Tần suất và sự đột biến mất đoạn gien lmp1 ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng

Chia sẻ: Sunshine_6 Sunshine_6 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

49
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Epstein-Barr (EBV) - virút có mối quan hệ mật thiết đối với ung th- vòm mũi họng (UTVMH). Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 20 cặp mẫu (gồm máu ngoại vi và sinh thiết vòm họng) bệnh nhân UTVMH thể không biệt hoá, 5 mẫu bệnh nhân ung th- vùng đầu, cổ không ph.i UTVMH. Mục đích của nghiên cứu này nhằm điều tra tần suất của gien LMP1 là một trong những gien ở thể tiềm ẩn của virút và 30 mẫu máu ngoại vi của những ng-ời khoẻ mạnh....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tần suất và sự đột biến mất đoạn gien lmp1 ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng

TCNCYH 23 (3) 2003 TÇn suÊt vµ sù ®ét biÕn mÊt ®o¹n gien lmp1 ë bÖnh nh©n ung th− vßm mòi häng Ph¹m ThÞ NguyÖt H»ng, Phan ThÞ Phi Phi, NguyÔn V¨n §«, B¹ch Kh¸nh Hoµ, TrÇn ThÞ ChÝnh §¹i häc Y Hµ Néi Epstein-Barr (EBV) - virót cã mèi quan hÖ mËt thiÕt ®èi víi ung th− vßm mòi häng (UTVMH). Chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu 20 cÆp mÉu (gåm m¸u ngo¹i vi vµ sinh thiÕt vßm häng) bÖnh nh©n UTVMH thÓ kh«ng biÖt ho¸, 5 mÉu bÖnh nh©n ung th− vïng ®Çu, cæ kh«ng ph¶i UTVMH. Môc ®Ých cña nghiªn cøu nµy nh»m ®iÒu tra tÇn suÊt cña gien LMP1 lµ mét trong nh÷ng gien ë thÓ tiÒm Èn cña virót vµ 30 mÉu m¸u ngo¹i vi cña nh÷ng ng−êi khoÎ m¹nh. Sö dông hai cÆp måi LMP1 dùa theo kinh nghiÖm cña phßng thÝ nghiÖm MTC, viÖn Karolinska, Thuþ ®iÓn. Hai cÆp måi nµy ®Æc hiÖu vµ thiÕt kÕ cho gien LMP1 ®ét biÕn, cã vÞ trÝ tõ 168592 - 168174 vµ tõ vÞ trÝ 168373 - 168174 (tõ genom cña EBV). KÕt qu¶ thu ®−îc nh− sau: 1. Tû lÖ gien LMP1 - EBV ë m¸u ngo¹i vi ng−êi khoÎ m¹nh lµ 96,7% (29/30 ca d−¬ng tÝnh). 2. Tû lÖ gien LMP1 - EBV ë cÆp mÉu bÖnh nh©n UTVMH thÓ biÓu m« kh«ng biÖt ho¸ lµ 100% (20/ 20 tr−êng hîp d−¬ng tÝnh) 3. Tû lÖ gien LMP1 ë bÖnh nh©n ung th− vïng ®Çu, cæ kh«ng ph¶i UTVMH lµ 100% (5/ 5 tr−êng hîp d−¬ng tÝnh). 4. Trªn ®iÖn di, 90% gien LMP1 - EBV ë m« sinh thiÕt vßm häng bÖnh nh©n UTVMH cã hiÖn t−îng ®ét biÕn mÊt ®o¹n trong khi gien LMP1 - EBV ë m¸u ngo¹i vi cña nh÷ng bÖnh nh©n nµy chØ cã 10% cã ®ét biÕn mÊt ®o¹n. I. §Æt vÊn ®Ò Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña nhiÒu nhµ EBV thuéc nhãm Herpes virót cã lâi ADN khoa häc trªn thÕ giíi, tr×nh tù gien LPM1 cña xo¾n kÐp, liªn quan gÇn ®Õn mét vµi khèi u ¸c c¸c bÖnh nh©n UTVMH lµ kh¸c nhau, ®Æc biÖt tÝnh ë ng−êi trong ®ã cã ung th− vßm mòi häng cã ®ét biÕn mÊt 30 bp ë ®Çu –C tËn so víi gien (UTVMH), ®Æc biÖt lµ víi thÓ ung th− biÓu m« LMP1 cña dßng tÕ bµo B95 – 8[5][6][7] ... H¬n kh«ng biÖt ho¸. Mèi liªn quan nµy ®−îc chøng n÷a, cã nh÷ng b»ng chøng cho r»ng, ®ét biÕn minh lÇn ®Çu tiªn do sù xuÊt hiÖn kh¸ng thÓ mÊt 30bp cña gien LMP1 lµ mét nh©n