Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Chia sẻ: Huỳnh Hữu Trí | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:42

Thêm vào BST

Báo xấu

299
lượt xem 86
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với các tế bào thực vật.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật
150 http://www.ebook.edu.vn Bài 1 Mở đầu I. Các thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật (ghi chú: + rất cần, - tùy theo nhu cầu) 1. Phòng rửa và cất nước + Máy cất nước 1 lần (8 L/giờ) + Máy cất nước 2 lần (4 L/giờ) - Máy sản xuất nước khử ion 2. Phòng sấy hấp + Tủ sấy 60-300oC + Nồi khử trùng (autoclave) loại nhỏ (25 L) - Nồi khử trùng loại lớn (50-100 L) 3. Phòng chuẩn bị môi trường + pHmeter + Máy khuấy từ + Cân phân tích 10-4g + Cân kỹ thuật 10-2g + Bếp điện - Microwave + Tủ lạnh 100-200 L - Tủ lạnh sâu (-20 ÷ -80oC) 4. Phòng cấy vô trùng + Tủ cấy vô trùng (Laminar, Clean Bench) + Quạt thông gió + Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường (1,2 m) - Thiết bị lọc không khí
151 http://www.ebook.edu.vn 5. Phòng ảnh - Máy ảnh kỹ thuật số - Hệ thống đèn chiếu 6. Phòng kính hiển vi + Kính hiển vi 2 mắt (độ phóng đại 1000 lần). + Kính hiển vi đảo ngược (độ phóng đại 1000 lần) có gắn máy chụp ảnh kỹ thuật số. + Kính lúp 2 mắt (độ phóng đại 75 lần). - Microtome và các dụng cụ quan sát tế bào học. - Kính hiển vi huỳnh quang 7. Phòng nuôi + Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux. + Máy điều hòa nhiệt độ - Máy lắc nằm ngang (100-200 vòng/phút) + Tủ ấm - Nồi phản ứng sinh học (bioreactor) 8. Phòng sinh hóa + Máy sắc ký (HPLC, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng...) + Thiết bị điện di gel (agarose và polyacrylamide) + Máy chụp ảnh, phân tích và lưu trữ hình ảnh của DNA, RNA và protein (Gene documentation system) + Máy quang phổ có dải đo từ 190-1100 nm - Một số thiết bị khác để phân tích thành phần sinh hóa của các tế bào và mô nuôi cấy. II. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật Có 3 nhân tố chính: - Bảo đảm điều kiện vô trùng. - Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách.
152 http://www.ebook.edu.vn - Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy. 1. Bảo đảm điều kiện vô trùng 1.1. Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần. Thông thường, một chu kỳ nuôi cấy mô và tế bào thực dài từ 1-5 tháng (tùy đối tượng và mục đích nuôi cấy), trong khi thí nghiệm vi sinh vật có thể kết thúc trong một vài ngày. Nói cách khác, mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc, điều kiện này đặc biệt quan trọng khi nuôi cấy các tế bào đơn thực vật trong các nồi phản ứng sinh học (bioreactor), điều kiện vô trùng phải rất cao mới có hy vọng thành công được. 1.2. Nguồn nhiễm tạp Có 3 nguồn nhiễm tạp chính: - Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối. - Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc vi khuẩn. - Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn theo bụi lên bề mặt môi trường. 1.3. Vô trùng dụng cụ thủy tinh, nút đậy và môi trường a. Dụng cụ thủy tinh Dụng cụ thủy tinh dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải là loại thủy tinh trong suốt để ánh sáng qua được ở mức tối đa và trung tính để tránh kiềm từ thủy tinh gây ảnh hưởng đến sự phát triển của mô nuôi cấy.
