Tác dụng kháng khuẩn của loxain trên invitro và điều trị bỏng trên mô hình bỏng ở chuột cống trắng

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA LOXAIN TRÊN INVITRO VÀ<br /> ĐIỀU TRỊ BỎNG TRÊN MÔ HÌNH BỎNG Ở CHUỘT CỐNG TRẮNG<br /> Trần Thanh Tùng1, Phạm Thị Vân Anh1,<br /> Nguyễn Trọng Thông1, Đào Kim Long2<br /> 1<br /> <br /> Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Công ty Cổ phần Sản xuất và Thương mại Nam Y Aurvini<br /> <br /> 2<br /> <br /> Chế phẩm Loxain được dùng đánh giá tác dụng kháng khuẩn trên Invitro và tác dụng điều trị bỏng trên<br /> mô hình gây bỏng nhiệt thực nghiệm.Tác dụng kháng khuẩn của Loxain được tiến hành trên Invitro, thử<br /> trên 4 chủng quốc tế là Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 25913),<br /> Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella pneumoniae (ATCCBAA - 1705). Chuột cống trắng chủng<br /> Wistar cả hai giốngđược chia thành 5 nhóm, nhóm 1 không tác động gì, nhóm 2 - 5 được gây bỏng nhiệt<br /> phía trước đùi với kích thước tương tự nhau, sau đó nhóm 2 được bôi dầu cọ 4 lần/ngày, lô 3<br /> bôisulfadiazin - bạc 4 lần/ngày, lô 4 và 5 được bôi tương ứng Loxain 4 lần/ngày và 6 lần/ngày liên tục<br /> trong 21 ngày. Sau đó giết chuột, lấy mẫu da tại vết bỏng để làm giải phẫu bệnh. Kết quả nghiên cứu cho<br /> thấy: Loxain nồng độ từ 0,025 - 0,4g/ml không ức chế 4 chủng vi khuẩn được thử. Trên mô hình gây bỏng<br /> nhiệt thực nghiệm: Ở các lô dùng Loxain thời gian liền khỏi vết thương bỏng diễn ra nhanh, hiệu quả điều<br /> trị vết thương bỏng của Loxain bôi 4 lần/ngày và 6 lần/ngày là tương đương nhau và tương đương với lô<br /> dùng sulfadiazin - bạc trong 21 ngày điều trị liên tục.<br /> Từ khóa: Loxain, tác dụng kháng khuẩn, chuột cống chủng Wistar, bỏng nhiệt trên da, liền sẹo<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> Hiện nay, có nhiều loại thuốc dùng để điều<br /> <br /> Bỏng là chấn thương thường gặp, có nhiều<br /> <br /> trị tại chỗ vết thương bỏng được sản xuất ở<br /> <br /> nguyên nhân gây ra như nhiệt, hoá chất,<br /> <br /> trong nước hoặc nhập từ nước ngoài. Ở trong<br /> <br /> phóng xạ..., trong đó bỏng do nhiệt hay gặp<br /> <br /> nước, một số thuốc y học cổ truyền đã được<br /> <br /> nhất, chiếm tới 84 - 94% tổng số nạn nhân<br /> <br /> nghiên cứu, kế thừa, dựa trên cơ sở khoa học<br /> <br /> bỏng [1]. Tuỳ mức độ bỏng mà bệnh nhân<br /> <br /> và được ứng dụng trong lâm sàng như: cao<br /> <br /> phải chịu những ảnh hưởng với những mức<br /> <br /> và mỡ Maduxin từ cây sến, mật ong, Chitosan<br /> <br /> độ khác nhau, bệnh nhân bỏng thường phải<br /> <br /> [2 - 6]. Bên cạnh các thuốc y học cổ truyền,<br /> <br /> điều trị dài ngày, tốn kém. Nếu điều trị không<br /> <br /> các chất kháng khuẩn, kháng sinh đang được<br /> <br /> tốt có thể sẽ để lại những di chứng lâu dài<br /> <br /> sử dụng phổ biến trong điều trị tại chỗ vết<br /> <br /> cho người bệnh làm ảnh hưởng đến thẩm<br /> <br /> thương bỏng ở nước ta và trên thế giới như<br /> <br /> mỹ, khả năng lao động, sinh hoạt, thậm chí<br /> <br /> kem sulfadiazine - bạc 1% [7].<br /> <br /> gây tử vong cho người bệnh.