tè thóc chèng kh¸ng nguyªn EBV trong huyÕt thanh ®Èy sù ph¸t triÓn cña khèi u (Li et al., 1996) cña bÖnh nh©n UTVMH. Mèi liªn quan nµy [7]. ViÖc mÊt 30bp cña gien LMP1 cã thÓ lµm ®−îc kh¼ng ®Þnh thªm bëi viÖc ph¸t hiÖn sù cã thay ®æi cÊu tróc dÉn ®Õn thay ®æi chøc n¨ng mÆt cña EBV trong nh÷ng mÉu sinh thiÕt cña protein, ¶nh h−ëng tíi viÖc nhËn biÕt UTVMH. H¬n n÷a, gÇn ®©y b¶n sao cña EBV ë protein bëi hÖ thèng miÔn dÞch [9]. ViÖt Nam thÓ tiÒm Èn gåm EBNA1 vµ LMP1, LMP2 ®· lµ mét n−íc cã tÇn suÊt UTVMH kh¸ cao trong ®−îc t×m thÊy trong c¸c mÉu sinh thiÕt lóc c¸c n−íc ¢u Mü th× qu¸ thÊp tuy r»ng tû lÖ UTVMH. Trong sè c¸c protein m· ho¸ cña nhiÔm EBV trªn toµn cÇu lµ cao nh− nhau (95 – virót EBV ë thÓ tiÒm Èn trªn th× LMP1 lµ mét 97%). protein quan träng: cã thÓ øc chÕ sù biÖt ho¸ vµ XuÊt ph¸t tõ t×nh h×nh thùc tiÔn nµy, chóng g©y biÕn chuyÓn tÕ bµo biÓu m« [7]. t«i tiÕn hµnh ®Ò tµi víi môc ®Ých: 91
TCNCYH 23 (3) 2003 1. X¸c ®Þnh tû lÖ gien LMP1 ë ng−êi mM dNTP; 2.0mM MgCl2; 1 ®¬n vÞ Taq ADN khoÎ m¹nh vµ bÖnh nh©n UTVMH. polymerase (Perkin – Elmer) trong PCR buffer IX. Tæng thÓ tÝch ph¶n øng lµ 50µl. 2. X¸c ®Þnh tû lÖ gien LMP1 ë bÖnh nh©n ung th− vïng ®Çu, cæ kh«ng ph¶i UTVMH. - §iÒu kiÖn chu tr×nh nhiÖt: 940C/ 4 phót; 35 3. Ph¸t hiÖn ®ét biÕn gien LMP1 ë bÖnh chu kú: 950C/ 30 gi©y, 570C/ 1 phót 30 gi©y, nh©n UTVMH. 700C/ 2 phót 30 gi©y; 720C/ 10 phót → 40C. II. §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p 2.3. Ph¶n øng PCR lång: 1. §èi t−îng 2.3.1. Ph¶n øng PCR lÇn thø nhÊt: ♦ §èi t−îng nghiªn cøu: - Tr×nh tù cÆp måi: - 20 cÆp mÉu: m¸u ngo¹i vi vµ sinh thiÕt 168592: 5’ - ATC GCG ACT CTG CTG vßm häng bÖnh nh©n UTVMH thÓ kh«ng biÖt GAA AT - 3’ ho¸. C¸c mÉu nµy ®−îc thu thËp t¹i bÖnh viÖn 168174: 5’ - CGC GGA TCC TTA GTC K Hµ Néi tõ n¨m 2000 ®Õn 2001. ATA GTA GCT TAG - 3’ ♦ §èi t−îng chøng: - Nguyªn vËt liÖu ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng - 5 mÉu sinh thiÕt bÖnh nh©n ung th− ®Çu, PCR gåm: 100ng ADN; 4µM mçi måi; 0,2 cæ kh¸c kh«ng ph¶i UTVMH. mM dNTP; 3.0 mM MgCl2; 1 ®¬n vÞ Taq ADN polymerase (Perkin – Elmer) trong PCR buffer - 30 mÉu m¸u ngo¹i vi lÊy tõ ng−êi khoÎ 1X. Tæng thÓ tÝch ph¶n øng lµ 50µl. m¹nh vÒ l©m sµng. - §iÒu kiÖn chu tr×nh nhiÖt: 940C/ 10 phót; Toµn bé mÉu sinh thiÕt trªn ®−îc b¶o qu¶n 35 chu kú: 950C/ 45 gi©y, 550C/ 1 phót 30 gi©y, ë – 700C cho ®Õn khi tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ADN. 720C/ 2 phót 30 gi©y; 720C/ 10 phót → 40C. 2. Ph−¬ng ph¸p 2.3.2. Ph¶n øng PCR lÇn thø hai: 2.1. T¸ch chiÕt ADN - Tr×nh tù cÆp måi: gièng nh− cÆp måi ®Ó - ADN t¸ch tõ m¸u ngo¹i vi theo qui tr×nh tiÕn hµnh ph¶n øng PCR (phÇn 2.2) Perchlorate. - Nguyªn vËt liÖu ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng - ADN t¸ch tõ mÉu sinh thiÕt theo qui tr×nh PCR gåm: 2 µl s¶n phÈm PCR lÇn thø nhÊt; cña t¸c gi¶ Chomczynski vµ Sacchi. 