153 http://www.ebook.edu.vn Cần rửa sạch dụng cụ thủy tinh trước khi đưa vào sử dụng. Thông thường, chỉ cần xử lý dụng cụ thủy tinh bằng sulfochromate một lần đầu khi đưa vào sử dụng, về sau chỉ cần rửa sạch bằng xà phòng, tráng sạch bằng nước máy nhiều lần và cuối cùng tráng bằng nước cất. Sau khi để ráo nước, dụng cụ thủy tinh (trừ các loại dùng để do thể tích) cần được vô trùng khô bằng cách sấy ở 60-70oC/2 giờ. Sau khi nguội được lấy ra cất vào chỗ ít bụi. b. Nút đậy Thường dùng nhất là các nút đậy làm bằng bông không thấm nước. Nút phải tương đối chặt để đảm bảo bụi không đi qua được, đồng thời nước từ môi trường không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất, nhưng có các nhược điểm sau: + Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ bị nhiễm nấm, nhất là ở các thí nghiệm nuôi cấy trong thời gian dài. + Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện khi nuôi cấy trên quy mô lớn. + Chỉ dùng được một vài lần, sau phải bỏ. Hiện nay, người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy khác thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp loại nắp ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC (khoảng 1 atm) mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp ống nghiệm inox hoặc cao su rất thuận tiện cho việc vô trùng khô hoặc ướt. Cũng có thể sử dụng giấy nhôm để làm nắp đậy. Trong giáo trình này, chúng tôi sử dụng giấy nhôm làm nút đậy. c. Môi trường Nói chung, môi trường được pha chế và dự trữ trong điều kiện không vô trùng và đem hấp vô trùng khi đã phân phối vào các dụng cụ thủy tinh đã đậy nút hoặc nắp. Thời gian hấp từ 15-20 phút ở áp suất khoảng 1 atm (121oC). Sau khi vô trùng cần phải làm khô nắp ống nghiệm hoặc nút bông. Các dung dịch mẹ (stock solutions) dùng để pha chế môi trường (dung dịch muối khoáng, vitamine, chất kích thích sinh trưởng...) cần được bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch mẹ của hỗn hợp vitamin nên chia thành nhiều lọ nhỏ và bảo quản trong ngăn đá của tủ lạnh. Không nên pha
154 http://www.ebook.edu.vn một lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất sinh trưởng, thường chỉ nên dùng các lọ có dung tích từ 100 đến 200 mL. Ở áp suất khoảng 1 atm hầu hết các vi sinh vật có trong môi trường đều bị diệt, kể cả các vi sinh vật ở dạng bào tử. Thời gian hấp thường từ 15 đến 20 phút ở 1 atm. Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật phải dùng nước cất hoặc nước khử ion, tốt nhất là dùng nước cất 2 lần từ các máy cất hoàn toàn bằng thủy tinh. Đôi khi ta cần cho vào môi trường nuôi cấy các chế phẩm mẫn cảm với nhiệt, có thể bị phân hủy khi ta hấp ở 121oC. Trường hợp này cần tiến hành lọc vô trùng riêng các chế phẩm đó và sau đó đưa vào môi trường được khử trùng. d. Lọc vô trùng Phương pháp đơn giản nhất là dùng các màng lọc Millipore (Hình 1.1) do hãng Millipore sản xuất hoặc dùng các phểu lọc thủy tinh xốp số 5. Hình 1.1. Một số loại màng lọc vô trùng của hãng Millipore (disposable). Đây là loại màng lọc đã được khử trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng một lần.
155 http://www.ebook.edu.vn Phương pháp sử dụng màng lọc Millipore: Hãng Millipore cung cấp màng lọc và giá đỡ bằng nhựa chịu nhiệt. Dưới đây mô tả màng lọc loại Millipore Swinex có đường kính 25 mm. Bộ lọc gồm có giá đỡ bằng loại nhựa chịu nhiệt gồm nắp và đế, vòng cao su và màng lọc. Đặt màng lọc (có kích thước lỗ 0,25 μm) trên đế, đặt vòng cao su lên và vặn chặt nắp vào đế. Gói toàn bộ bộ lọc vào trong một tờ giấy nhôm và khử trùng trong nồi áp suất ở 121oC trong 15-20 phút. Đồng thời vô trùng một bình thủy tinh để hứng dịch lọc. Dùng ống tiêm hút dịch lọc và bơm qua bộ lọc. 1.4. Vô trùng mô nuôi cấy Mô nuôi cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như: hạt giống, phôi, noãn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ... Tùy theo sự tiếp xúc với điều kiện môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Hầu như không thể vô trùng mô nuôi cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong chứ không hạn chế ở bề mặt. Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẻ ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô nuôi cấy trong vòng 30 giây trong cồn 70% sau đó mới xử lý trong dung dịch diệt khuẩn. Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để và có ảnh hưởng xấu ngay lên sự sinh trưởng của mô cấy. Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận thực vật có nhiều bụi đất, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng dưới dòng nước chảy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3-5 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử, chắc chắn sẽ đạt kết quả.
