TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br />
<br />
TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH ADN TỪ CÁC MẪU BỊ PHÂN HỦY<br />
TRONG THỰC NGHIỆM<br />
Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*<br />
Nguyễn Minh Hải**; Ngô Trường Giang*<br />
TÓM TẮT<br />
Nghiên cứu tiến hành trên 16 mẫu máu không bảo quản được xử lý ở nhiệt độ phòng<br />
trong các khoảng thời gian 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần và 16 tuần, hoặc đun ở 1000C. Tiến hành<br />
tách chiết ADN bằng hạt từ tính, nhân gen GADPH, điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Kết<br />
quả: các phản ứng PCR cho sản phẩm đặc trưng. Như vậy, tách chiết ADN bằng hạt từ tính,<br />
các mẫu ADN bị biến tính một phần có đủ chất lượng ổn định, đủ điều kiện để có thể tiến<br />
hành các phân tích tiếp theo.<br />
* Từ khoá: Nhận dạng cá thể; Mini STRs; Tách triết, tinh sạch ADN.<br />
<br />
DNA EXTRACTION AND PURIFICATION FROM<br />
EXPERIMENTALLY DEGRADED SAMPLES<br />
SUMMARY<br />
The study was carried out on 16 blood samples, which were not preserved for different<br />
period of time: 2 weeks, 8 weeks and 16 weeks in condition of 370C temperature with 100%<br />
humidity, and in boiling water for 30 minutes, 2 hours, 4 hours and 5 hours. DNA was<br />
extracted using both normal kit and magnetic particle based DNA IQ, Promega kit. DNA<br />
samples were evaluated using Nano Drop 1000. DNA amplification for mini STR analysis<br />
was conducted using PowerPlex S5, Promega, USA. Results: all mini STR markers were<br />
successfully amplified and informative thus it can be used for individual identification in<br />
case of samples partially degraded.<br />
* Key words: Individual identification; Mini-STRs; DNA extraction and purification.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Trong lĩnh vực ADN pháp y, nhiều<br />
trường hợp mẫu bị biến tính sau một<br />
<br />
thời gian nhất định hoặc bị biến tính do<br />
các tác nhân lý hóa khác nhau [3, 4].<br />
Chính vì vậy, việc tách chiết ADN đóng<br />
vai trò quan trọng để thu được mẫu ADN<br />
<br />
* Học viện Quân y<br />
** Viện Y học Hàng không<br />
Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tranvankhoa@gmail.com)<br />
Ngày nhận bài: 8/10/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/10/2013<br />
Ngày bài báo được đăng: 7/11/2013<br />
68<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br />
<br />
có đủ chất lượng và số lượng cho quá<br />
trình phân tích tiếp theo (PCR) [2]. Để<br />
đánh giá, lựa chọn phương pháp tách<br />
chiết ADN phù hợp, chúng tôi tiến hành<br />
xử lý các mẫu máu trong những điều<br />
kiện và thời gian khác nhau [1].<br />
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ<br />
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br />
16 mẫu máu nghiên cứu được lấy và<br />
chống đông bằng EDTA 5 ml/mẫu. Chia<br />
mẫu máu làm 2 lô: có biến tính và không<br />
biến tính. Cách thức xử lý như sau: mẫu<br />
máu đối chứng: Không xử lý gì, bảo<br />
quản ở nhiệt độ -800C cho đến khi tách<br />
