng sinh và<br /> môi trường nuôi cấy<br /> Chủng E. coli OmniMAX (InvitrogenTM)<br /> được dùng làm chủng chủ cho các bước dòng<br /> hóa. Chủng B. subtilis 1012 [10] có biểu hiện<br /> protease ngoại bào và B. subtilis WB800N [3]<br /> mang đột biến bất hoạt tám protease ngoại bào<br /> được sử dụng làm chủng khảo sát khả năng biểu<br /> hiện tiết của protein mục tiêu ra môi trường<br /> nuôi cấy.<br /> Plasmid pHT43 [9] được sử dụng làm<br /> chứng âm chỉ mang promoter Pgrac và trình tự<br /> tín hiệu tiết SamyQ của α-amylase. Plasmid<br /> pHT43-amyQ là plasmid pHT43 chèn thêm gen<br /> amyQ mã hóa cho α-amylase có nguồn gốc từ<br /> B. amyloliquefasciens đã được thiết kế trong<br /> một nghiên cứu trước (kết quả chưa công bố).<br /> Tế bào được nuôi cấy trong môi trường<br /> Luria broth (LB) ở 37oC trong điều kiện hiếu<br /> khí. Kháng sinh được bổ sung với nồng độ cuối<br /> ampicillin 100 µg/ml và chloramphenicol 10<br /> µg/ml. Tế bào được đánh giá mức độ biểu hiện<br /> <br /> tiết ra môi trường trên đĩa thạch có bổ sung 1%<br /> tinh bột tan.<br /> Thiết kế vector biểu hiện tiết pHT1200<br /> Plasmid pHT212 [7] mang promoter mạnh<br /> Pgrac212 được lựa chọn từ thư viện hơn 80<br /> promoter để làm khung sườn tạo plasmid<br /> pHT1200. Gen amyQ (bao gồm cả trình tự tín<br /> hiệu tiết SamyQ) được khuếch đại từ pKTH10<br /> [6] bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu<br /> AmyQ_F_BamHI (5’-GGCCATGGATCCATG<br /> ATTCAAAAACGAAAGCGGACAG-3’)<br /> và<br /> AmyQ_R_AatII(5’-GGCCATGACGTCTTATT<br /> TCTGAACATAAATGGAGACG-3’).<br /> Đoạn<br /> gen thu nhận được sau đó cắt bằng BamHI và<br /> AatII, thực hiện phản ứng nối với plasmid<br /> pHT212 cũng được cắt bằng hai enzyme trên để<br /> tạo thành plasmid pHT1200. Gen bgaB trên<br /> pHT212 được thay thế bằng gen amyQ. Sản<br /> phẩm nối tạo plasmid pHT1200 được biến nạp<br /> vào E. coli OmniMAX, sàng lọc, kiểm tra và<br /> giải trình tự trước khi biến nạp vào B. subtilis<br /> 1012 và B. subtilis WB800N.<br /> Khảo sát khả năng tiết α-amylase trên đĩa<br /> thạch chứa tinh bột<br /> Các khuẩn lạc đơn mang plasmid pHT43,<br /> pHT43-amyQ, pHT1200 của chủng B. subtilis<br /> 1012 và B. subtilis WB800N được nuôi trên đĩa<br /> thạch có bổ sung thêm 1% tinh bột và IPTG với<br /> các nồng độ 0 mM, 0,001 mM, 0,01 mM, 0,1<br /> mM, ủ ở 37oC trong 20 giờ, quan sát kết quả sau<br /> khi nhuộm với dung dịch I2/KI [5]. Thí nghiệm<br /> được lặp lại ba lần và thực hiện đồng thời với<br /> chứng âm pHT43, so sánh vòng tan tinh bột với<br /> đối chứng dương pHT43-amyQ.<br /> Nuôi cấy trên môi trường lỏng, thu mẫu cho<br /> SDS-PAGE và đo hoạt tính α-amylase<br /> Các chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis<br /> WB800N mang các plasmid được nuôi cấy<br /> trong môi trường LB có bổ sung kháng sinh<br /> chloramphenicol ở 37oC, 250 vòng/phút. Khi<br /> OD600 đạt 0,8 (mẫu 0 giờ) chủng được cảm ứng<br /> biểu hiện bằng IPTG với các nồng độ IPTG đã<br /> đề cập. Tiến hành thu dịch nuôi cấy ở các thời<br /> điểm 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ sau cảm ứng. Thí<br /> nghiệm được lặp lại ba lần và thực hiện đồng<br /> thời với pHT43-amyQ. Chứng âm pHT43 được<br /> thu mẫu ở thời điểm 6 giờ và không cảm ứng<br /> <br /> 91<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 90-96<br /> <br /> với IPTG. Mẫu được ly tâm 13.000 vòng/phút,<br /> ở 4oC trong 5 phút, thu dịch nổi, giữ ở -20oC để<br /> chạy SDS-PAGE và đo hoạt tính.