156 http://www.ebook.edu.vn Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt khuẩn để xử lý mô cấy thực vật Thời gian xử lý Stt Tác nhân vô trùng Nồng độ Hiệu quả (phút) 1 Calcium hypochlorite 9-10% 5-30 Rất tốt 2 Sodium hypochlorite 2% 5-30 Rất tốt 3 Nước Bromine 1-2% 2-10 Rất tốt 4 H2O2 10-12% 5-15 Tố t 5 HgCl2 0,1-1% 2-10 Khá 6 Kháng sinh 4-50 mg/L 30-60 Khá 1.5. Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng Nguồn nhiễm tạp quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thủy tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để thao tác cấy. Người ta áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn nhiễm tạp này. Buồng cấy thường là buồng có diện tích hẹp, rộng từ 10-15 m2, có hai lớp cửa để tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào. Sàn và tường lát gạch men để có thể lau chùi thường xuyên. Trước khi đưa vào sử dụng, buồng cấy cần được xử lý hơi formol bằng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra một số nắp đĩa petri để rải rác vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formaldehyde đi và khử hơi formaldehyde thừa bằng dung dịch NH3 25% cũng trong 24 giờ. Mặt bàn cấy, trước khi làm việc phải lau mặt bàn bằng cồn 90%. Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều vô trùng trước: từ áo choàng, mũ vải, khẩu trang của người cấy, đến dao, kéo, forceps, giấy lọc, bình đựng nước cất... Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn (hoặc đèn gas) để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 90% để nhúng các dụng cụ làm việc. Trước khi cấy, kỹ thuật viên cần rửa tay bằng xà phòng và lau kỹ đến khuỷu tay bằng cồn 90%. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao trong phòng cấy cần có một đèn tử ngoại 40W treo trên trần. Chỉ cho đèn này làm việc khi không có người trong phòng cấy. Nên bật đèn tử ngoại 30 phút trước khi cấy. Cần giảm sự chuyển động của không khí trong buồng
157 http://www.ebook.edu.vn cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả các dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để trong khi cấy tránh đi lại, ra vào buồng cấy nhiều lần. Hình 1.2. Tủ cấy vô trùng 2. Chọn môi trường dinh dưỡng Xem bài 2 3. Chọn mô cấy và xử lý mô cấy Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy. Về nguyên tắc, trừ những mô cấy đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy. Tuy vậy, có thể nhận xét chung là các mô đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh... khi đặt vào môi trường có chứa một lượng chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa (Bảng 1.2). Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, trước tiên người ta chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. Cần biết rằng tuy mang một lượng thông tin di truyền như nhau, các mô khác nhau trên cùng một cây có thể sinh trưởng và phát triển với khả năng tái sinh chồi, rễ hay cây hoàn chỉnh rất khác nhau. Vì vậy, khi khởi sự chọn giống, nhân giống một cây cụ thể bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng các bộ phận khác nhau của cây trong nuôi cấy ở các nồng độ chất sinh trưởng khác nhau. Sau khi cấy, mô cấy cần được đặt trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn định. Tùy vào các mục đích nghiên cứu mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau, chẳng hạn quá trình tạo callus có thể cần bóng tối hoặc
