Tác dụng kháng ung thư của virut vắc xin sởi và quai bị dùng phối hợp trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đại trực tràng người

TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018<br /> <br /> TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA VIRUT VẮC XIN SỞI VÀ<br /> QUAI BỊ DÙNG PHỐI HỢP TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT<br /> MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG NGƢỜI<br /> Lê Duy Cương*; Hồ Anh Sơn*; Ngô Thu Hằng*; Nguyễn Lĩnh Toàn*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá hiệu quả kháng ung thư của virut vắc xin sởi và quai bị dùng phối hợp<br /> trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đại trực tràng (UTĐTT) người. Đối tượng và<br /> phương pháp: virut vắc xin sởi và quai bị (MeV và MuV) được tách dòng từ vắc xin Priorix<br /> (Hãng GlaxoSmithKline, Anh). Chuột nude (Hãng Charles River, Mỹ) 6 - 8 tuần tuổi, chia thành<br /> 6-7<br /> 4 nhóm (10 con/nhóm) được ghép u tế bào HT29 (10 tế bào/con) dưới da đùi, khi khối u có<br /> 3<br /> kích thước khoảng 20 - 40 mm (sau 7 - 10 ngày ghép), tiến hành tiêm virut vào khối u với liều<br /> 7<br /> 10 CFU/con, 2 lần/tuần, trong 3 tuần, nhóm chứng tiêm PBS. Kết quả và kết luận: khối u ở<br /> nhóm tiêm virut phát triển chậm và thời gian sống dài hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với<br /> nhóm chứng; nhóm tiêm phối hợp virut có kích thước u phát triển chậm và thời gian sống dài<br /> hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm tiêm đơn virut. Như vậy, phối hợp vắc xin MeV<br /> và MuV kháng u tế bào HT29 trên chuột nude tốt hơn so với từng loại virut.<br /> * Từ khóa: Ung thư đại trực tràng; Vắc xin virut sởi và quai bị; Tác dụng kháng ung thư.<br /> <br /> Assessing Anti-Cancer Efficacy of Measles and Mumps Virus Vaccine<br /> Combination on Nude Mice Bearing Human Colorectal Cancer Tumors<br /> Summary<br /> Objectives: Evaluation of the anti-cancer effects of measles and mumps virus vaccine<br /> combination on nude mice bearing human colorectal cancer tumor. Materials and methods:<br /> Measles and mumps virus vaccine (MeV and MuV) were separated from Priorix vaccine<br /> (GlaxoSmithKline, UK). Nude mice (Charles River, USA), 6 - 8 weeks old, were divided into<br /> 6-7<br /> 4 groups (10 mice/group). Nude mice were injected subcutaneously at thighs with 10 HT29 cells,<br /> 3<br /> when the tumor was about 20 - 40 mm (posttreatment 7 - 10 days) carry out to inject MeV and<br /> 7<br /> MuV into the tumor with a dose of 10 CFU/mice, twice weekly for 3 weeks, the control group was<br /> injected by PBS. Results and conclusions: The tumor size grew slowly and survival time of the<br /> virus-treated groups was significantly long (p < 0.05) versus that of the control group. The tumor<br /> size grew slowly and survival time of the virus-treated combination group was significantly long<br /> (p < 0.05) versus that of viral-treated single groups. Thus, MeV and MuV combination virotherapy<br /> treated colorectal tumor on nude mice was better than virus-treated single therapy.<br /> *Keywords: Colorectal cancer; Measles and mumps virus vaccine; Anti-cancer effect.