<br /> <br /> Các thuốc của nước ngoài có tác dụng<br /> tương đối tốt nhưng chi phí cao không phù<br /> hợp với đại bộ phận bệnh nhân ở nước ta nói<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Thanh Tùng, Bộ môn Dược lý,<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> <br /> chung và bệnh nhân bỏng nói riêng. Việc<br /> <br /> Email: tranthanhtung@hmu.edu.vn<br /> <br /> nghiên cứu tìm kiếm các thuốc mới từ nguồn<br /> <br /> Ngày nhận: 02/3/2017<br /> <br /> nguyên liệu trong nước, có trữ lượng dồi dào,<br /> <br /> Ngày được chấp thuận: 25/4/2017<br /> <br /> giá thành không cao, tác dụng điều trị tại chỗ<br /> <br /> TCNCYH 107 (2) - 2017<br /> <br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> vết thương bỏng tốt vẫn luôn được đặt ra<br /> <br /> aeruginosa<br /> <br /> trong công tác điều trị bỏng.<br /> <br /> aureus (ATCC 25913), Escherichia coli (ATCC<br /> <br /> Loxain có thành phần chủ yếu là curcumin<br /> <br /> 25922),<br /> <br /> (ATCC 27853),<br /> <br /> Klebsiella<br /> <br /> Staphylococcus<br /> <br /> pneumoniae(ATCCBAA-<br /> <br /> và β-caroten, đây là hai hoạt chất có nhiều<br /> <br /> 1705) được nhập, bảo quản và nuôi cấy và<br /> <br /> trong củ nghệ và quả gấc, những loại củ, quả<br /> <br /> nghiên cứu tại Khoa Vi sinh, Bệnh viện Hữu<br /> <br /> rất phổ biến ở nước ta. β-caroten có tác dụng<br /> <br /> nghị Việt Đức.<br /> <br /> tăng sức đề kháng của cơ thể, kích thích biệt<br /> hoá tế bào biểu mô, sinh tiết nhầy [8]. Curcumin đã được chứng minh có tác dụng kháng<br /> khuẩn và nhanh liền sẹo. Theo nghiên cứu<br /> của Mehrabani và cộng sự đã chỉ ra curcumin<br /> dạng kem 2% có tác dụng làm giảm diện tích<br /> vết bỏng và nhanh liền sẹo trên mô hình gây<br /> bỏng nhiệt trên chuột cống chủng SpragueDawley [9].<br /> <br /> 1.3. Động vật nghiên cứu<br /> Chuột cống chủng Wistar cả hai giống,<br /> khoẻ mạnh, cân nặng 285 ± 30g do Trung tâm<br /> động vật thí nghiệm Đan Phượng - Hà Tây<br /> cung cấp. Động vật được nuôi trong phòng thí<br /> nghiệm 7 ngày trước khi nghiên cứu và trong<br /> suốt thời gian nghiên cứu trong điều kiện phòng<br /> thí nghiệm với đầy đủ thức ăn và nước uống tại<br /> Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội.<br /> <br /> Dựa trên cơ sở đó, đề tài được tiến hành<br /> nhằm nghiên cứu tính kháng khuẩn của sản<br /> phẩm Loxain trên Invitro, đánh giá tác dụng<br /> điều trị bỏng của chế phẩm Loxain trên mô<br /> hình gây bỏng nhiệt thực nghiệm ở chuột<br /> cống trắng.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của<br /> Loxain trên Invitro<br /> * Chuẩn bị thuốc thử:<br /> Pha loãng bậc 2 các dung dịch thử nghiệm<br /> vào các ống tube (1, 2, 4, 8, 16, 32) bằng dầu<br /> cọ. Dung dịch gốc có độ đậm đặc cao nên<br /> nồng độ pha loãng từ 1/2 - 1/32 được chọn để<br /> <br /> 1.1. Thuốc và chất liệu nghiên cứu<br /> - Thuốc nghiên cứu: Loxain ở dạng dung<br /> dịch 500ml chất lỏng trong suốt, màu đỏ cam<br /> đồng nhất. Nồng độ 1,6g dược liệu/ml, được<br /> Công ty Cổ phần sản xuất và thương mại<br /> Nam Y Aurvini sản xuất, đạt tiêu chuẩn cơ sở.<br /> Loxain được pha loãng trong dung môi là dầu<br /> cọ.