chiết. Mẫu xử lý: tạo mẫu ADN biến<br />
tính một phần bằng cách để mẫu trong<br />
môi trường với thời gian dài (không bảo<br />
quản). Xử lý tạo mẫu ADN biến tính<br />
thực nghiệm theo mô hình của Dixon và<br />
CS 2006 [3]: để mẫu ở môi trường 370C<br />
với độ ẩm 100% trong thời gian 2 tuần,<br />
8 tuần, 16 tuần. Tạo mẫu ADN biến tính<br />
một phần bằng tác nhân nhiệt độ ở 1000C<br />
trong 30 phút, 2 giờ, 4 giờ và 5 giờ.<br />
2. Vật liệu nghiên cứu.<br />
Nhóm hóa chất dùng cho tách chiết<br />
ADN: QIAamp ADN blood Mini Kit,<br />
ADN-IQ system, promega. Nhóm hóa<br />
chất dùng cho PCR: đệm enzyme Taq<br />
polymerase 10X, MgCl2 25 mM, dNTPs<br />
<br />
5 mM, Taq polymerase 5 U/µl, nước cất<br />
khử ion và khử trùng, nhóm hóa chất<br />
dùng cho điện di agarose, đệm TBE,<br />
ethidium bromide. Nhóm hóa chất dùng<br />
cho phản ứng nhân gen và phân tích<br />
mini STR: powerplex S5 - promega,<br />
POP-4™ polymer (P/N 4352755), HiDiTM formamide (P/N 4311320), máy<br />
ly tâm (Mikro 200 - Hittich, Đức), máy<br />
PCR 9700 (ABI, Mỹ), bộ điện di agarose:<br />
nguồn 300V, bể điện di (biorad, Mỹ),<br />
buồng thao tác PCR, block gia nhiệt,<br />
máy khuấy từ, máy định lượng Nanodrop,<br />
máy điện di mao quản 3130XL.<br />
3. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
* Tách chiết ADN:<br />
Tách chiết bằng QIAamp ADN blood<br />
mini kit đối với mẫu không biến tính theo<br />
quy trình của nhà sản xuất.<br />
Tách chiết bằng ADN-IQ system,<br />
promega đối với mẫu biến tính theo quy<br />
trình như sau [5]:<br />
+ Bước 1: chia nhỏ phần máu cho vào<br />
ống nghiệm.<br />
+ Bước 2: thêm lysis buffer, ủ 700C<br />
trong 30 phút để hoà tan mẫu.<br />
+ Bước 3: ly tâm để loại bỏ bớt tạp<br />
chất.<br />
+ Bước 4: thêm hạt từ tính để tạo<br />
phức hợp "hạt từ tính-thành phần tích<br />
điện (-)".<br />
70<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br />
<br />
+ Bước 5: đặt ống nghiệm vào giá từ<br />
tính để lọc lấy phức hợp.<br />
+ Bước 6: rửa nhiều lần bằng wash<br />
buffer để thu phức hợp "hạt từ tính ADN"<br />
+ Bước 7: để khô ở nhiệt độ phòng để<br />
loại bớt nước.<br />
<br />
Thành phần phản ứng PCR: Powerplex<br />
S5 5X Master Mix 5 µl, Power Plex S5<br />
10X Primer Pair Mix 2,5 µl, ADN khuôn<br />
0,25 - 0,50 ng, nước cất vừa đủ 25 µl [6].<br />
Nhân gen trên máy PCR 9700 (ABI Mỹ) theo chu trình nhiệt.<br />
NHIỆT ĐỘ<br />
<br />
THỜI GIAN<br />
<br />
SỐ CHU KỲ<br />
<br />
o<br />
<br />
96 C<br />
<br />
2 phút<br />
<br />
1 chu kỳ<br />
<br />
94oC<br />
<br />
30 giây<br />
<br />
60oC<br />
<br />
2 phút<br />
<br />
+ Bước 9: thu dung dịch ADN.<br />
<br />
72oC<br />
<br />
90 giây<br />
<br />
Sau khi thu được mẫu ADN, chúng<br />
<br />
60oC<br />
<br />
45 phút<br />
<br />
1 chu kỳ<br />
<br />
4oC<br />
<br />
∞<br />
<br />
1 chu kỳ<br />
<br />
+ Bước 8: thêm elution buffer và ủ ở<br />
0<br />
65 C trong 5 phút để tách ADN ra khỏi<br />
hạt từ tính.<br />
<br />
tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ<br />
tinh khiết của sản phẩm bằng phương<br />
pháp định lượng trên máy đo quang phổ<br />