<br /> * Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn)<br /> Ngày nhận bài: 03/01/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/02/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 02/03/2018<br /> <br /> 38<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư đại trực tràng là một gánh<br /> nặng rất lớn cho sức khỏe cộng đồng.<br /> Trên thế giới, đây là loại ung thư phổ biến<br /> thứ ba ở nam giới và thứ hai ở nữ. Ở các<br /> nước phương Tây, hàng năm khoảng<br /> 917.000 trường hợp mắc UTĐTT, là nguyên<br /> nhân đứng hàng thứ hai gây tử vong do<br /> ung thư [1]. Hiện nay, có nhiều phương<br /> pháp điều trị UTĐTT, bao gồm cả các<br /> phương pháp điều trị đích và sản phẩm<br /> thuốc có hoạt tính sinh học như kháng<br /> thể đặc hiệu kháng nguyên… Virotherapy<br /> Oncolytic (OV) là một phương thức điều<br /> trị ung thư mới, là phương pháp biến sự<br /> nhân lên của virut thành vũ khí tiêu diệt tế<br /> bào ung thư mà không ảnh hưởng đến<br /> các tế bào lành. Có ít nhất 11 loại virut,<br /> bao gồm: adenovirus, vaccinia virut,<br /> coxsackievirut, reovirus, virut sởi (MeV),<br /> virut quai bị (MuV)… đang được nghiên cứu<br /> và thử nghiệm lâm sàng điều trị nhiều loại<br /> ung thư khác nhau. Hiện nay, virut Herpes<br /> simplex biến đổi gen là IMLYGIC™<br /> (T-VEC/Talimogene Laherparepvec) đã<br /> được phê chuẩn điều trị bệnh nhân (BN)<br /> bị ung thư hắc sắc tố tái phát sau điều trị<br /> phẫu thuật ở Mỹ và các nước liên minh<br /> châu Âu [2].<br /> Virut vắc xin sởi và quai bị (MeV và<br /> MuV) thuộc gia đình Paramyxoviridae có<br /> tiềm năng ly giải tế bào u cao. Chúng có<br /> nhiều đặc điểm tự nhiên rất thích hợp để<br /> phát triển thành tác nhân điều trị ung thư<br /> như: tính ổn định gen cao, độ an toàn cao<br /> đối với con người [2], kết hợp với tiềm<br /> năng biến đổi gen tạo ra MeV và MuV tái<br /> tổ hợp có các thuộc tính trị liệu ung thư<br /> rất tốt. Lợi thế ly giải tế bào u rất lớn<br /> của MeV và MuV là khả năng hình thành<br /> <br /> hợp bào, đó là sự hợp nhất tế bào bị<br /> nhiễm virut với tế bào lân cận không<br /> nhiễm virut, đây là cơ chế tạo cho chúng<br /> lây lan mà không cần giải phóng các hạt<br /> virut trưởng thành ra ngoài tế bào. Sự<br /> hợp nhất các tế bào hình thành hợp bào<br /> (50 - 100 tế bào) tương quan với tiềm<br /> năng ly giải tế bào u của chúng. Sự hình<br /> thành hợp bào góp phần vào hiệu quả<br /> virut gây ly giải tế bào u, làm cho virut<br /> nhân lên và hạn chế tiếp xúc với kháng<br /> thể trung hòa trong máu vật chủ. Hợp bào<br /> tiết ra một lượng lớn “syncytiosome”,<br /> đó là các túi giống như exosome biểu<br /> hiện kháng nguyên khối u (TAA) cao qua<br /> các phân tử MHC. Ngoài ra, các tế bào<br /> DC trình diện chéo TAA được tăng cường<br /> mạnh bởi glycoprotein hợp màng của MeV<br /> và MuV. Một lợi thế nữa của MuV và MeV<br /> là protein HN và N hoạt động như một<br /> sialidase, có khả năng loại bỏ dư lượng<br /> axít sialic từ bề mặt tế bào khối u làm<br /> giảm tăng trưởng tế bào ác tính, kích hoạt<br /> các tế bào NK và bài tiết của IFN-γ [4].<br /> Tuy nhiên, đến nay chưa có nghiên cứu<br /> in vivo đánh giá hiệu quả phối hợp vắc xin<br /> MeV và MuV điều trị UTĐTT người. Do đó,<br /> chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm:<br /> Đánh giá hiệu quả phối hợp virut vắc xin<br /> sởi và quai bị kháng khối u tế bào dòng<br /> UTĐTT người (HT29) trên chuột nude.