<br /> - Thuốc dùng trong nghiên cứu: Sulfadiazinbạc (biệt dược Silvadene®) dạng kem bôi 1%<br /> sản phẩm của Công ty cổ phần Dược Trung<br /> Ương Huế (Medipharco).<br /> 1.2. Chủng vi khuẩn mẫu quốc tế<br /> <br /> đánh giá hoạt tính kháng khuẩn.<br /> * Chuẩn bị huyền dịch:<br /> Chủng vi khuẩn cần thử được nuôi cấy<br /> thuần, qua đêm. Lấy 3 - 5 khuẩn lạc hòa tan<br /> vào nước muối 0,9%, điều chỉnh để đạt huyền<br /> dịch có nồng độ 0,5 Mac Farland (tương<br /> đương 108 CFU/1ml).<br /> - Trong vòng 15 phút sau, pha loãng huyền<br /> dịch trên bằng canh thang Muller-Hinton vô<br /> trùng (đối với vi khuẩn dễ mọc) hoặc canh<br /> thang Muller - Hinton có 2,5-5 % máu cừu, để<br /> đạt nồng độ 5 x 105 CFU/1ml. Pha loãng<br /> huyền dịch với dung dịch chứa vi khuẩn để có<br /> <br /> Bốn chủng vi khuẩn quốc tế: Pseudomonas<br /> <br /> 8<br /> <br /> TCNCYH 107 (2) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Loxain với các nồng độ từ 0,025 - 0,4g dược<br /> liệu/ml.<br /> <br /> Nhận định kết quả: tìm nồng độ ức chế tối<br /> thiểu.<br /> <br /> 0<br /> <br /> - Ủ các ống tube ở 37 C/18 - 24 giờ. Sau<br /> thời gian ủ ấm trên, lấy dịch ở mỗi tube cấy<br /> <br /> 2.2. Đánh giá tác dụng của Loxain trên<br /> mô hình gây bỏng thực nghiệm<br /> <br /> vào thạch máu. Ủ các đĩa thạch ở 370C/18-24<br /> giờ, có hoặc không có CO2 tùy thuộc vào<br /> chủng vi khuẩn cần thử. Kiểm tra các đĩa<br /> thạch máu xem sự mọc của vi khuẩn: đạt khi<br /> ở đĩa chứng, vi khuẩn mọc tốt và ở tất cả các<br /> đĩa vi khuẩn mọc thuần nhất, khi đó xác định<br /> nồng độ ức chế tối thiểu.<br /> Trong nghiên cứu với mỗi chủng vi khuẩn<br /> đều pha loãng 5 nồng độ: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16<br /> <br /> Chuột được chia thành 5 lô, mỗi lô 13 con:<br /> - Lô 1 (chứng sinh học): không gây tổn<br /> thương bỏng.<br /> - Lô 2 (mô hình): gây bỏng trên da. Bôi dầu<br /> cọ 4 lần/ngày.<br /> - Lô 3 (chứng dương): gây bỏng trên da.<br /> Bôi sulfadiazin - bạc 4 lần/ngày.<br /> - Lô 4 (Loxain liều thấp): gây bỏng trên da.<br /> <br /> và 1/32 so với dung dịch gốc. Mỗi nồng độ<br /> <br /> Bôi Loxain 4 lần/ngày.<br /> - Lô 5 (Loxain liều cao): gây bỏng trên da.<br /> <br /> được thử 5 mẫu với mỗi chủng vi khuẩn.<br /> <br /> Bôi Loxain 6 lần/ngày.<br /> <br /> Bôi thuốc hoặc dầu cọ<br /> N0<br /> <br /> Gây bỏng<br /> <br /> N7<br /> <br /> N14<br /> <br /> Đo diện tích vết bỏng<br /> <br /> 2.3. Sơ đồ nghiên cứu quy trình gây<br /> <br /> N21<br /> <br /> Đo diện tích vết bỏng,<br /> giải phẫu bệnh vết bỏng<br /> <br /> * Cách thức bôi thuốc<br /> <br /> bỏng nhiệt<br /> Dầu cọ, sulfadiazine - bạc và Loxain được<br /> Chuột ở các lô được gây tổn thương bỏng<br /> <br /> nhỏ 0,1 ml/1vết bỏng, sau đó xoa đều 5 lần/1<br /> <br /> trên da theo mô hình gây bỏng nhiệt bằng<br /> <br /> vết bỏng trong 15 giây, đảm bảo phủ kín vết<br /> <br /> dụng cụ kim loại theo mô tả của Durmus AS<br /> và cộng sự, Vũ Thị Ngọc Thanh [6; 10].<br /> * Cạo lông chuột và gây bỏng<br /> <br /> bỏng. Khoảng cách giữa các lần bôi cách<br /> nhau 2 giờ.