4µM mçi måi; 0,2 mM dNTP; 1.0 mM MgCl2; 2.2. Ph¶n øng PCR: 1 ®¬n vÞ Taq ADN polymerase (Perkin – Elmer) trong PCR buffer 1X. Tæng thÓ tÝch - Tr×nh tù cÆp måi: ph¶n øng lµ 50µl. 168373: 5’ - CTA GCG ACT CTG CTG - §iÒu kiÖn chu tr×nh nhiÖt: 940C/ 5 phót; 20 GAA AT - 3’ chu kú: 950C/ 30 gi©y, 600C/ 1 phót 30 gi©y, 168174: 5’ - CGC GGA TCC TTA GTC 720C/ 1 phót; 720C/ 10 phót → 40C. ATA GTA GCT TAG - 3’ -KiÓm tra s¶n phÈm PCR vµ PCR lång b»ng - Nguyªn vËt liÖu ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng c¸ch ®iÖn di trªn gel agarose 2% trong ®Öm PCR gåm: 100ng ADN; 4µM mçi måi; 0,2 TAE 1X, ®iÖn thÕ 100V, thêi gian 1 giê. 92
TCNCYH 23 (3) 2003 III. KÕt qu¶ 1. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN B¶ng 1: Hµm l−îng vµ ®é tinh khiÕt cña ADN OD OD260 OD280 OD260/ OD280 §èi t−îng ADN 0,1494 0,2831 1,894 - Hµm l−îng ADN ®−îc ®o b»ng gi¸ trÞ H×nh 2: KÕt qu¶ kiÓm tra s¶n phÈm PCR OD260 trªn quang phæ kÕ. vßng 2 trªn gel agarose 2%, ®iÖn thÕ 100V, thêi gian 1 giê. - §é tinh khiÕt cña ADN ®−îc ®o b»ng chØ Sè 1, 2, 3, 4, 5: Ng−êi khoÎ m¹nh M: thang ADN chuÈn 100 bp Sè 21, 22, 23, 24, 25: MÉu sinh thiÕt chøng. - Trªn h×nh ¶nh ®iÖn di cho thÊy: s¶n phÈm PCR cña chóng t«i cã ®é dµi kho¶ng 230bp so víi thang ADN chuÈn 100bp. 3. Tû lÖ gien LMP1 ®ét biÕn mÊt 30bp ë m« sinh thiÕt B¶ng 3: Ph¸t hiÖn gien LMP1 ®ét biÕn mÊt sè OD260/ OD280 sau khi ®o trªn quang phæ kÕ. ®o¹n b»ng kü thuËt PCR Mét ®¬n vÞ OD260 = 0,1494 t−¬ng øng víi §èi t−îng % gien LMP1 ®ét dung dÞch cã nång ®é ADN sîi ®«i lµ 0,1496 x biÕn mÊt ®o¹n 50 x 20 = 140,8µg/ ml. Sinh thiÕt UTVMH 90% (18/ 20 mÉu) H×nh 1: §iÖn di kiÓm tra ADN trªn gel agarose Sinh thiÕt UT vïng ®Çu cæ 0% (0/ 5 mÉu) 0,8%, ®iÖn thÕ 100V, thêi gian 20 phót. kh¸c kh«ng ph¶i UTVMH 1, 2, 3, 4, 5, 6: ADN t¸ch tõ m¸u ngo¹i vi cña 6 ng−êi khoÎ m¹nh 2. X¸c ®Þnh ADN - EBV ë m¸u ngo¹i vi B¶ng 2: Tû lÖ gien LPM1 - EBV ë m¸u ngo¹i vi (sö dông cÆp måi ®Ó nh©n ®o¹n ADN tõ vÞ trÝ 168592 - 168174). §èi t−îng % d−¬ng tÝnh M¸u ng−êi khoÎ m¹nh 96,7% (29/ 30 ca) M¸u ngo¹i vi ng−êi khoÎ 0% (0/ 30 mÉu) M¸u bÖnh nh©n UTVMH 100% (20/ 20) m¹nh M¸u ngo¹i vi bÖnh nh©n 10% (2/ 20 mÉu) UTVMH 93
TCNCYH 23 (3) 2003 H×nh 3: KÕt qu¶ kiÓm tra s¶n phÈm PCR tõ m« sinh thiÕt khèi u vßm häng trªn cïng mét mÉu sinh thiÕt trªn gel agarose 2%, ®iÖn thÕ bÖnh nh©n UTVMH). 100V trong 1 giê. T: s¶n phÈm PCR tõ m« sinh thiÕt khèi u vßm häng Sè 1, 2, 3, 4, 9,10: c¸c mÉu UTVMH thÓ kh«ng biÖt cña bÖnh nh©n UTVMH ho¸ B: s¶n phÈm PCR tõ m¸u ngo¹i vi cña bÖnh nh©n M: thang ADN chuÈn 100bp UTVMH Sè 21: BÖnh nh©n chøng C¸c mÉu sè 14, sè 11, sè 13, sè 16: Gåm T vµ B M: thang ADN chuÈn 100bp IV. Bµn luËn 1. X¸c ®Þnh gien LMP1 - EBV ë m¸u ngo¹i vi §èi t−îng nghiªn cøu cña chóng t«i lµ 30 mÉu m¸u ngo¹i vi ng−êi khoÎ m¹nh vµ 20 mÉu m¸u ngo¹i vi bÖnh nh©n UTVMH. Sau khi t¸ch H×nh 4.A: KÕt qu¶ kiÓm tra s¶n phÈm PCR chiÕt ®−îc ADN tæng sè tõ nh÷ng mÉu m¸u (cña c¸c cÆp mÉu) trªn gel agarose 2%, ®iÖn nµy, chóng t«i tiÕn