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> - Tế bào Vero và HT29: được nuôi cấy<br /> trong phòng thí nghiệm với môi trường<br /> nuôi cấy DMEM hay RPMI (thêm 10%<br /> foetal bovine serum, 1% glutamine và 1%<br /> kháng sinh), duy trì tế bào ở tủ ấm 370C,<br /> 5% CO2.<br /> 39<br /> <br /> TẠP CHÍ Y DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018<br /> 104 tế bào/200 l/giếng, duy trì tế bào trên<br /> đĩa 96 giếng ở tủ ấm 370C, 5% CO2.<br /> <br /> - Vắc xin MeV và MuV sống, giảm độc<br /> lực: phân lập, tăng sinh MeV và MuV<br /> nguồn gốc từ vắc xin priorix (Hãng<br /> GlaxoSmithKline, Anh), thực hiện tại<br /> Trường Đại học Quốc gia Singapore.<br /> <br /> Sau 24 giờ, kiểm tra dưới kính hiển vi<br /> thấy tế bào Vero bám đáy tốt. Tiến hành<br /> nhiễm virut vào các giếng theo hàng A, B,<br /> C, D, E, F, I, tương ứng với nồng độ 10-2<br /> đến 10-8 của stock virut, cột 11 và 12 là<br /> nhóm chứng (không nhiễm). Kiểm tra tế<br /> bào Vero nhiễm virut ở các giếng trên đĩa<br /> 96 giếng hàng ngày dưới kính hiển vi.<br /> Đến ngày thứ 6 nhiễm virut, các giếng có<br /> hình ảnh nhiễm virut rõ, tiến hành<br /> nhuộm xanh methylen và tính TCID50 theo<br /> công thức:<br /> <br /> - Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mice):<br /> chuột nude 6 - 8 tuần tuổi (Hãng Charles<br /> River, Mỹ) được nuôi trong phòng sạch.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Chuẩn độ virut (TCID50):<br /> - Nhiễm virut tế bào Vero trên đĩa<br /> 96 giếng: gieo tế bào Vero vào các giếng<br /> trên đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào<br /> I: Tính khoảng tỷ lệ (PD):<br /> <br /> (% CPE ở nồng độ pha loãng có % CPE > 50%) - (50%)<br /> (% CPE ở nồng độ pha loãng có % CPE > 50%) - (% CPE ở nồng độ pha loãng có % CPE < 50%)<br /> <br /> II: Tính (-Log) nồng độ pha loãng có % CPE > 50% (10-3 sẽ là 3)<br /> TCID50/ml = 10I+II/ml (CPE: giếng có tế bào nhiễm virut)<br /> Đổi chuẩn độ TCID50 sang CFU: CFU/ml = 0,7 x TCID50/ml.<br /> * Tạo khối u trên chuột nude và điều trị:<br /> Tiêm tế bào HT29 (107 tế bào/chuột) vào dưới da đùi chuột nude. Sau 7 - 10 ngày<br /> tiêm tế bào u, kích thước khối u đạt khoảng 20 - 30 mm3, chuột có khối u được chia<br /> ngẫu nhiên thành 4 nhóm (10 con/1 nhóm), 3 nhóm được điều trị bằng tiêm virut nội u<br /> lần lượt là MeV + MuV, MuV và MeV, nhóm chứng tiêm bằng dung dịch PBS. Liều điều<br /> trị là 107 CFU/con, 2 lần/tuần, trong 3 tuần. Dùng thước kẹp đo khối u (2 lần/tuần).<br /> Thực hiện các bước thí nghiệm trên chuột tuân theo hướng dẫn sử dụng và chăm sóc<br /> động vật thí nghiệm.<br /> Công thức tính thể tích khối u:<br /> 3<br /> <br /> Chiều rộng2 (mm) x chiều dài (mm)<br /> <br /> Thể tích khối u (mm ) =<br /> 2<br /> <br /> Tiêm tế bào HT29 vào<br /> đùi chuột gây u<br /> <br /> Đo kích thước khối u ở đùi chuột<br /> <br /> Hình 1: Ghép u dưới da đùi chuột và đo kích thước u.<br /> 40<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2018<br /> * Phương pháp phân tích kết quả:<br /> Dùng các thuật toán thống kê, sử dụng phần mềm STATVIEW và SPSS.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Kích thƣớc u.