Nanodrop.<br />
* Phương pháp định tính, định lượng<br />
ADN:<br />
Sản phẩm ADN thu được sau quá<br />
trình tách chiết được định lượng trên<br />
máy Nanodrop ở bước sóng 260/280 nm<br />
nhằm kiểm tra độ tinh sạch. 5 μl mỗi<br />
mẫu ADN sau tách chiết cũng được điện<br />
di trên gel agarose để kiểm tra chất lượng<br />
ADN. Những mẫu có nồng độ thấp tiến<br />
hành nhân gen GADPH và điện đi để<br />
đánh giá khả năng nhân gen với cặp mồi<br />
F-5’CCCCACACACATGCACTTACC-3’;<br />
R-5’CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’.<br />
* Phản ứng PCR nhân gen mini STR:<br />
<br />
30 chu kỳ<br />
<br />
Điện di mao quản tự động trên hệ<br />
thống máy giải trình tự AB 3130XL,<br />
phân tích alen: thêm 1 µl sản phẩm PCR<br />
hoặc 1 µl của PowerPlex® S5 Allelic<br />
Ladder Mix. Biến tính 95 trong 3 phút,<br />
sau đó để ngay trong đá 3 phút trước khi<br />
tra mẫu điện di.<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br />
BÀN LUẬN<br />
1. Kết quả tách chiết ADN.<br />
Đối với lượng máu, do hàm lượng<br />
ADN lớn nên khi tách xong, tiến hành<br />
kiểm tra nồng độ ADN trên máy Nano<br />
Drop, điện di trên gel agarose 0,8%,<br />
nhuộm trong dung dịch EtBr 10 µg/ml,<br />
sau đó quan sát dưới ánh sáng tử ngoại<br />
bước sóng 254 nm.<br />
71<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br />
<br />
Bảng 1: Kết quả đo nồng độ và độ<br />
tinh sạch ADN tách từ 16 mẫu máu không<br />
bị biến tính.<br />
MẪU<br />
<br />
NỒNG<br />
ĐỘ<br />
ADN<br />
(µg/µl)<br />
<br />
1<br />
<br />
42,4<br />
<br />
1,73<br />
<br />
9<br />
<br />
47,5<br />
<br />
1,73<br />
<br />
2<br />
<br />
52,16<br />
<br />
1,72<br />
<br />
10<br />
<br />
61,1<br />
<br />
1,74<br />
<br />
3<br />
<br />
43,4<br />
<br />
1,80<br />
<br />
11<br />
<br />
49,9<br />
<br />
1,71<br />
<br />
4<br />
<br />
51,3<br />
<br />
1,71<br />
<br />
12<br />
<br />
47,3<br />
<br />
1,70<br />
<br />
5<br />
<br />
51,9<br />
<br />
1,69<br />
<br />
13<br />
<br />
54,0<br />
<br />
1,72<br />
<br />
6<br />
<br />
60,2<br />
<br />
1,79<br />
<br />
14<br />
<br />
52,5<br />
<br />
1,78<br />
<br />
7<br />
<br />
45,6<br />
<br />
1,73<br />
<br />
15<br />
<br />
59,8<br />
<br />
1,83<br />
<br />
8<br />
<br />
42,4<br />
<br />
1,73<br />
<br />
16<br />
<br />
40,23<br />
<br />
1,61<br />
<br />
A /A<br />
260<br />
<br />
280<br />
<br />
MẪU<br />
<br />
NỒNG<br />
ĐỘ<br />
A /A<br />
260 280<br />
ADN<br />
(µg/µl)<br />
<br />
Từ kết quả trên ta thấy, nồng độ ADN<br />
khá cao, tỷ số A260/A280 là chỉ số để đánh<br />
giá độ tinh sạch của ADN, nằm trong<br />
khoảng 1,6 - 1,8: chứng tỏ ADN có độ<br />
sạch cần thiết cho nghiên cứu phân tích<br />
tiếp theo. Với các mẫu này, chúng tôi<br />
cũng điện di agarose kiểm tra cho thấy<br />
kết quả tốt (hình 1). Như vậy, cũng có<br />
thể đánh giá quy trình tách chiết ADN<br />
không bị biến tính, có thể khẳng định<br />
dùng kit thông thường hoàn toàn tốt.<br />
<br />
Hình 1: Ảnh điện di kiểm tra ADN trên<br />
gel agarose 0,8% với các mẫu không biến<br />
tính được tách bằng kit thông thường.<br />