hµnh ph¶n øng PCR lång thÕ 100V, thêi gian 1 giê. (Nested PCR) ®Ó nh©n ®o¹n gien LMP1 tõ vÞ trÝ 168592 ®Õn vÞ trÝ 168174. (Cã sù chªnh lÖch gi÷a s¶n phÈm PCR cña m¸u ngo¹i vi vµ cña m« sinh thiÕt khèi u vßm häng trªn Do sè l−îng ADN cña EBV so víi l−îng cïng mét bÖnh nh©n UTVMH). ADN tæng sè ®−îc t¸ch ra tõ m¸u ngo¹i vi cña T: s¶n phÈm PCR tõ m« sinh thiÕt khèi u vßm häng nh÷ng ng−êi khoÎ m¹nh lµ rÊt nhá, v× vËy trong cña bÖnh nh©n UTVMH nhiÒu tr−êng hîp nÕu chØ sö dông PCR mét lÇn, B: s¶n phÈm PCR tõ m¸u ngo¹i vi cña bÖnh nh©n hay nãi mét c¸ch kh¸c lµ chØ sö dông mét cÆp UTVMH måi th× sÏ kh«ng t¹o ra ®−îc ®ñ l−îng s¶n C¸c mÉu sè 1, 2, 3 gåm cã B vµ T phÈm PCR mong muèn v× l−îng ADN cña Sè 4: ChØ cã B EBV khu«n qu¸ thÊp. H¬n n÷a, chóng t«i kh«ng thÓ t¨ng nhiÒu ADN tæng sè lµm khu«n Bc: MÉu m¸u chøng ban ®Çu v× ®iÒu nµy sÏ g©y nªn tÝnh kh«ng ®Æc Tc: MÉu sinh thiÕt chøng hiÖu cña ph¶n øng PCR vµ cã thÓ cho ra nhiÒu M: thang ADN chuÈn 100bp s¶n phÈm phô. Víi kü thuËt PCR lång chóng t«i kh¾c phôc nh−îc ®iÓm nµy. S¶n phÈm PCR lÇn thø nhÊt sau ®ã sÏ ®−îc dïng lµm sîi khu«n cho ph¶n øng PCR tiÕp theo ®Ó nh©n b¶n ®o¹n ADN cña gien LMP1. ë lÇn ch¹y PCR thø hai, chóng t«i sö dông 2µl s¶n phÈm PCR lÇn thø nhÊt ®Ó lµm khu«n. Trªn 30 mÉu ADN t¸ch tõ m¸u ngo¹i vi cña H×nh 4.B (Kh«ng thÊy cã sù chªnh lÖch ng−êi khoÎ m¹nh ph¸t hiÖn cã 96,7% (29/ 30 gi÷a s¶n phÈm PCR cña m¸u ngo¹i vi vµ cña mÉu d−¬ng tÝnh) cã LMP1 - EBV. Trªn 20 mÉu m¸u ngo¹i vi cña bÖnh nh©n UTVMH, chóng 94
TCNCYH 23 (3) 2003 t«i thu ®−îc 100% (20/ 20 mÉu d−¬ng tÝnh) cã XuÊt ph¸t tõ cïng mét hµm l−îng ADN lµm LMP1 - EBV (B¶ng 2; H×nh 2). KÕt qu¶ nµy rÊt khu«n (kho¶ng 100 ng) ®Ó ch¹y ph¶n øng PCR, phï hîp víi kÕt qu¶ cña c¸c t¸c gi¶: Theo Kee - ë m¸u ngo¹i vi chóng t«i ph¶i tiÕn hµnh PCR 2 Ching G., Chen - Yi Hsu vµ cs, tû lÖ nhiÔm lÇn, nh−ng ë tæ chøc sinh thiÕt khèi u chØ tiÕn EBV ë ng−êi d©n sèng ë §µi Loan lµ 100%[8]. hµnh PCR mét lÇn vµ ®iÖn di 4µl s¶n phÈm ë n−íc ta, tû lÖ nh÷ng ng−êi tr−ëng thµnh PCR so víi ®iÖn di 10µl s¶n phÈm PCR ë m¸u nhiÔm EBV lµ 93% [2]. Nghiªm §øc ThuËn ngo¹i vi. KÕt qu¶ lµ: s¶n phÈm PCR ch¹y tõ còng t×m thÊy cã genome EBV ë 100% bÖnh sinh thiÕt khèi u cã b¨ng ADN ®Ëm h¬n rÊt nh©n UTVMH thÓ kh«ng biÖt ho¸ ë ViÖt Nam nhiÒu so víi b¨ng ADN - LMP1 lµ s¶n phÈm [3]. PCR ®· ch¹y ®iÖn di tõ m¸u ngo¹i vi. KÕt qu¶ nµy hoµn toµn ®óng víi lý thuyÕt cho r»ng: B»ng kü thuËt miÔn dÞch, khi tiÕn hµnh hµm l−îng ADN - EBV ë trong m« sinh thiÕt nghiªn cøu huyÕt thanh häc cña bÖnh nh©n cao h¬n rÊt nhiÒu so víi ë m¸u ngo¹i vi. Trong UTVMH, nhãm t¸c gi¶ Phan ThÞ Thu Anh, §ç 25 mÉu sinh thiÕt (gåm 5 mÉu bÖnh nh©n ung Hoµ B×nh, Phan ThÞ Phi Phi vµ céng sù thu th− vïng ®Çu, cæ kh«ng ph¶i lµ UTVMH vµ 20 ®−îc kÕt qu¶ nh− sau: tû lÖ % IgG/ VCA d−¬ng mÉu sinh thiÕt vßm bÖnh nh©n UTVMH) ®Òu tÝnh ë bÖnh nh©n tr−íc x¹ trÞ lµ 92,3%, tû lÖ cã gien LMP1 - EBV. IgA/ VCA d−¬ng tÝnh ë bÖnh nh©n