<br /> 2.4. Chỉ số nghiên cứu<br /> <br /> Cạo lông chuột tại vị trí ngang mào chậu<br /> với diện tích 2 bên là 6 x 6cm.Vật gây bỏng<br /> kim loại (nặng 200g, đường kính 2,5 cm)<br /> 0<br /> <br /> * Tỷ lệ chết của chuột sau khi gây bỏng<br /> Sau khi gây bỏng, chuột được nuôi trong<br /> <br /> được nhúng trong nước sôi 100 C cho tới khi<br /> <br /> các chuồng riêng biệt cho ăn và uống nước<br /> <br /> đạt nhiệt độ hằng định, đặt vuông góc lên vị trí<br /> <br /> hàng ngày như nhau giữa các chuồng. Đồng<br /> <br /> cạo lôngchuột 35 giây và không được tác<br /> <br /> thời tiến hành quan sát, ghi lại ngày chết của<br /> <br /> động thêm lực từ bên ngoài.<br /> <br /> chuột và lô tương ứng (nếu có).<br /> <br /> TCNCYH 107 (2) - 2017<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> * Chỉ số hình thái đại thể<br /> Tình trạng tổn thương tại vết bỏng: sưng,<br /> nóng, đỏ, phù nề quan sát bằng mắt thường<br /> và ghi lại bằng máy ảnh kỹ thuật số. Vết bỏng<br /> khỏi là lúc bề mặt khô, mép vết bỏng tiến gần<br /> nhau, quan sát thấy không còn hiện tượng<br /> sưng tấy trên vết bỏng. Đo diện tích vết bỏng<br /> <br /> Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý theo<br /> thuật toán thống kê Microsoft Office Excel<br /> 2007. Kiểm định sự khác biệt của 2 giá trị<br /> trung bình bằng thuật toán χ2, sử dụng t-test<br /> Student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê,<br /> p < 0,05.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> tại các ngày 7, 14, 21 sau khi gây bỏng. Tính<br /> 1. Đánh giá tác dụng của Loxain trên<br /> <br /> phần trăm phục hồi tổn thương.<br /> Cách đo: áp giấy trong lên vùng tổn<br /> <br /> In vitro<br /> <br /> thương, dùng bút lông ghi lại theo viền tổn<br /> <br /> Loxain với nồng độ từ 0,025 - 0,4g dược<br /> <br /> thương, sau đó scan lại hình ảnh đó, đo diện<br /> <br /> liệu/ml được thử trên 4 chủng vi khuẩn Quốc<br /> <br /> tích bằng phần mềm ImageJ Basics ver 1.38<br /> <br /> tế<br /> <br /> đã được Tổ chức Y tế Thế giới công nhận là<br /> <br /> K.pneumoniae đều cho kết quả vi khuẩn mọc<br /> <br /> phần mềm để đo diện tích cho các nghiên cứu<br /> <br /> bình thường, không có khác biệt giữa nhóm<br /> <br /> y sinh học.<br /> <br /> chứng và nhóm dùng thuốc thử. Nên chúng<br /> <br /> là<br /> <br /> P.aeruginosa,<br /> <br /> S.aureus,<br /> <br /> E.coli,<br /> <br /> tôi chưa xác định được nồng độ ức chế tối<br /> <br /> * Chỉ số hình thái vi thể<br /> <br /> thiểu của Loxain.<br /> <br /> Tại thời điểm 21 ngày, lúc các vết bỏng đã<br /> bong hết vẩy và đang hồi phục hoặc đã khỏi,<br /> chuột được gây mê, lấy mô bệnh học ngẫu<br /> nhiên 3 chuột ở mỗi lô tại vị trí trung tâm tổn<br /> thương. Đánh giá sự tăng sinh tế bào sợi,<br /> tăng sinh mạch máu, tăng sinh sợi collagen, tỷ<br /> lệ biểu mô hóa vết thương.