158 http://www.ebook.edu.vn chiếu sáng nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết cần ánh sáng. Nhiệt độ phòng nuôi nên giữ ổn định từ 25 ± 2oC bằng máy điều hòa nhiệt độ. Cường độ chiếu sáng khoảng từ 2000-3000 lux. 4. Một số điểm cần lưu ý - Các dụng cụ dùng cho thí nghiệm nuôi cấy mô sau khi tiệt trùng ở nồi khử trùng đều phải được tiệt trùng sau mỗi lần dùng đến bằng cách nhúng vào cồn 90% rồi hơ lên ngọn lửa đèn cồn. - Trước khi cấy phải vệ sinh toàn bộ khu vực cấy bằng cồn 90%. - Nên để số mẫu cấy trong đĩa petri từ 4-5 mẫu, tránh trường hợp để nhiều không cấy kịp mẫu sẽ bị khô. - Cồn dùng để đốt dụng cụ phải được thay sau mỗi đợt cấy. Bảng 1.2. Các cơ quan của thực vật sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào Nguồn gốc mẫu vật Stt Kích thước Mẫu nuôi cấy nuôi cấy Mô phân sinh đỉnh Đỉnh sinh trưởng 1 0,5-1 mm (meristem) Chồi đỉnh Chóp đỉnh có chứa một phần thân 2 0,5-1 cm (shoot tip) Chồi nách Chồi bên có chứa một phần thân, lá 3 0,5-1 cm và chồi nách (axillary bud) Cuống lá Cuống lá được cắt nhỏ, phân nửa 4 0,2-0,3 cm được cấy chìm vào môi trường (leaf petiole) Phiến lá Phiến lá non đặt trên môi trường, 5 0,2-1 cm mặt dưới đặt trên mặt thạch (leaf blade) Rễ Mẫu rễ được đặt trên mặt thạch 6 0,5-1 cm (root) Dạng hành Mẫu được đặt trên bề mặt hay cấy 7 1-2 cm chìm phân nửa vào môi trường (bulds, scale) Cây mầm Chồi non 8 2-3 mm (seedling) Hạt phấn Hạt phấn trong bao phấn 9 0,1-0,5 mm (pollen, microspore)
159 http://www.ebook.edu.vn Bài 2 Môi trường dinh dưỡng Thành công chính trong các thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tìm ra thành phần vật chất của môi trường dinh dưỡng cần thiết để tế bào có thể sinh trưởng và phát triển được. Thành phần của môi trường dinh dưỡng thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy, tùy theo sự phát triển và phân hóa của mô cấy, tùy theo việc muốn duy trì mô ở trạng thái callus, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh. Người ta đã đưa ra đất nhiều loại môi trường khác nhau cho các thí nghiệm nuôi cấy mô. Đa số chúng có tính đặc hiệu cao, có nghĩa là chúng được nghiên cứu ra để nuôi cấy những mô đặc biệt nào đó. Một số môi trường khác có ứng dụng rộng hơn và đảm bảo sinh trưởng tốt cho nhiều loài cây, tuy nhiên không có những chỉ dẫn chung nào cho rằng môi trường nào trong chúng bảo đảm sinh trưởng tốt hơn. Để bắt đầu, cần phải thử trong những môi trường thông dụng nào đó, chẳng hạn môi trường Murashige-Skoog (1962) nếu không thành công thì sau đó thử trên các môi trường khác. Tuy vậy, tất cả những môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm năm thành phần chính: - Đường cung cấp nguồn carbon. - Các muối khoáng đa lượng. - Các muối khoáng vi lượng. - Các vitamin. - Các chất điều khiển sinh trưởng. Ngoài ra, tùy từng tác giả có thể bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định (các amino acid, EDTA...) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết cà chua ...). I. Thành phần chính của môi trường 1. Đường Trong nuôi cấy nhân tạo, nguồn carbon để mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia tăng sinh khối của mô không phải do quá trình quang hợp cung cấp mà do đường có trong môi trường dinh dưỡng.