<br />
Bảng 2: Kết quả đo nồng độ tinh<br />
sạch ADN tách chiết từ 16 mẫu máu<br />
biến tính do nhiệt độ 1000C trong 5 giờ.<br />
MẪU<br />
<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
7<br />
8<br />
<br />
NỒNG<br />
NỒNG<br />
ĐỘ<br />
ĐỘ<br />
A260/A280 MẪU<br />
ADN<br />
ADN<br />
(µg/µl)<br />
(µg/µl)<br />
<br />
1,57<br />
2,29<br />
3,01<br />
1,48<br />
1,77<br />
2,89<br />
2,61<br />
2,90<br />
<br />
1,63<br />
1,78<br />
1,76<br />
1,62<br />
1,92<br />
1,75<br />
1,93<br />
1,90<br />
<br />
9<br />
10<br />
11<br />
12<br />
13<br />
14<br />
15<br />
16<br />
<br />
1,67<br />
2,64<br />
3,39<br />
2,22<br />
1,86<br />
3,33<br />
1,55<br />
2,23<br />
<br />
A260/A280<br />
<br />
1,60<br />
1,66<br />
1,81<br />
1,75<br />
1,81<br />
1,85<br />
1,64<br />
1,72<br />
<br />
Mặc dù mẫu bị biến tính thu được<br />
nồng độ thấp hơn các mẫu không bị biến<br />
tính, nhưng vẫn đảm bảo tinh sạch. Đối<br />
với mẫu máu bị biến tính một phần bằng<br />
thực nghiệm, tiến hành tách chiết thu<br />
ADN bằng hạt từ tính. Sau tách chiết,<br />
điện di gel agarose kiểm tra không thấy<br />
xuất hiện băng. Để đánh giá khả năng<br />
nhân gen, chúng tôi sử dụng mồi GAPDH<br />
để nhân gen này, sản phẩm PCR có kích<br />
thước 97 bp. Dưới đây là hình ảnh điện<br />
di kiểm tra sản phẩm sau PCR.<br />
<br />
Hình 2: Ảnh điện di mẫu biến tính tách<br />
bằng kit thông thường.<br />
72<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br />
<br />
Từ trái sang phải: chứng âm, chứng<br />
dương, marker ADN 100 bp, 2 mẫu biến<br />
tính 8 tuần: 1 mẫu (+), 1 mẫu (-), mẫu<br />
biến tính nhiệt 30 phút (+), 3 mẫu biến<br />
tính nhiệt 5 giờ đều (-).<br />
<br />
Hình 3: Ảnh điện di mẫu biến tính tách<br />
bằng hạt từ tính.<br />
Từ trái sang phải: chứng âm, chứng<br />
dương, marker ADN 100 bp. Hàng trên:<br />
các mẫu biến tính 8 tuần và biến tính<br />
nhiệt 5 giờ; hàng dưới: các mẫu biến tính<br />
nhiệt 5 giờ.<br />
<br />
Hình 4: Ảnh điện di mẫu biến tính tách<br />
bằng hạt từ tính.<br />
<br />
Từ trái sang phải: chứng âm, chứng<br />
dương, marker ADN 100 bp. Hàng trên:<br />
các mẫu biến tính 8 tuần; hàng dưới các<br />
mẫu biến tính 16 tuần.<br />
2. Kết quả bƣớc đầu xác định kiểu<br />
gen của các locus STR trên máy giải<br />
trình tự gen.<br />
Với các mẫu ADN thu được, tiến hành<br />
phản ứng nhân gen để xác định khả năng<br />
nhân gen và phân tích mini STR. Sử dụng<br />
bộ kit nhân gen Powerplex S5 PCR<br />
Amplification kit. Đây là bộ kit cho phép<br />
đồng khuếch đại và phát triển 5 locus bao<br />
gồm cả D8S1179, D18S51, FGA và<br />
TH01. Đối với các mẫu này, sau khi chạy<br />
điện di kết quả thu được xử lý bằng phần<br />
mềm Genemapper ID 3.2. Phần mềm này<br />
sẽ so sánh kích thước các băng ADN thu<br />
được ở mẫu nghiên cứu với những băng<br />
tương ứng trên thang alen chuẩn và cho<br />
kết quả chi tiết về kiểu gen của từng locus<br />
như hình minh họa ở hình sau.<br />
<br />
Hình 5: Hình ảnh điện di của mẫu số 2<br />
không bị biến tính.<br />
73<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