tr−íc x¹ trÞ lµ 85,7%. Sau khi x¹ trÞ mét mòi th× tû lÖ IgG/ Theo kÕt qu¶ nghiªn cøu cña t¸c gi¶ VCA vµ IgA/ VCA d−¬ng tÝnh ®Òu lµ 100% Nghiªm §øc ThuËn [3]: trong tæng sè 47 bÖnh [1]. nh©n UTVMH thÓ kh«ng biÖt ho¸ ph¸t hiÖn thÊy cã 85,11% tr−êng hîp cã ADN - EBV Nh− vËy, ®èi chiÕu gi÷a hai ph−¬ng ph¸p trong mÉu sinh thiÕt khèi u vßm häng (t¸c gi¶ kh¸c nhau, mét lµ tiÕn hµnh nghiªn cøu trªn sö dông cÆp måi EBNA - 2A). TiÕp tôc sö dông gien (LMP1 - kü thuËt sinh häc ph©n tö), hai lµ s¶n phÈm PCR víi cÆp måi EBNA - 2A lµm tiÕn hµnh nghiªn cøu trªn s¶n phÈm cña gien ADN dß cho kü thuËt lai dot - blot th× t¸c gi¶ (kü thuËt miÔn dÞch) th× ®Òu cho mét kÕt qu¶ ph¸t hiÖn thÊy 95,74% tr−êng hîp cã ADN - chung. §ã lµ: hÇu hÕt d©n c− trªn thÕ giíi ®Òu EBV trong mÉu sinh thiÕt khèi u vßm häng. Vµ nhiÔm EBV. ph¶i tiÕn hµnh kü thuËt RT - PCR víi måi Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i tÊt c¶ nh÷ng ng−êi EBNA - 1 t¸c gi¶ míi x¸c ®Þnh ®−îc 100% nhiÔm EBV ®Òu m¾c UTVMH. V× vËy, bªn tr−êng hîp cã ho¹t tÝnh mARN - EBV. H¬n c¹nh EBV cã thÓ cßn rÊt nhiÒu yÕu tè kh¸c nh− n÷a, ®èi víi nhãm chøng bao gåm ung th− ®Çu, yÕu tè c¬ ®Þa, yÕu tè di truyÒn HLA vµ yÕu tè cæ kh«ng ph¶i UTVMH, t¸c gi¶ Nghiªm §øc gien nh¹y c¶m. ThuËn ph¸t hiÖn ®−îc 3/ 11 tr−êng hîp cã 2. Tû lÖ gien LMP1 - EBV ë m« sinh thiÕt ADN - EBV (trong ®ã cã 2/ 11 tr−êng hîp lµ So víi ë m¸u ngo¹i vi, ë sinh thiÕt m« cã ung th− amidan khÈu c¸i, cßn 1/ 11 tr−êng hîp hµm l−îng EBV rÊt cao. V× vËy, ®èi víi nh÷ng lµ ung th− sµng hµm). §iÒu nµy cho phÐp nghÜ mÉu ADN t¸ch tõ mÉu sinh thiÕt, chóng t«i r»ng cÆp måi LMP1 chóng t«i sö dông cã ®é kh«ng tiÕn hµnh ph¶n øng PCR lång mµ chØ nh¹y nh−ng khi so s¸nh c¸c cÆp måi EBNA - tiÕn hµnh mét lÇn víi cÆp måi ®Ó nh©n ®o¹n 2A, EBNA - 1 vµ LMP1 th× cã lÏ EBNA - 1 ®Æc ADN - EBV tõ vÞ trÝ 168373 - 168174. hiÖu víi UTVMH ë n−íc ta h¬n so víi EBNA - KÕt qu¶ cho thÊy ®o¹n gien LMP1 ®· ®−îc 2A vµ LMP1. nh©n lªn mét c¸ch ®Æc hiÖu, thÓ hiÖn mét b¨ng Tuy nhiªn, mét ®iÒu ®Æc biÖt lµ trong 20 s¸ng râ nÐt, cã kÝch th−íc kho¶ng 230bp (H×nh mÉu sinh thiÕt UTVMH, cã 16 mÉu ®¬n ADN 3; B¶ng 3). (80%) t¸ch tõ m« sinh thiÕt khèi u vßm häng 95
TCNCYH 23 (3) 2003 cña bÖnh nh©n UTVMH ®−îc nh©n lªn cã ®é 30bp cña gien LMP1 lµ 86% (víi sè mÉu dµi kho¶ng 200bp vµ cã 2 cÆp mÉu (c¶ cña m¸u nghiªn cøu lµ 187 mÉu). ngo¹i vi vµ sinh thiÕt vßm häng). Nh− vËy, cã tÊt c¶ 18 mÉu sinh thiÕt khèi u vßm häng sau khi ch¹y ®iÖn di s¶n phÈm PCR cã ®o¹n gien LMP1 kho¶ng 200bp. Trªn ®iÖn di, s¶n phÈm PCR cña m¸u ngo¹i vi, cña bÖnh nh©n ung th− ®Çu, cæ kh«ng ph¶i B¶ng 4: So s¸nh tû lÖ chñng EBV cã gien UTVMH, cña bÖnh nh©n UTVMH vµ khi lµm LMP1 ®ét biÕn mÊt kho¶ng 30bp cña bÖnh ®iÖn di song song c¸c mÉu nµy th× thÊy r»ng: nh©n UTVMH ViÖt Nam so víi mét sè n−íc trong lóc c¸c mÉu m¸u ngo¹i vi ng−êi b×nh kh¸c trªn thÕ giíi th−êng, m¸u ngo¹i vi ng−êi UTVMH (18/ 20 mÉu) vµ m« sinh thiÕt bÖnh nh©n