<br /> C o n tro l<br /> <br /> Thểthước<br /> tích khối<br /> u<br /> Kích<br /> u<br /> 3<br /> <br /> M uV<br /> <br /> (mm )<br /> <br /> M eV<br /> <br /> 10000<br /> <br /> M uV +M eV<br /> <br /> P 0,05).<br /> 2. Thời gian sống của chuột nude.<br /> Thời<br /> giansống<br /> sốngtrung<br /> trungbình<br /> bình (ngày)<br /> Thời gian<br /> 60<br /> <br /> MuV+MeV<br /> MuV<br /> MeV<br /> Control<br /> <br /> 40<br /> <br /> 20<br /> <br /> p 0,05).<br /> BÀN LUẬN<br /> Với những tiến bộ của công nghệ sinh<br /> học và hiểu biết về virut ly giải tế bào ung<br /> thư đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu<br /> khám phá nhiều loài virut kháng ung thư<br /> có hiệu quả. Trong nghiên cứu này, để<br /> đánh giá hiệu quả phối hợp vắc xin virut<br /> MeV và MuV ly giải tế bào UTĐTT người<br /> HT29 in vivo, chúng tôi đã ghép u tế bào<br /> HT29 khu trú dưới da đùi chuột nude, phù<br /> hợp cho liệu pháp điều trị tiêm virut nội u,<br /> gia tăng khả năng virut tiếp xúc và xâm<br /> nhập vào khối u.<br /> Số lượng thụ cảm thể được chứng<br /> minh là yếu tố quan trọng quyết định đến<br /> tính lây nhiễm hay hiệu quả lan truyền của<br /> virut vào các tế bào u đích [5]. Sử dụng<br /> nhiều loại tế bào biểu hiện từ thấp đến<br /> cao mức thụ thể CD46, đã xác định khả<br /> năng lây nhiễm virut sởi tăng lên theo<br /> số lượng thụ cảm thể. Hợp bào ít ở mức<br /> 42<br /> <br /> thụ cảm thể biểu hiện thấp và đòi hỏi mức<br /> tới hạn thụ cảm thể CD46 để tạo hợp bào<br /> lớn hơn, gây tổn thương phá hủy tế bào<br /> đáng kể [5]. Chúng ta đã biết thụ cảm thể<br /> CD46, Nectin-4 của virut sởi và thụ cảm<br /> thể MuV-JL của virut quai bị. Ngoài ra,<br /> axít sialic có nhiều ở tế bào ác tính làm<br /> cho chúng lây nhiễm tế bào ung thư có<br /> tính chọn lọc cao hơn. Tế bào ung thư<br /> biểu hiện mức cao CD46, Nectin-4 hay<br /> axít sialic nhằm bảo vệ chúng khỏi hoạt<br /> động ly giải tế bào qua con đường bổ thể<br /> [5]. Mức độ phong phú của thụ cảm thể<br /> xác định tính đặc hiệu và hiệu quả lây<br /> nhiễm của virut vào tế bào u. Tính đặc<br /> hiệu khối u đối với virut có thể xảy ra ở<br /> mức nội bào sau khi virut xâm nhập vào<br /> tế bào, virut có thể tận dụng được các<br /> yếu tố khiếm khuyết gen (interferon, kích<br /> hoạt Ras, p53, Rb) chỉ có duy nhất ở tế<br /> bào khối u, làm cho chúng có tính chọn<br /> lọc tế bào khối u và không xảy ra ở các tế<br /> bào bình thường [5]. Trong khi đó, nhiều<br /> tài liệu cho thấy virut ly giải tế bào khối u<br /> tận dụng được những khiếm khuyết gen<br /> trong tế bào khối u để khuếch đại bộ gen<br /> của chúng và tăng biểu hiện bộ gen đó.<br /> Tuy nhiên, vẫn chưa rõ phạm vi mà MeV<br /> và MuV tận dụng con đường khiếm khuyết<br /> gen để ly giải tế bào u như thế nào,<br /> cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn về vấn<br /> đề này.<br /> Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho<br /> thấy virut MeV và MuV có tác dụng làm<br /> chậm phát triển khối u tế bào HT29 trên<br /> đùi chuột nude bắt đầu vào ngày thứ ba<br /> sau khi tiêm virut (hình 2). Khả năng virut<br /> lây lan tạo ra hoạt động kháng u là do virut<br /> nhân lên trong tế bào đích và “bắt kịp” với<br /> <br />