Tạp chí khoa học: Chọn tạo các dòng ngô được chuyển gen kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 17-29<br /> <br /> Ch n t o các dòng ngô ư c chuy n gen kháng sâu (CryIAc) thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens<br /> Trương Thu H ng*<br /> Trư ng Cao ng Sư ph m Thái Nguyên ư ng Quang Trung, Phư ng Th nh án, TP Thái Nguyên<br /> Nh n ngày 09 tháng 10 năm 2012 Ch nh s a ngày 24 tháng 10 năm 2013; ch p nh n ăng ngày 10 tháng 10 năm 2013<br /> <br /> Tóm t t. Ngô (Zea Mays L.,) là m t trong 3 cây ngũ c c quan tr ng (lúa mì, lúa nư c, ngô) c a th gi i. Phương pháp bi n n p gen thông qua vi khu n t Agrobacterium tumefaciens v i ưu i m là ít t n kém, d áp d ng trên các i tư ng cây tr ng nên phương pháp này r t phù h p v i i u ki n c a các nư c ang phát tri n như Vi t Nam. 1. ã chuy n thành công gen kháng sâu CryIAc thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens vào dòng ngô HR9 nh p n i. 2. ã bư c u ánh giá s bi u hi n c a gen bi n n p b ng phương pháp PCR và phương pháp ánh giá cây chuy n gen ư c tr ng trong nhà lư i cách li côn trùng. Các k t qu nghiên c u có giá tr khoa h c và có ý nghĩa th c ti n trong phát tri n các gi ng cây ngô chuy n gen Vi t Nam trong tương lai.<br /> <br /> 1. M<br /> <br /> u∗<br /> <br /> Ngô (Zea Mays L.,) là m t trong 3 cây ngũ c c quan tr ng (lúa mì, lúa nư c, ngô) c a th gi i. Tính n năm 2008 di n tích tr ng ngô th gi i vào kho ng 157, 51 tri u ha, năng su t 4,96 t n/ha, s n lư ng kho ng 782,96 tri u t n [1]. nư c ta, ngô là cây lương th c quan tr ng th 2 sau cây lúa và là cây màu quan tr ng nh t. Năm 2008, di n tích tr ng ngô t 1,1 tri u ha, năng su t kho ng 4 t n/ ha, s n lư ng là 4,53 tri u t n [2].<br /> <br /> ánh giá s phát tri n ngô th gi i có 4 nguyên nhân thúc y tăng năng su t và s n lư ng ã ư c ch ra là: i) thay i cơ b n v gi ng (th ph n t do, lai kép, lai ơn); ii) tăng kh năng ch ng ch u; iii) áp d ng các ti n b k thu t và iv) tăng năng su t dòng b m [1] M t trong 4 nguyên nhân thúc y s phát tri n ngô th gi i ó là tăng cư ng kh năng ch ng ch u c a gi ng. Kh năng ch ng ch u c a gi ng bao g m ch ng l i các tác nhân sinh h c (Biotic stresses) và phi sinh h c (Abiotic stresses). Các tác nhân phi sinh h c bao g m h n, l nh, nóng, mu i cao, axit….Theo th ng kê c a Dean & Adang [3], Oerke & CS [4] nh ng t n th t mùa màng nghiêm tr ng trên 17<br /> <br /> _______<br /> ∗<br /> <br /> T: 84-1276390580. E-mail: hanganh10@gmail.com<br /> <br /> 18<br /> <br /> T.T. Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 17-29<br /> <br /> toàn c u là do sâu b nh gây ra ư c tính chi m t 35 n 42% t ng s n lư ng lương th c hàng năm, trong ó thi t h i do côn trùng chi m t 13 – 16%. M c thi t h i có khi lên t i 70% n u như cây tr ng không ư c áp d ng các bi n pháp b o v . V i cây ngô, sâu c thân ngô (mi n Nam g i là b p) chúng có tên khoa h c là Ostrinia nubilalis thu c h Ngài sáng (Pyralidae), B cánh v y (Lepidoptera) và sâu xám (Agrotis ypsilon) thu c h ngài êm (Noctuidae), B cánh v y (Lepidoptera) là hai lo i sâu h i r t ph bi n trên ngô, thư ng gây h i r t n ng i v i cây b p nhi u vùng tr ng b p c a nư c ta. nư c ta, sâu c thân ngô thư ng gây h i n ng nhi u vùng và trong m i mùa v . khu v c ng b ng sông C u Long, sâu phá h i ngô thư ng t p trung vào các tháng mùa mưa do m cao. Ru ng ngô b sâu c thân n ng làm s cây b h i có khi lên n 8090%, d n n năng su t b gi m sút. Sâu xám là lo i sâu h i nguy hi m i v i ngô và hoa màu gieo tr ng trong v ông xuân mi n B c nư c ta. Hàng năm, sâu phát sinh trên di n tích r ng l n và gây thi t h i r t l n. Hi n nay, r t nhi u lo i thu c tr sâu hóa h c ang ư c s d ng phòng tr sâu b nh v i chi phí t n kém, gây ô nhi m môi trư ng và gây c h i cho s c kh e con ngư i, v t nuôi. c i thi n tình hình này, chúng ta c n s d ng nh ng k thu t tiên ti n trong b o v cây tr ng nh m xây d ng m t n n nông nghi p s ch, b n v ng. Vi c t o ra các gi ng cây tr ng bi n i di truy n (Genetically Modified Crops, GMOs) có kh năng kháng sâu b nh và côn trùng nh k thu t t o dòng phân t , k thu t chuy n gen th c v t ang ư c quan tâm nghiên c u và ng d ng vào th c ti n nh m nâng cao năng su t cây tr ng và em l i l i ích t i a cho n n nông nghi p. n nay hàng lo t<br /> <br /> gen mã hóa protein có h at tính di t côn trùng gây h i (gen kháng côn trùng) như gen cry c a vi khu n Bacillus thuringiensis, gen mã hóa các ch t c ch proteaza và α - amylaza… ư c chuy n vào th c v t nh các phương pháp thích h p v i s n ph m là nh ng cây tr ng có kh năng t kháng sâu b nh. Trên th gi i, khá nhi u phương pháp chuy n gen th c v t ã ư c nghiên c u và áp d ng thành công, như phương pháp vi tiêm, s d ng súng b n gen, xung i n. Trong ó, phương pháp có giá tr th c ti n cao và ư c s d ng r ng rãi nh t là phương pháp bi n n p gen thông qua vi khu n t Agrobacterium tumefaciens. V i ưu i m là ít t n kém, d áp d ng trên các i tư ng cây tr ng nên phương pháp này r t phù h p v i i u ki n c a các nư c ang phát tri n như Vi t Nam [5].<br /> <br /> 2. V t li u 2.1. V t li u th c v t V t li u s d ng trong các thí nghi m là hai dòng ngô nh p n i: HR8, HR9. Các cây ngô m cho b p thí nghi m ư c tr ng trong nhà lư i. 2.2. Ch ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens và vector bi n n p Chúng tôi s d ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens ch ng LBA4404 mang ADN plasmid vector là Padt1 ch a gen kháng sâu CryIAc ư c i u khi n b i o n kh i ng Ubiquitin và gen chon l c th c v t là hyg (H) và Padt2 ch a gen kháng sâu CryIAc ư c i u khi n b i o n kh i ng Ubiquitin và gen ch n l c th c v t là pmi (M) b ng 1.<br /> <br /> T.T. Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 17-29<br /> <br /> 19<br /> <br /> B ng 1 Thông tin liên quan Plasmid vector Vector g c K t c u gen quan tâm Ch th ch n l c trong Agrobacterium tumefaciens Ch th ch n l c trong th c v t H th ng bi n n p<br /> <br /> n h th ng bi n n p H và M Padt2 Pnov2819 Ubiquitin + CryIAc + NOS Spectomicin (50µg/ml) Mannose (10-15g/l) Agrobacterium tumefaciens LBA4404: Padt2 (M)<br /> <br /> Padt1 Pcambia 1300 Ubiquitin + CryIAc + NOS Kanamicin (50µg/ml) Hygromicin (15-50µg/ml) Agrobacterium tumefaciens LBA4404: Padt1 (H)<br /> <br /> 3. Phương pháp nghiên c u 3.1. Bi n n p gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 3.1.1.T o d ch huy n phù Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ch ng LB4404 ch a plasmid quan tâm ư c c t gi trong glycerol -200C. C y tr i vi khu n trên lên ĩa môi trư ng LB c có b sung kháng sinh tương ng, nuôi 210C trong 2-3 ngày. C y khu n l c vi khu n nuôi trong môi trư ng LB c trên sang môi trư ng LB l ng có b sung kháng sinh thích h p và l c 150 vòng/phút, 250C, ti n hành nuôi qua êm. Sau 8-12 gi l y d ch huy n phù vi khu n nuôi c y trên ly tâm v i t c 5000 vòng/phút, 0 4 C trong 5 phút. Lo i b d ch n i và hoà tan c n vi khu n b ng d ch nuôi ho c b ng LB l ng m i. Pha loãng d ch khu n cho t i khi t ư c OD600 ≈ 0.5-1.0. Thu ư c d ch huy n phù vi khu n này ư c s d ng lây nhi m ngay v i phôi ngô non. 3.1.2. Lây nhi m vi khu n v i phôi<br /> Hình 2. C u trúc vector Pcambia 1300.<br /> <br /> Hình 1 C u trúc vector pNOV2819.<br /> <br /> B p non ư c thu t các cây ngô m tr ng trong nhà lư i. Ngay sau khi thu, phôi non ư c tách trong i u ki n vô trùng. Phôi non sau ó<br /> <br /> 20<br /> <br /> T.T. Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 17-29<br /> <br /> ư c ưa vào môi trư ng IM có b sung AS và d ch huy n phù vi khu n trong 30-60 phút, l c nh nhi t 210C, trong i u ki n t i. ng nuôi c y Phôi sau khi lây nhi m v i vi khu n ư c chuy n sang môi trư ng nuôi c ng sinh CCM, nuôi trong t i, nhi t 210C trong 4 ngày. - Nuôi ph c h i Chuy n phôi ã bi n n p t môi trư ng CCM sang môi trư ng ReM, nuôi trong t i 25oC trong 7 ngày. - Ch n l c mô s o chuy n gen Mô s o t o thành t phôi non ã bi n n p trên môi trư ng ReM ư c c y chuy n sang môi trư ng ReM m i có b sung kháng sinh ch n l c th c v t tương ng, nuôi trong t i 25oC, th i gian 20 ngày.<br /> <br /> - T o ch i Mô s o phôi hoá t o thành trên môi trư ng ch n l c ReM ư c c y chuy n sang môi trư ng ReM m i có b sung kháng sinh ch n l c th c v t thích h p tái sinh ch i, nuôi o sáng 25 C, th i gian 20 ngày. - Tái sinh cây bi n n p gen hoàn ch nh Ch i tái sinh trong môi trư ng ch n l c SeM ư c c y chuy n sang môi trư ng t o cây hoàn ch nh RM có b sung kháng sinh ch n l c th c v t, nuôi sáng 25oC, th i gian 10-20 ngày.