ung th− vïng STT LMP1 LMP1 ®ét LMP1 kh«ng biÕn mÊt bÞ ®ét biÕn ®Çu, cæ kh«ng ph¶i UTVMH ®Òu chØ thÊy s¶n kho¶ng 30bp mÊt kho¶ng phÈm qu·ng 230bp th× 16 mÉu ®¬n sinh thiÕt N−íc 30bp vßm cña bÖnh nh©n UTVMH vµ 2 cÆp mÉu thÊy s¶n phÈm qu·ng 200bp (tæng sè lµ 18/ 20 1 Nga 0% (0/ 6 mÉu) 100% (6/ 6 mÉu) (H×nh 4.A; H×nh 4.B). §iÒu nµy khiÕn mÉu) chóng t«i suy nghÜ lµ ®· cã ®ét biÕn mÊt ®o¹n ë 2 Trung 84% (36/ 47 16% (7/ 47 gien LMP1 - EBV, kho¶ng 30bp hay Ýt, nhiÒu Quèc mÉu) mÉu) h¬n. So s¸nh víi kÕt qu¶ mét sè tµi liÖu cña 3 ViÖt 90% (18/ 20 10% (2/20 nh÷ng n−íc cã tÇn suÊt UTVMH rÊt cao, cao Nam mÉu) mÉu) h¬n c¶ n−íc ta, cho thÊy: 4 Hång 92% (34/ 37 8% (3/37 92% gien LMP1 cã mÆt trong m« sinh thiÕt K«ng mÉu) mÉu) khèi u vßm häng cña bÖnh nh©n UTVMH 5 §µi 100% 0% Trung Quèc trong ®ã cã 82% gien LMP1 cña Loan nh÷ng bÖnh nh©n nµy cã ®ét biÕn mÊt 10 amino Nh÷ng kÕt qu¶ nµy cho thÊy chñng EBV cã acid ë vÞ trÝ 346 - 355 acid amin hoÆc ®ét biÕn gien LMP1 ®ét biÕn mÊt 30bp nhiÒu nhÊt lµ ë mÊt 3bp tõ vÞ trÝ 168287 - 168256 nucleotid ë §µi Loan. Mét ®iÒu ®Æc biÖt lµ kh«ng thÊy cã ®Çu -C tËn [10]. 100% gien LMP1 t¸ch tõ sinh ®ét biÕn mÊt 30bp cña gien LMP1 ë bÖnh nh©n thiÕt vßm cña bÖnh nh©n §µi Loan bÞ UTVMH UTVMH gèc Nga, tuy nhiªn vÉn thÊy ®ét biÕn cã ®ét biÕn mÊt 30bp [4]. 93% (34/ 37 ca nµy ë bÖnh nh©n m¾c bÖnh Hodgkin [9]. d−¬ng tÝnh) gien LMP1 t¸ch tõ m« sinh thiÕt Trong 5 mÉu sinh thiÕt chøng (lÊy tõ c¸c khèi u vßm häng cña bÖnh nh©n UTVMH bÖnh nh©n ung th− amidan khÈu c¸i vµ ung th− Hång K«ng bÞ UTVMH cã ®ét biÕn mÊt 10 h¹ häng thanh qu¶n) ®Òu ph¸t hiÖn thÊy ADN - amino acid tõ vÞ trÝ 346 - 355 hoÆc ®ét biÕn mÊt EBV víi hµm l−îng rÊt cao, tuy r»ng gien 30bp tõ vÞ trÝ 168285 - 168256 nucleotid ë ®Çu LMP1 - EBV kh«ng bÞ ®ét biÕn gièng nh− ë -C tËn [5][6]. 76,2% gien LMP1 t¸ch tõ m« bÖnh nh©n UTVMH. Nh− vËy, ph¶i ch¨ng EBV trong c¸c mÉu sinh thiÕt nµy cã liªn quan víi sinh thiÕt khèi u vßm häng cña bÖnh nh©n bÖnh sinh hay chØ lµ tõ tÕ bµo m¸u cã trong Guangxi vµ Shanhai bÞ UTVMH cã ®ét biÕn khèi u? NhËn xÐt nµy còng më ra mét nghiªn mÊt 30bp [10]. Khi nghiªn cøu chung víi sè cøu míi cã thÓ tiÕn hµnh trong t−¬ng lai. mÉu lín ë ng−êi Ch©u ¸, tû lÖ ®ét biÕn mÊt 96
TCNCYH 23 (3) 2003 Nh− vËy, tiÕn hµnh kü thuËt PCR vµ PCR thÓ xem protein LMP1 nh− lµ mét dÊu Ên EBV lång víi cÆp måi ®Ó nh©n ®o¹n gien LMP1 - cã gi¸ trÞ, gãp phÇn tiªn l−îng UTVMH. EBV kh«ng nh÷ng ph¸t hiÖn ®−îc sù cã mÆt KÕt qu¶ cña chóng t«i cho thÊy 100% bÖnh ADN - EBV ë trong c¬ thÓ ng−êi khoÎ m¹nh, ë nh©n UTVMH ®Òu cã gien LMP1 trong ®ã bÖnh nh©n ung th− vïng ®Çu, cæ kh«ng ph¶i 90% cã ®ét biÕn mÊt ®o¹n; nh−ng t¸c gi¶ §ç UTVMH vµ bÖnh nh©n UTVMH mµ cßn ph¸t Hoµ B×nh khi nghiªn cøu 80 tr−êng hîp th× s¶n hiÖn ®−îc ®ét biÕn mÊt ®o¹n cña gien LMP1 - phÈm chØ biÓu lé protein LMP1 ë 66% tr−êng EBV x¶y ra phæ biÕn ë bÖnh nh©n UTVMH. hîp. Nh− vËy râ rµng r»ng tõ gien ®Õn s¶n 3. §¸nh gi¸ mèi liªn