160 http://www.ebook.edu.vn Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose và glucose. Nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ saccharose biến đổi từ 1-12%, thông dụng là 2-3%. 2. Các muối khoáng đa lượng Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: N, P, K, Ca, Mg và S (Bảng 2.1). Bảng 2.1. Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô Nguyên tố Nồng độ Stt Dạng sử dụng đa lượng (mM) ∑[NO3-, NH4+] N Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3, NH4NO3, 1 (NO3-, NH4+) (NH4)2SO4 khoảng 20 2 P NaH2PO4.7H2O, KH2PO4 khoảng 1 3 K KNO3, KCl.6H2O, KH2PO4 khoảng 10 4 Ca Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.2H2O hoặc khoảng 2 CaCl2.6H2O 5 Mg MgSO4.7H2O 0,5-3 6 S (NH4)2SO4 khoảng 1 3. Các muối khoáng vi lượng Nhu cầu muối khoáng của mô thực vật trong nuôi cấy là lĩnh vực ít được nghiên cứu. Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, nó đã được sinh lý học thực vật chứng minh đối với cây hoàn chỉnh do đó có thể sử dụng được hầu hết các nguyên tố vi lượng cần thiết đối với cây cho mô và tế bào nuôi cấy trong môi trường nhân tạo. Vì vậy, sự cung cấp này có tính kinh nghiệm trong những trường hợp cụ thể có thể là không cần thiết (Bảng 2.2). 4. Các vitamin
161 http://www.ebook.edu.vn Bảng 2.3 trình bày các vitamin thường được dùng trong các môi trường nuôi cấy (chủ yếu là bốn loại đầu). Các dung dịch stock vitamin dễ hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh dưới 0oC (trong ngăn đá tủ lạnh). Bảng 2.2. Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô Nguyên tố Nồng độ Stt Dạng sử dụng vi lượng (mg/L) 1 Mn MnSO4.4H2O 15-100 2 B H3BO3 6-100 3 Zn ZnSO4.7H2O 15-30 4 Cu CuSO4.5H2O 0,01-0,08 5 Mo Na2MoO4.2H2O 0,007-1 6 Co CoCl2.6H2O 0,1-0,4 7 I KI 2,5-20 8 Fe FeSO4.7H2O 15-27,9 Bảng 2.3. Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô Nồng độ Stt Tên vitamin (mg/L) 1 myo-inositol 100 2 Nicotinic acid 0,5-1 3 Pyridoxine.HCl (Vit B6) 0,05-0,5 4 Thiamine.HCl (Vit B1) 10-50 5 Panthotenate calcium (Vit B5) 1-5 6 Riboflavin (Vit B2) 1-5 7 Biotin 0,1-1 8 Folic acid 0,1-1
162 http://www.ebook.edu.vn 5. Các chất điều khiển sinh trưởng Một số chất sinh trưởng không tan trong nước, do đó khi pha dung dịch mẹ chất sinh trưởng cần chú ý: - Đối với 2,4-D, NAA, IAA, IBA và GA3: cân một lượng chất sinh trưởng đủ pha trong 50 mL dung dịch mẹ vào một ly khô, thêm 2-3 mL cồn 90% rồi lắc đến khi tan hết, sau đó mới thêm nước cất đến 50 mL. - Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt nước cất và vài giọt HCl 1 N, lắc cho tan sau đó thêm nước cất đến thể tích cần pha. - Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1 N trước khi pha đến thể tích cần thiết. Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA bảo quản trong lọ màu nâu), cất giữ tủ lạnh. 2,4-D, NAA tương đối bền có thể bảo quản như vậy trong một năm. BAP, IBA, KIN, và GA3 bảo quản được từ 2 đến 3 tháng. IAA cần pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính. Bảng 2.4. Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh trưởng Chữ Chữ Chất kích thích sinh trưởng Chất kích thích sinh trưởng viết tắt viết tắt BA Benzyladenin KIN Kinetin BAP Benzyladeninpurine NAA Naphthaleneacetic acid GA3 Gibberellic acid 2hZ Dihydrozeatin IAA Indoleacetic acid TDZ Thidiazuron IBA Indolebutyric acid Zea Zeatin 2-iP 2-Isopentenyl adenin 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid NOA Naphthoxyacetic acid Pic Picloram Chú ý Các chất sinh trưởng có thể tác động lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp (10-8). Cần dùng pipette riêng cho từng loại chất sinh trưởng một. Và chú ý rửa cẩn thận các ly, cốc, chai lọc đã dùng để đựng và pha các chất sinh trưởng ở nồng độ cao. Ngoại trừ IAA và GA3, các chất sinh trưởng còn lại được coi là bền vững trong quá trình hấp vô trùng. IAA sau khi pha dung dịch stock, được lọc qua màng lọc millipore (xem bài trước) sau đó chứa trong các tube eppendof được bọc giấy nhôm bên ngoài, bảo quản lạnh sâu. Môi trường sau khi hấp khử trùng để nhiệt độ giảm xuống còn
163 http://www.ebook.edu.vn khoảng 50-60oC khi đó mới cho IAA đã lọc vào (các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng). 6. Các chất hữu cơ khác 6.1. Nước dừa Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-inositol và một số amino acid khác. Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá cao, từ 10-20% thể tích môi trường. Lấy nước dừa già, lọc trong, cho vào các túi nilon và bảo quản trong lạnh sâu cho đến khi dùng. Thời gian bảo quản không quá vài tháng. Tốt nhất là nên sử dụng tươi. 6.2. Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein Đây là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô và tế bào động vật đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạn thương phẩm, thành phần hóa học không rõ. Dung dịch thủy phân casein cung cấp một số amino acid, lượng thường dùng là 1g/1 L môi trường. II. Vấn đề lựa chọn môi trường Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng. Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về mặt phân loại đã dùng loại môi trường gì. Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua một số thí nghiệm thăm dò. Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau, có thể chia ra làm ba loại: - Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi trường White, Knop và Knudson C. - Môi trường trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg. - Môi trường giàu chất dinh dưỡng: Điển hình là môi trường Murashige-Skoog và Linsmaier-Skoog. Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu thích hợp với loại môi trường nào nhất. Sau đó, cần
164 http://www.ebook.edu.vn tìm tỷ lệ NO3-/NH4+ thích hợp. Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm đối với một số môi trường đã cản trở khá nhiều sự tiến bộ trong các nghiên cứu về nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Hiện nay, môi trường Murashige-Skoog được coi như là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng. Vì vậy, những người mới tập sự nuôi cấy mô thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra được môi trường riêng của mình. III. Chuẩn bị các dung dịch làm việc Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc), người ta không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng đậm đặc (stock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng. Các dung dịch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Nếu chuẩn bị môi trường tốt thì sẽ giảm một số thời gian đáng kể cho công tác nuôi cấy. 1. Chuẩn bị môi trường Murashige-Skoog (MS, 1962). Chia làm 5 phần: Bảng 2.5. Thành phần môi trường MS Nồng độ Nồng độ trong dung Dung tích dùng cho Dung dịch stock dịch mẹ (g/200 mL) 1 L môi trường (mg/L) MS1: KNO3 1900 19 (× 10) KH2PO4 170 20 mL 1,7 NH4NO3 1650 16,5 MgSO4.7H20 370 3,7 (×20) MS2: CaCl2.2H2O 440 10 mL 8,8 MS3: H3BO3 6,2 0,124 MnSO4.4H2O 22,3 0,446 CoCl2.6H2O 0,025 0,5 mg (× 20) CuSO4.5H2O 0,025 10 mL 0,5 mg ZnSO4.4H2O 8,6 0,172 Na2MoO4.2H2O 0,25 5 mg KI 0,83 16,6 mg (× 20) MS4: FeSO4.7H2O 27,8 10 mL 0,556
