Thiết kế hệ thống cấu trúc vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen GmNAC29 liên quan tới khả năng chống chịu hạn của cây đậu tương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong bài viết này, đã tiến hành thiết kế hệ thống vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 có chứa các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmNAC29. Kết quả này sẽ cung cấp hệ thống gây đột biến có định hướng gen GmNAC29 liên quan tới khả năng chống chịu hạn của cây đậu tương.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thiết kế hệ thống cấu trúc vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen GmNAC29 liên quan tới khả năng chống chịu hạn của cây đậu tương

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THIẾT KẾ HỆ THỐNG CẤU TRÚC VECTOR CRISPR/Cas9 ĐỂ CHỈNH SỬA GEN GmNAC29 LIÊN QUAN TỚI KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG Nguyễn Hữu Kiên1,a, Vũ Văn Tiến1,2,a, Lê Thị Mai Hương1, Nguyễn Trung Anh1, Đinh Thị Mai Thu1 , Nguyễn Thị Hòa1, Tống Thị Hường1, Đinh Thị Thu Ngần1, Phạm Xuân Hội1, Jae-Yean Kim2*, Nguyễn Văn Đồng1* TÓM TẮT Đậu tương (Glycine max L.) là một trong những cây họ đậu có giá trị kinh tế cao được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Tuy nhiên, đậu tương lại là cây trồng nhạy cảm với stress hạn. Các yếu tố phiên mã NAC được biết là có tham gia vào quá trình điều hòa đáp ứng và chống chịu của cây trồng với stress hạn. GmNaC29 được biết tới như là một gen đóng vai trò tiêu cực trong quá trình đáp ứng bất lợi trong đó có hạn. Do vậy, trong nghiên cứu này, đã tiến hành thiết kế hệ thống vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 có chứa các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmNAC29. Kết quả này sẽ cung cấp hệ thống gây đột biến có định hướng gen GmNAC29 liên quan tới khả năng chống chịu hạn của cây đậu tương. Từ khóa: CRISPR/Cas9, đậu tương, hạn, NAC, PCR. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Cây trồng đáp ứng với hạn một cách gián tiếp Sự thiếu hụt nước (hạn hán) là một trong những thông qua một số mạng lưới điều khiển khác nhau, stress phi sinh học ảnh hưởng bất lợi nghiêm trọng trong đó yếu tố phiên mã (TF) đóng vai trò quan tới năng suất cây trồng và an ninh lương thực trên trọng trong quá trình điều hòa biểu hiện của các gen toàn thế giới. Hơn nữa, hạn hán còn là nguyên nhân mục tiêu. Các protein NAC (NAM, ATAF1/2 và gây ra những ảnh hưởng tiêu cực khác nhau liên CUC2) được biết tới như là một họ TF lớn hiện diện quan tới quá trình trao đổi chất ở thực vật như sự co ở hầu hết các loài thực vật. Các TF NAC được biết giãn tế bào, phá hủy màng tế bào, giảm chức năng tham gia vào hầu hết các quá trình sinh trưởng, phát của các enzyme liên quan tới sự liên kết màng, oxy triển và đáp ứng với các stress phi sinh học khác hóa lipid và các protein do sự tích lũy các sản phẩm nhau ở cây trồng (Nguyễn Hữu Kiên và Nguyễn Văn dư thừa từ các phản ứng oxy hóa và ức chế khả năng Đồng, 2016; Ohbayashi và Sugiyama, 2018). Trong quang hợp (Tak et al., 2017; Thirumalaikumar et al., những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vai 2017). Để đối phó với các stress phi sinh học trong trò của các yếu tố phiên mã NAC tham gia vào quá đó có hạn, cây trồng thường kích hoạt một số cơ chế trình đáp ứng với hạn của cây trồng (Puranik et al., đáp ứng với bất lợi ở các mức độ sinh hóa, sinh lý và 2012; Nuruzzaman et al., 2013). phân tử khác nhau để giúp chúng sống sót trong Đậu tương (Glycine max L.) là một trong những điều kiện stress (Basu et al., 2016; Singh et al., 2016; cây trồng họ đậu được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên Thirumalaikumar et al., 2017). thế giới. Tuy nhiên, đậu tương lại là một trong số cây trồng bị thiệt hại nghiêm trọng bởi hạn (Song et al., 2016; Valliyodan et al., 2017). Một nghiên cứu trước 1 Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào thực đây đã chỉ ra GmNAC29 là gen đáp ứng với các yếu