quan gi÷a ®ét biÕn phÈm gien cßn cã nhiÒu c¬ chÕ kh¸c chi phèi. mÊt ®o¹n cña gien LMP1 trong ®Þnh h−íng Kh«ng nh÷ng thÕ, theo t¸c gi¶ §ç Hoµ chÈn ®o¸n sím vµ tiªn l−îng UTVMH B×nh, 75% bÖnh nh©n biÓu lé protein LMP1 cã KiÓu h×nh nhiÔm EBV ë thÓ tiÒm Èn ®−îc tiªn l−îng tèt, 25% lµ tiªn l−îng xÊu. Cßn theo chia lµm 3 nhãm (týp I, II vµ III) tuú theo sù kÕt qu¶ cña chóng t«i chØ cã 10% gien LMP1 biÓu lé cña 10 gien tiÒm Èn. ThÓ tiÒm Èn cña kh«ng ®ét biÕn, cßn 90% gien LMP1 lµ ®ét týp I chØ cã EBER vµ EBNA1 ®−îc biÓu lé nh− biÕn. Nh− vËy, dï lµ gien LMP1 cã ®ét biÕn ë u lympho Burkitt. ë týp III, toµn bé gien tiÒm nhá hay kh«ng ®ét biÕn th× cã lÏ nã vÉn cã tÝnh Èn ®−îc biÓu lé nh− ë trong tÕ bµo biÕn chuyÓn sinh miÔn dÞch vµ ®−îc nhËn biÕt bëi tÕ bµo T diÖt ®Æc hiÖu khèi u (cytotoxic T - lymphocyte (LCL). ë týp II, LMP1, LMP2A vµ LMP2B - CTL). céng thªm EBER vµ EBNA1 cña týp I ®−îc biÓu lé nh− trong UTVMH vµ bÖnh Hodgkin. V. KÕt luËn Ng−êi ta biÕt râ lµ thÓ kh«ng biÖt ho¸ (UCNT) B»ng kü thuËt PCR vµ PCR lång, sö dông vµ Ýt biÖt ho¸ cña UTVMH th−êng cã liªn quan hai cÆp måi ®Æc hiÖu cho gien LMP1, chóng t«i víi vai trß cña LMP1. kh«ng nh÷ng ph¸t hiÖn ®−îc sù cã mÆt cña Theo nghiªn cøu cña §ç Hoµ B×nh vµ céng gien LMP1 ë m¸u ngo¹i vi ng−êi khoÎ m¹nh; sù (sè liÖu ®· göi trªn t¹p chÝ Nghiªn cøu y m¸u ngo¹i vi vµ tæ chøc sinh thiÕt bÖnh nh©n häc, 2002): b»ng ph−¬ng ph¸p ho¸ miÔn dÞch UTVMH; tæ chøc sinh thiÕt bÖnh nh©n ung th− m« vµ miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp, t¸c gi¶ vïng ®Çu, cæ kh«ng ph¶i UTVMH mµ cßn ph¸t thÊy r»ng protein LMP1 ®−îc biÓu lé ë 53/ 80 hiÖn ®−îc ®ét biÕn mÊt ®o¹n gien LMP1 – EBV tr−êng hîp (66%), trong khi ®ã cã 27/ 80 ë bÖnh nh©n UTVMH, do ®ã lo¹i tÕ bµo u khái (37%) tr−êng hîp kh«ng biÓu lé LMP1. H¬n c¬ thÓ. n÷a, trong 44 tr−êng hîp biÓu lé LMP1 cã tíi Tµi liÖu tham kh¶o 33 tr−êng hîp (75%) ®· ®¸p øng rÊt tèt sau x¹ 1. Phan Thu Anh, §ç Hoµ B×nh, Phan ThÞ trÞ (u tan, hÕt h¹ch), mÆc dï tr−íc ®ã h¹ch lan Phi Phi vµ cs.: HuyÕt thanh häc chèng VCA, réng. Tû lÖ t¸i ph¸t sím vµ di c¨n cña nhãm EA ë bÖnh nh©n ung th− vßm mòi häng, Y häc nµy lµ 14/ 44 (25%). Ng−îc l¹i, trong sè 21 ViÖt Nam. 1991, 158: 129 - 132. tr−êng hîp kh«ng biÓu lé LMP1, chØ cã 7 2. Phan Thu Anh, Phan ThÞ Phi Phi, §ç tr−êng hîp cã dÊu hiÖu tiªn l−îng tèt nh− nhãm Hoµ B×nh vµ cs.: Gãp phÇn nghiªn cøu ung th− cã LMP1 d−¬ng tÝnh, cßn l¹i 14/ 21 tr−êng hîp vßm mòi häng ë ViÖt Nam. T×nh h×nh nhiÔm (67%) cã tiªn l−îng xÊu, víi ®¸p øng sau x¹ trÞ EBV ë mét sè løa tuæi ng−êi d©n ViÖt Nam, Y kÐm (u thu nhá mét phÇn, h¹ch cßn tån t¹i), cã biÓu hiÖn t¸i ph¸t sím sau < 6 th¸ng vµ di c¨n häc thùc hµnh. 1987, 5- 6: 41 - 42. nhiÒu n¬i, mÆc dï tr−íc ®ã u vµ h¹ch kh«ng lan 3. Nghiªm §øc ThuËn : Nghiªn cøu ®Æc réng nh− nhãm LMP1 d−¬ng tÝnh. Nh− vËy, ®iÓm l©m sµng, m« bÖnh häc ung th− vßm mòi nh÷ng tr−êng hîp cã LMP1 d−¬ng tÝnh th× häng vµ ho¹t tÝnh cña gen virót Epstein - Barr cïng víi u, h¹ch cã xu h−íng lan réng h¬n trong UTVMH, LuËn v¨n TiÕn sü Y häc. 2001. nh÷ng tr−êng hîp ©m tÝnh víi LMP1, nh−ng 4. Chang Y. S., Su I. J., Chung P. J., Shu tiªn l−îng vÉn tèt h¬n. NhËn xÐt nµy gîi ý cã C. H., Ng C. K., Wu S. J., Liu S. T.: Deletion 97