<br /> A. Chuy n cây ra<br /> <br /> t:<br /> <br /> Cây tái sinh trên môi trư ng ch n l c RM có 2-3 lá, 3-4 r ư c chuy n ra t tr ng. Môi trư ng s d ng trong các bư c chuy n gen ư c th hi n b ng 2<br /> <br /> B ng 2. Môi trư ng s d ng trong bi n n p gen nh Agrobacterium tumefaciens Thành ph n N6 MS Sucrose g/l Glucose g/l L-proline (g/l) MES (g/l) Hygromycin (mg/l) 2,4-D (mg/l) Ph Phytagel (g/l) AgNO3 (1mg/ml) AS (Mm) Cefotaxime (mg/ml) Myo-inositol (g/l) IMAS + 30 60 5.2 100 CCM + 30 0.7 2.5 5.8 5 0.5 100 ReM + 30 0.7 0.5-1,5 15-50 2.5 5.8 5 0.5 150 SeM + 30 0.7 0.5-1,5 15-50 5.8 5 0.5 150 RM + 60 15 -50 5.8 5 150 1<br /> <br /> B ng 3. Môi trư ng s d ng ch th manose trong bi n n p gen nh Agrobacterium tumefaciens Thành ph n N6 MS Sucrose g/l Glucose g/l IMAS + 30 60 CCM + 30 ReM + 30 SeM + 30 RM + 60 -<br /> <br /> T.T. Hằng /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 17-29<br /> <br /> 21<br /> <br /> L-proline (g/l) MES (g/l) Hygromycin (mg/l) 2,4-D (mg/l) Ph Phytagel (g/l) AgNO3 (1mg/ml) AS (Mm) Cefotaxime (mg/ml) Myo-inositol (g/l)<br /> <br /> 5.2 100 -<br /> <br /> 0.7 2.5 5.8 5 0.5 100 -<br /> <br /> 0.7 0.5-1,5 2.5 5.8 5 0.5 150 -<br /> <br /> 0.7 0.5-1,5 5.8 5 0.5 150 -<br /> <br /> 5.8 5 150 1<br /> <br /> 3.2. Phân tích cây ư c bi n n p gen 3.2.1. Phương pháp tách chi t AND t ng s t mô lá ngô Các cây tái sinh ư c ưa ra t. Khi cây có lá th 4 thì ti n hành thu m u lá tách chi t ADN. ADN ư c tách chi t và tinh s ch b ng phương pháp CTAB c a Saghai Maroof (1984) [6] có c i ti n cho phù h p v i i u ki n phòng thí nghi m. Hóa ch t ư c s d ng như sau:<br /> A.<br /> <br /> - NaCl 5 M - Dung d ch (24:1) g m Chloroform/ Isoamylalcohol pha theo t l 24/1. - Ispropropanol. - Dung d ch r a là c n 75%. Tách chi t ADN t lá ngô: Bư c 1: Nghi n 0,3- 0,5 gam lá ngô trong nitơ l ng thành b t m n. Bư c 2: Chuy n b t lá vào ng ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml m CTAB ã 650 C trong 10 phút. Bư c 3: các ng ly tâm 650 C trong 90 phút, l c nh nhàng nhưng d t khoát 20 phút m t l n vi c tách có hi u qu . Bư c 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút l n d ch n i sang ng m i r i b sung 0.7ml dung d ch 24:1, l c nh nhàng trong 10 phút r i ti n hành ly tâm trong 10 phút t c 10.000 vòng/phút nhi t phòng. Bư c 5: Hút l p d ch n i sang ng m i r i b sung 10µl ARNase (n ng 1µg/µl), trong 1 n 2 ti ng nhi t 370C, Bư c 6. B sung 0.6ml dung d ch 24:1, l c nh trong 10 phút. R i ti n hành ly tâm trong t c 10.000 vòng/phút trong 10 phút.<br /> <br /> tách chi t ADN<br /> <br /> m CTAB 100 ml g m: ammonium<br /> <br /> + CTAB (Cetyltrimethyl bromide): 2,25 gam + β-Mercapto ethanol : 250 µl<br /> <br /> + EDTA (Ethylenediamine tetraacetate): 4,5 ml + NaCl 5 M : 30 ml + Tris HCl 8,0: 15 ml + H2O: 55 ml<br /> A.<br /> <br /> m TE EDTA Ph 8,0 g m:<br /> <br /> + Tris HCl 8,0: 10 Mm + EDTA 8,0:1 Mm - Enzym Rnase: 10 µg/ml - C n tuy t i l nh<br /> <br />