Vật, Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Khoa học Nông tố stress phi sinh học trong đó có hạn và đóng vai trò nghiệp Việt Nam 2 Bộ môn Khoa học sự sống ứng dụng (Chương trình như là một yếu tố phiên mã điều hòa tiêu cực với hạn BK21), Trung tâm Nghiên cứu Sinh học phân tử thực vật và (Wang et al., 2015), từ đó đề xuất gen này như là một Công nghệ sinh học, Trường Đại học Quốc gia ứng viên có thể sử dụng trong việc cải thiện khả Gyeongsang, Hàn Quốc năng chống chịu hạn của cây đậu tương bằng việc a Đồng tác giả chính * làm bất hoạt hay mất chức năng của gen. Chính vì Email: kimjaeyean@gmail.com; dongjircas@yahoo.com vậy, nghiên cứu này được thực hiện để thiết kế các N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 3
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ sgRNA và xây dựng vector CRISPR/Cas9 có chứa nhận từ Trường Đại học Quốc gia Gyeongsang, Hàn các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmNAC29 nhằm thiết Quốc và được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Trọng lập một hệ thống gây đột biến có định hướng gen điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền GmNAC29 trên cây đậu tương. nông nghiệp. Các primer sử dụng trong nghiên cứu 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU được trình bày ở bảng 1. 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các cấu trúc vector pICH47751 và pID được Bảng 1. Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu Stt Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước (bp) 1 U6-F CAGTCGGTCTCAGGAGtgatcaaaagtcccacatcgatcaggtgatatatagcagcttagttta 64 2 U6-R CAGTCGGTCTCAcaatcgctatgtcgactctatcattatataaactaagctgctatatatcacc 64 3 sgRNA1-F CAGTCGGTCTCAATTGGGCATGGCTTTGAGGTGGCTgttttagagctagaaata 86 gcaagttaaaataaggctagtccgttatcaac 4 sgRNA2-F CAGTCGGTCTCAATTGGATGTTACAATTAATATACCgttttagagctagaaatag 86 caagttaaaataaggctagtccgttatcaac 5 sgRNA-R CAGTCGGTCTCAAGCGAAAAAAAgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacgg 74 actagccttatttt 2.2.1. Tìm kiếm dữ liệu và thiết kế các sgRNA Phusion Taq 0,6 µL và nước cất 2 lần cho đủ tổng thể tích 60 µL và theo chu trình: Biến tính 98oC 20 giây; Trình tự gen GmNAC29 được tìm kiếm trên 35 chu kỳ với 3 bước (Biến tính 98oC 10 giây; gắn mồi trang cơ sở dữ liệu Soykb (http://soykb.org/). 60oC 30 giây; kéo dài 72oC 10 giây); kéo dài 72oC 5 Để tiến hành thiết kế các sgRNA cho chỉnh sửa phút; giữ 12oC 15 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra gen GmNAC29, đã sử dụng công cụ CRISPR-P2 bằng điện di trên gel agarose 1% và tinh sạch bằng (http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/). Trên web CRSPR- kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, Đức). P2 lựa chọn đối tượng cần thiết kế là cây đậu tương Tiếp theo, sản phẩm PCR tinh sạch của và vị trí locus của gen GmNAC29 promoter U6 và mỗi sgRNA được ghép nối với vector (Glyma.20G033300.1). Ngoài ra, để xác định số tiếp nhận pICH47751 trong phản ứng Golden Gate lượng off-target của các sgRNA, công cụ online với thành phần: T4 DNA ligase buffer (10X) 1,5 µL; (http://www. rgenome.net/cas-offinder/) được sử đoạn promoter U6 (100 bp; 6 ng/μL) 0,23 µL; đoạn dụng. sgRNA (135 bp; 6 ng/μL) 0,3 µL; vector pICH47751 2.2.2. Xây dựng hệ thống vector CRISPR/Cas9 (4968 bp; 100 ng/μL) 0,42 µL; T4 DNA ligase 0,5 µL; chứa các sgRNA của các gen GmNAC29 enzyme BsaI 0,5 µL và nước cất 2 lần cho đủ tổng thể Để thiết kế hệ thống vector CRISPR/Cas9 có tích 15 µL và phản ứng được thực hiện theo chu o chứa các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmNAC29, đã sử trình: xử lý tiền cắt ở 37 C 15 phút, phản ứng cắt-nối o o dụng hệ thống Moclo toolkit (Addgene, Hoa Kỳ) 30 chu kỳ (37 C 2 phút; 16 C 5 phút), xử lý sau cắt o o theo hướng dẫn của nghiên cứu trước đây (Warner et lần 1 ở 37 C 5 phút, xử lý sau cắt lần 2 ở 50 C 5 phút, o al., 2012) với một số chỉnh sửa để phù hợp với điều dừng phản ứng ở 80 C 5 phút. kiện phòng thí nghiệm. Cụ thể, đoạn