TCNCYH 23 (3) 2003 of an Epstein - Barr virus variant in T - cell 8. Kee-Ching G.Jeng, Chen-Yi Hsu, lymphoma tissues identical to the distinct strain Ming-Tsung Liu, Tsung-Te Chung, Shih-Tung observed in nasopharyngeal carcinoma in the Liu: Prevalence of Taiwan variant of Epstein- Taiwanese population, Int. J. Cancer. 1995, 62: Barr virus in throat washings from patients with 673 - 677. head and neck tumors in Taiwan, Journal of 5. Cheung S. T., Lo K. W., Leung S. F., Clinical microbiology, Vol.32, No.1: 28-31. Chan W. Y., Choi P. H., Johnson P. J., Lee J. 9. Peter Hahn, Elena Novikova, Liana C., Huang D. P.:Prevalance of LMP1 deletion Scherback, Constatin Janik, Oleg Pavlish, variant of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal Viktor Arkhipov, John Nicholis, Nikolaus carcinoma and gastric tumor in Hong Kong, Muller - Lantzsch, Vladimir Gurtsevitch and Int. J. Cancer. 1996, 66: 711 - 712. Friendrich A. Grasser ; The LMP1 gene 6. Cheung Siu - Tim, Leung Sing - Fai, isolated from Russian nasopharyngeal Lo Kwok - Wai, Chui K. W., Tam J. S. L., Fok carcinoma has no 30bp deletion, Int. J. Cancer. T. F., Johnson Philip J.: Specific latent 2001, 91: 815 - 821. membrane protein 1 gene sequences in type 1 10. Xiao - Shi Zhang, Kun - Hua Song, Hai and type 2 Epstein-Barr virus from - Quiang Mai, Wei - Hua Jia et al: The 30 - bp nasopharyngeal, Int. J. Cancer.1998, 76: 399 - deletion variant: a polymorphism of latent 406. membrane protein 1 prevalent in endemic and 7. Hu Lifu : Nasopharyngeal carcinoma non - endemic areas of nasopharyngeal and Epstein - Barr virus, LuËn ¸n TiÕn sü. carcinoma in China, Cancer Letters. 2002, 176: 1996. 65 - 73. Summary The prevelance and deleted mutations of LMP1 - EVB gene in UCNT - NPC patients The aim of this study is to investigate the prevalence of LMP1 gene. We have studied on 20 couple samples of nasopharyngeal carcinoma patients (included blood and biopsy); 5 patients with other head and neck tumor and 30 blood samples of healthy persons. The primers located from position 168592 to 168174 and from 168373 to 168174 of the strain HEHS B95 – 8 were used. Our finding indicated that: 1. The prevalence of LMP1 - EBV gene in peripheral blood of healthy persons are 96.7% (29/ 30 positive cases). 2. Prevalent LMP1 - EBV gene in 20 UCNT nasopharyngeal carcinoma patients are 100% (20/ 20 positive cases). 3. Prevalence LMP1 - EBV gene in patients with other head and neck tumor are 100% (5/ 5 positive cases). 4. On the electrophoresis showed that 90% biopsies of nasopharyngeal carcinoma patients having deletion in LMP1 gene. 98