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Kiểm tra biểu hiện bằng SDS-PAGE<br /> Protein trong dịch tiết được tủa bằng TCA<br /> với nồng độ cuối đạt 10%, ủ trong đá 30 phút,<br /> ly tâm 12.000 vòng/phút, ở 4oC trong 10 phút.<br /> Tủa được rửa hai lần bằng acetone lạnh và để<br /> khô ở nhiệt độ phòng. Hòa tan tủa trong 50 µl<br /> nước, 25 µl dung dịch nạp mẫu 3X (3X loading<br /> buffer) và biến tính bằng nhiệt ở 95oC trong 5<br /> phút. Kiểm tra sự biểu hiện trên gel<br /> polyacrylamide 12,5%.<br /> <br /> Để chứng minh khả năng tăng cường sự<br /> biểu hiện tiết α-amylase vào môi trường nuôi<br /> cấy của B. subtilis, plasmid pHT1200 được thiết<br /> kế (hình 1C). Gen amyQ bao gồm cả trình tự tín<br /> hiệu tiết SamyQ được khuếch đại bằng phản<br /> ứng PCR từ pKTH10và được đưa vào plasmid<br /> pHT212 mang promoter mạnh Pgrac212 (hình<br /> 1B). Đây là một promoter mạnh được cải biên<br /> từ promoter Pgrac (hình 1A) bằng cách thay đổi<br /> một số trình tự trên lacO và thêm vào giữa vùng<br /> lacO và RBS 13 nucleotide để tăng sự bền vững<br /> của mRNA [7].<br /> Các plasmid tái tổ hợp được kiểm tra bằng<br /> giải trình tự và so sánh với trình tự lý thuyết bằng<br /> phần mềm Clone Manager 9.0, dòng plasmid<br /> đúng được biến nạp vào các chủng B. subtilis để<br /> khảo sát khả năng biểu hiện tiết α-amylase và so<br /> sánh với pHT43-amyQ thông qua đánh giá biểu<br /> hiện trên đĩa thạch, kiểm tra bằng SDS-PAGE và<br /> hoạt tính α-amylase của dịch tiết thu được.<br /> <br /> Đo hoạt tính của α-amylase<br /> Hoạt tính α-amylase được đo theo như mô<br /> tả của Nicholson & Chambliss (1985) [5]. 250<br /> µl dịch tiết được bổ sung thêm 1 ml dung dịch<br /> phản ứng (50 mM Tris/HCl pH 6,8, 25 mM<br /> CaCl2 và 0,05% tinh bột tan), ủ 30 phút ở 37oC<br /> và dừng phản ứng bằng 0,1% I2/KI. Hoạt tính<br /> α-amylase được xác định khi giá trị OD620 giảm<br /> 0,1. Các mẫu có lượng enzyme quá cao sẽ được<br /> pha loãng trước khi xác định hoạt tính.<br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Thiết kế plasmid pHT1200<br /> <br /> C<br /> <br /> Hình 1. A. cấu trúc stem-loop promoter Pgrac (pHT43-amyQ); B. cấu trúc steem-loop promoter<br /> Pgrac212 (pHT1200); C. sơ đồ plasmid pHT1200.<br /> 92<br /> <br /> Huynh Kieu Thanh et al.<br /> <br /> Hình 2. Biểu hiện tiết α-amylase của chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N mang plasmid<br /> pHT1200 trên đĩa thạch bổ sung 1% tinh bột và cảm ứng IPTG với các nồng độ khác nhau<br /> Đánh giá biểu hiện tiết α-amylase trên đĩa<br /> thạch chứa tinh bột<br /> <br /> sự khác biệt ở cả hai plasmid và hai chủng khảo<br /> sát khi quan sát trên đĩa thạch.