promoter U6 và Các vector tái tổ hợp từ phản ứng Golden Gate các GmNAC29_sgRNA(1,2) được khuếch đại bằng cho mỗi cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA được biến PCR với các cặp mồi tương ứng U6-F/U6-R cho nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10 bằng phương promoter U6 và sgRNA(1,2)-F/sgRNA-R cho các pháp sốc nhiệt. Sau đó, dịch khuẩn biến nạp được sgRNA(1, 2) của GmNAC29 (Bảng 1) sử dụng cấy trải và nuôi qua đêm trên đĩa môi trường LB đặc enzyme Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase có bổ sung 20 mg/L X-gal và 125 mg/L ampicillin ở (ThermoFisher Scientific, Hoa Kỳ) với điều kiện 37oC. Các khuẩn lạc màu trắng cho mỗi cấu trúc phản ứng: HF buffer (5X)12 µL; dNTPs (10 mM) 1,2 U6:GmNAC29_sgRNA được lựa chọn cho nuôi tăng µL; mồi xuôi (10 µM) 3µL; mồi ngược (10 µM) 3µL; 4 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ sinh khối trong môi trường LB lỏng có bổ sung 125 Để tìm kiếm trình tự gen GmNAC29, code mg/L ampicillin và tách chiết DNA plasmid sử dụng Glyma.20G033300.1 được sử dụng cho tìm kiếm trên kit Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep (Jena Bioscience, trang cơ sở dữ liệu về cây đậu tương Soykb Đức). Các DNA plasmid của mỗi cấu trúc (http://soykb.org/). Kết quả tìm kiếm được trình U6:GmNAC29_sgRNA được cắt kiểm tra bằng bày trong hình 1. enzyme giới hạn BpiI. Các khuẩn lạc dương tính đối Kết quả ở hình 1 cho thấy, Glyma.20G033300.1 với mỗi cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA được sử dụng nằm trên NST số 20 và mRNA bắt đầu từ vị trí cho giải trình tự với mồi Lv11-sF1: 5’- 4.521.780 và kết thúc ở vị trí 4.523.723 có chiều dài là GGTGTAAACAAATTGACGCTTAGA-3’ bằng máy 1943 bp, có chứa cả vùng không dịch mã (5’UTR và giải trình tự theo phương pháp của Sanger. 3’UTR), các vùng exon và intron. Trong đó, Tiếp theo, các vector tái tổ hợp pICH47751 chứa Glyma.20G033300.1 có chứa 3 vùng exon có kích các cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) với trình tự thước khác nhau để mã hóa liên tục cho gen chính xác của promoter U6 và các đoạn sgRNA cho GmNAC29 có chiều dài 843 bp (Hình 1). chỉnh sửa gen GmNAC29 được trực tiếp sử dụng cho ghép nối với vector pID trong phản ứng Golden Gate gồm các thành phần: T4 DNA ligase buffer (10X) 1,5 µL; pICH47751:U6:GmNAC29_sgRNA1 1 µL; pICH47751:U6:GmNAC29_sgRNA2 1 µL; vector pID (11,348 bp; 500 ng/μL) 0,26 μL; enzyme BpiI 0,5 μL; nước cất 2 lần cho đủ tổng thể tích 15 μL và tiến hành theo chu trình như trình bày ở trên. Sản phẩm của vector tái tổ hợp pID:U6:GmNAC29_sgRNAs được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10. Sau đó, dịch khuẩn được cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 50 mg/L kháng sinh kanamycin và nuôi ở 37oC qua Hình 2. Kết quả phân tích trình tự DNA và protein đêm. Các khuẩn lạc trắng được lựa chọn để nuôi tăng của GmNAC29 sinh khối trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50 mg/L Kanamycin và tách chiết DNA plasmid sử Chú thích: (a) cấu trúc của GmNAC29; (b) Vùng bảo dụng kit Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep. Các DNA thủ của GmNAC29 ở đầu N- plasmid tinh sạch của pID:U6:GmNAC29_sgRNAs Tiếp theo, khi phân tích trình tự DNA của được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn BamHI. Cuối GmNAC29 trên web cùng, các DNA plasmid của vector tái tổ hợp https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb pID:U6:GmNAC29_sgRNAs được sử dụng để giải .cgi, kết quả cho thấy GmNAC29 mã hóa cho 281 trình tự với mồi Lv11-sF1. amino axit nằm ở phân họ NAM (No Apical 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Meristem) của họ yếu tố phiên mã NAC (Hình 2a). Hơn nữa, khi phân tích trình tự protein của 3.1. Kết quả tìm kiếm dữ liệu gen GmNAC29 GmNAC29 ở đầu N-, kết quả cho thấy GmNAC29 có chứa 5 vùng bảo thủ (A-E) và các vùng bảo thủ này tương đồng với một số protein NAC ở một số đối tượng cây trồng khác, cụ thể là cây cải xoong. Qua kết quả tìm kiếm này cho thấy, GmNAC29 là một gen thuộc họ yếu tố phiên mã NAC có chiều dài là 843 bp và mã hóa cho 281 amino axit. Từ đây, đã lựa chọn gen GmNAC29 là đối tượng cần chỉnh sửa và sử dụng trình tự của nó để thiết kế các sgRNA Hình 1. Kết quả tìm kiếm gen GmNAC29 cho xây dựng hệ thống vector CRISPR/Cas9 mang sgRNA để chỉnh sửa gen GmNAC29. N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 5