<br /> <br /> 2. Tác dụng của Loxain trên mô hình<br /> bỏng nhiệt thực nghiệm<br /> Tỷ lệ chết của các lô chuột<br /> Thời gian sau khi gây bỏng tỷ lệ chuột chết<br /> được ghi lại theo bảng sau:<br /> <br /> Bảng 1. Tỷ lệ chuột chết ở các lô chuột sau gây bỏng<br /> Lô<br /> <br /> Mô hình<br /> <br /> Chứng dương<br /> <br /> Loxain liều thấp<br /> <br /> Loxain liều cao<br /> <br /> Tỷ lệ chuột chết<br /> <br /> 2/13<br /> <br /> 0/13<br /> <br /> 1/13<br /> <br /> 1/13<br /> <br /> Theo dõi nghiên cứu cho thấy: chuột chết trong thời gian từ ngày 4 đến ngày 7 sau khi gây<br /> bỏng, ban đầu nhận thấy chuột giảm vận động, ăn ít đi dần bỏ ăn và bỏ uống nước sau đó tử<br /> vong, tỷ lệ chết của lô bôi dầu cọ là cao nhất (2/13), Loxain cả 2 liều có tỷ lệ chết như nhau<br /> (1/13), lô bôi sulfadiazine - bạc là thấp nhất (0/13).<br /> <br /> 10<br /> <br /> TCNCYH 107 (2) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 2.2. Diễn biến đại thể tại vết bỏng<br /> Ngay sau khi dùng nhiệt để gây bỏng: vết bỏng có màu trắng ngà, không phồng rộp, có ranh<br /> giới rõ với vùng da lành. Khoảng 1 - 2 giờ sau, rìa xung quanh vết bỏng nhìn rõ quầng sung<br /> huyết.<br /> Ảnh minh hoạ: chuột số 13 sau khi gây bỏng<br /> <br /> Ảnh 1. Da chuột ngay sau khi gây bỏng<br /> Các vết bỏng bôi dầu cọ<br /> - Sau 3 ngày, 100% các vết bỏng có loét.<br /> Vết bỏng ở trong tình trạng hoại tử, trên bề<br /> <br /> Ảnh 2. Da chuột sau khi gây bỏng 1 giờ<br /> - Ngày thứ 14, các vết bỏng bong vảy tiết<br /> nhanh, vết bỏng khô, hình thành sẹo sớm,<br /> vùng tổn thương còn rất nhỏ.<br /> <br /> mặt có nhiều ổ loét. Các vết loét rộng dần,<br /> <br /> - Ngày thứ 21, hầu hết các vết bỏng hồi<br /> <br /> chiếm khoảng 50 - 55% diện tích bề mặt vết<br /> <br /> phục, tạo thành sẹo nhỏ phẳng so với mặt da.<br /> <br /> bỏng, chứa nhiều dịch tiết mầu đục. Vùng<br /> xung quanh vết bỏng phù nề, nhưng vẫn có<br /> ranh giới với vùng da lành.<br /> - Sau 7 ngày, đa số vết loét vẫn chảy dịch,<br /> một số vết loét đã khô và bắt đầu hình thành<br /> vảy tiết. Vùng da xung quanh vết bỏng vẫn<br /> sung huyết.<br /> - Sau 13 - 14 ngày, tất cả các vết bỏng đều<br /> <br /> 3. Mức độ thu hẹp diện tích bỏng<br /> Sau 7 ngày dùng thuốc, diện tích bỏng<br /> không có sự khác biệt ở tất cả các lô nghiên<br /> cứu. Từ ngày thứ 14 sau dùng thuốc, diện tích<br /> các vết bỏng đã bắt đầu thu hẹp rõ rệt. Kết<br /> quả được trình bày trong bảng 2.<br /> Loxain ở cả 2 liều có tác dụng làm thu hẹp<br /> <br /> đã hình thành vảy tiết và 14/22 vết bỏng bắt<br /> <br /> diện tích bỏng nhanh hơn lô chứng bôi dầu<br /> <br /> đầu bong vảy để lộ vùng tổn thương phía<br /> dưới đang phục hồi, các vết bỏng khô. Vùng<br /> <br /> cọ vào các ngày 14 và 21 sau dùng thuốc, sự<br /> <br /> da xung quanh tổn thương không còn sung<br /> huyết.<br /> <br /> độ thu hẹp diện tích bỏng ở lô bôi Loxain so<br /> <br /> - Ngày thứ 21, tất cả các vết bỏng đã bong<br /> vảy, 5/22 vết bỏng vẫn còn ướt, số còn lại đã<br /> <br /> nhau ở hầu hết các thời điểm (p > 0,05).<br /> <br /> khô, vùng da tổn thương thu hẹp.<br /> <br /> thu hẹp diện tích vết bỏng tương đương<br /> <br /> * Các vết bỏng bôi sulfadiazin-bạc 1%,<br /> Loxain liều thấp và Loxain liều cao<br /> <br /> nhau tại các thời điểm 14 và 21 ngày (p ><br /> <br /> TCNCYH 107 (2) - 2017<br /> <br /> khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Mức<br /> với lô bôi sulfadiazine - bạc 1% tương đương<br /> Loxain liều thấp và liều cao có tác dụng làm<br /> <br /> 0,05) bảng 2.<br /> <br /> 11<br /> <br />