<br /> <br /> Trong thử nghiệm trên đĩa, các khuẩn lạc<br /> đơn được nuôi cấy. Protein α-amylase được tiết<br /> ra ngoài sẽ phân cắt tinh bột có trong môi<br /> trường, kết quả tạo thành các vòng phân giải<br /> xung quanh khuẩn lạc, vùng này không bắt màu<br /> với dung dịch I2/KI.<br /> <br /> Kiểm tra biểu hiện α-amylase bằng SDS-PAGE<br /> Để khảo sát khả năng tiết α-amylase ra môi<br /> trường nuôi cấy cũng như đánh giá mức độ cảm<br /> ứng biểu hiện protein α-amylase bằng chất cảm<br /> ứng IPTG, hai chủng B. subtilis 1012 và<br /> B. subtilis WB800N mang plasmid pHT1200 và<br /> pHT43-amyQ được nuôi cấy lắc, thu mẫu ở các<br /> thời điểm 0 giờ (trước khi cảm ứng IPTG), 2<br /> giờ, 4 giờ và 6 giờ sau khi cảm ứng bằng IPTG<br /> với các nồng độ khác nhau. Vì α-amylase được<br /> biểu hiện ở dạng tiết nên sẽ tích tụ bên ngoài<br /> môi trường nuôi cấy, vì thế dịch sau nuôi cấy sẽ<br /> được ly tâm loại bỏ tế bào và được xử lý để điện<br /> di SDS-PAGE. Vạch α-amylase có kích thước<br /> khoảng 55 kDa.<br /> <br /> Theo kết quả thí nghiệm (hình 2), ở cả hai<br /> chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N<br /> mang plasmid pHT1200 và pHT43-amyQ cho<br /> đường kính vòng phân giải tinh bột lớn hơn<br /> nhiều so với chứng âm. Bên cạnh đó, khi nồng<br /> độ cảm ứng IPTG tăng dần thì kích thước vòng<br /> phân giải tinh bột cũng tăng. Như vậy, lượng<br /> IPTG cảm ứng có ảnh hưởng đến mức độ biểu<br /> hiện của α-amylase. Tuy nhiên, không thấy rõ<br /> <br /> Hình 3. So sánh biểu hiện tiết α-amylase của chủng B. subtilis 1012<br /> mang plasmid pHT43-amyQ và pHT1200 bằng SDS-PAGE<br /> 93<br /> <br /> TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 90-96<br /> <br /> Kết quả SDS-PAGE cho thấy, so với chứng<br /> âm, ở cả hai plasmid khảo sát đều có xuất hiện<br /> vạch protein tương ứng với kích thước lý thuyết<br /> khoảng 55 kDa. Plasmid pHT43-amyQ có vạch<br /> protein xuất hiện rõ ở 0,1 mM IPTG và không<br /> chênh lệch nhiều ở thời điểm 2 giờ, 4 giờ và 6<br /> giờ sau cảm ứng. Trong khi đó, ở plasmid<br /> pHT1200, vạch protein đậm dần khi nồng độ<br /> cảm ứng IPTG tăng và thời gian nuôi cấy dài.<br /> Điều này cho thấy, promoter Pgrac212 hoạt<br /> động hiệu quả khi được cảm ứng bằng IPTG và<br /> lượng protein được tích lũy trong môi trường<br /> <br /> tăng dần theo thời gian.<br /> So sánh mức độ biểu hiện α-amylase<br /> của chủng B. subtilis 1012 mang plasmid<br /> pHT1200 và pHT43-amyQ (hình 3) cho thấy,<br /> plasmid pHT1200 mang promoter Pgrac212<br /> cho biểu hiện α-amylase vượt trội hơn so với<br /> pHT43-amyQ mang promoter Pgrac và vạch<br /> protein đã bắt đầu xuất hiện rõ khi cảm ứng<br /> bằng 0,01 mM IPTG trong khi ở pHT43-amyQ<br /> cần đến 0,1 mM IPTG. Kết quả này cũng<br /> tương tự đối với chủng B. subtilis WB800N<br /> (hình 4).<br /> <br /> Hình 4. So sánh biểu hiện tiết α-amylase của chủng B. subtilis WB800N<br /> mang plasmid pHT43-amyQ và pHT1200 bằng SDS-PAGE<br /> <br /> Hình 5. Hoạt tính α-amylase của chủng B. subtilis 1012 và B. subtilis WB800N<br /> mang plasmid pHT43-amyQ và pHT1200<br /> 94<br /> <br />