165 http://www.ebook.edu.vn Na2-EDTA 37,3 0,746 MS5: myo-inositol 100 2 Thiamine.HCl 0,1 2 mg (× 20) Pyridoxine.HCl 0,5 10 mL 10 mg Nicotinic acid 0,5 10 mg Glycine 2 40 mg 2. Chuẩn bị môi trường Nitsch (Nt, 1956). Chia làm 5 phần: Bảng 2.6. Thành phần môi trường Nitsch Nồng độ Nồng độ trong dung Dung tích dùng cho Dung dịch stock dịch mẹ (g/200 mL) 1 L môi trường (mg/L) Nt1: KNO3 950 9,5 (× 10) KH2PO4 68 20 mL 0,68 NH4NO3 720 7,2 MgSO4.7H20 185 1,85 (×20) 1,66 Nt2: CaCl2.2H2O 166 10 mL Nt3: H3BO3 10 0,2 MnSO4.4H2O 25 0,5 (× 20) CuSO4.5H2O 0,0025 10 mL 0,05 mg ZnSO4.4H2O 10 0,2 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,5 mg (× 20) Nt4: FeSO4.7H2O 27,8 10 mL 0,556 Na2-EDTA 37,3 0,746 Nt5: myo-inositol 100 2 Thiamine.HCl 0,5 10 mg Pyridoxine.HCl 0,5 10 mg (× 20) Nicotinic acid 5 10 mL 100 mg Glycine 0,05 40 mg Biotin 2 1 mg
166 http://www.ebook.edu.vn Acid folic 0,5 10 mg 3. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy protoplast (theo Trigiano & Gray, 2000) - Môi trường phân lập (Protoplast Isolation medium –PI) Bảng 2.7. Thành phần môi trường phân lập PI Nồng độ Stt Thành phần (mg/L) 1 CaCl2.H2O 1480 2 KH2PO4 27,2 3 KNO3 101 4 MgSO4.7H2O 246 5 CuSO4.5H2O 0,025 6 KI 0,16 pH môi trường 5,8 - Môi trường nuôi cấy (Protoplast Culture medium –PC) Bảng 2.8. Thành phần môi trường PC Nồng độ trong Dung tích Nồng độ Dung dịch stock dung dịch mẹ dùng cho 1 L (mg/L) môi trường (g/200 mL) (× 20) PC1: Ca(H2PO4)2.2H2O 100 10 mL 2 CaCl2.2H2O 450 9 PC2: KNO3 2500 50 (× 20) NaH2PO4.2H2O 170 10 mL 3,4 (NH4)2SO4 134 1,68 MgSO4.7H20 250 5 PC3: H3BO3 3 60 mg MnSO4.4H2O 13,2 132 mg CoCl2.6H2O 0,025 0,5 mg (× 20) CuSO4.5H2O 0,025 10 mL 0,5 mg ZnSO4.7H2O 2 40 mg
167 http://www.ebook.edu.vn Na2MoO4.2H2O 0,25 5 mg KI 0,75 15 mg (× 20) myo-inositol PC4: 100 10 mL 2 Nicotinic acid 1 20 mg Lấy mỗi loại stock PC (PC1, PC2, PC3 và PC4) 10 mL. Bổ sung thêm: + Sequestrene 330 28 mg/L + Sucrose 10 g/L + Glucose 18 g/L + Mannitol 100 g/L
168 http://www.ebook.edu.vn Bài 3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng I. Mục đích và yêu cầu Một phương thức dễ dàng nhất để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Môi trường thích hợp thay đổi tùy theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy nhưng cơ bản là môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ, được bổ sung chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và rễ trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất có điều kiện sinh trưởng phát triển bình thường. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường, được thực hiện bằng kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Khi chọn đỉnh sinh trưởng để nhân giống cần lưu ý, nếu dùng đỉnh sinh trưởng nhỏ quá thì nuôi cấy khó thành công, nếu dùng đỉnh sinh trưởng lớn quá thì nuôi cấy dễ thành công nhưng cũng dễ bị nhiễm trùng. Kích thước của đỉnh sinh trưởng thay đổi tùy theo từng loài cây, tuy nhiên một đỉnh sinh trưởng có kích thước 5-10 mm là thích hợp hơn cả. Con đường phát triển của đỉnh sinh trưởng để thành cây có thể trực tiếp hoặc thông qua giai đoạn protocorm (dẽ hành). II. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 1. Dụng cụ - Bình tam giác (100 mL, 250 mL) - Giấy nhôm - Giấy thấm vô trùng - Lọ thủy tinh khử trùng mẫu vật nuôi cấy - Forceps, kéo, dao mổ - Đĩa petri vô trùng - Cốc chịu nhiệt, ống đong, micropipette các loại