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 3.2. Kết quả thiết kế các sgRNA của gen Từ thông tin đối tượng cần chỉnh sửa và vị trí GmNAC29 locus cần chỉnh sửa cung cấp cho công cụ CRISPR- P2, đã chỉ ra được vị trí của toàn bộ các sgRNA trên trình tự của GmNAC29 (Hình 3). Kết quả ở hình 3 cho thấy có tổng số 169 sgRNA được tìm thấy trên toàn bộ vùng trình tự của Glyma.20G033300.1. Từ kết quả đó đã lựa chọn được 2 sgRNA nhằm chỉnh sửa gen GmNAC29 nằm trên vùng exon 1 trong vùng bảo Hình 3. Vị trí các đoạn sgRNA trên trình tự gen thủ đặc trưng của NAC ở đầu N- (Bảng 2). GmNAC29 Bảng 2. Các sgRNA được lựa chọn cho chỉnh sửa gen GmNAC29 STT Tên Trình tự đích sgRNA Vị trí Số lượng ngoài mục tiêu đích (
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn sau khi khoảng 4352 bp trùng với kích thước của vector biến nạp được cấy trải và nuôi qua đêm trên đĩa môi pICH47751 và 1 băng có kích thước 237 bp được dự trường LB đặc có bổ sung 20 mg/L X-Gal kết hợp với đoán là của các cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) 125 mg/L ampicillin ở 37oC. Bốn khuẩn lạc màu (Hình 4B). Như vậy, bước đầu cho thấy việc tách trắng cho mỗi cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA được dòng và ghép nối các đoạn sgRNA(1,2) của lựa chọn để nuôi tăng sinh khối trong môi trường LB GmNAC29 và promoter U6 vào vector tiếp nhận lỏng có bổ sung 125 mg/L Ampicilin để tách chiết pICH47751 đã thành công. thu DNA plasmid. Các vector tái tổ hợp cho mỗi Tiếp theo, 2 trong số 4 khuẩn lạc dương tính với U6:GmNAC29_sgRNA được cắt kiểm tra bằng mỗi cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA được lựa chọn để enzyme giới hạn BpiI. giải trình tự với mồi Lv11-sF1: 5’- Kết quả điện di cho thấy, với mỗi cấu trúc tái tổ GGTGTAAACAAATTGACGCTTAGA-3’ bằng máy hợp U6:GmNAC29_sgRNA sau khi cắt đều có 2 vạch giải trình tự Sanger. băng trên bản gel. Cụ thể, 1 băng có kích thước Bảng 3. Kết quả giải trình tự các cấu trúc U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) U6:GmNAC29_sgRNA1 U6:GmNAC29_sgRNA2 tctgtGAAGACaaACTAgaattcccatggggagTgatcaaaag TctgtGAAGACaaTTACgaattcccatggggagTgatcaaaa tcccacatcgatcaggtgatatatagcagcttagtttatataatgataga gtcccacatcgatcaggtgatatatagcagcttagtttatataatgatag gtcgacatagcgattgGGCATGGCTTTGAGGTGGCTgtt agtcgacatagcgattgGATGTTACAATTAATATACCgt ttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttg tttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaactt aaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttctagacccagctttcttgtac gaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttctagacccagctttcttgt aaagttggcattacgctTTACttGTCTTCtgcac acaaagttggcattacgctCAGAttGTCTTCtgcac Chú thích: Chữ in đậm màu đỏ, vị trí enzyme giới hạn BsaI nhận biết; chữ in đậm màu xanh, vị trí cắt của enzyme giới hạn BsaI; chữ gạch chân, trình tự các sgRNA. Kết quả giải trình tự cho thấy, tất cả 2 vector ghép nối các cấu trúc này vào vector binary pID pICH47751 có chứa các cấu trúc trong phản ứng Golden gate. Sản phẩm tái tổ hợp của U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) và đều mang trình tự cấu trúc vector pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) được chính xác của promoter U6 và theo sau là các biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10. Sau đó, sgRNA(1,2) của GmNAC29 (Bảng 3). dịch khuẩn được cấy trải và nuôi qua đêm trên đĩa LB có bổ sung 50 mg/L kháng sinh kanamycin ở 37oC. Ba trong số các khuẩn lạc trắng được lựa chọn để tiếp tục nuôi tăng sinh khối trong LB lỏng có bổ sung 50 mg/L kanamycin cho tách chiết và tinh sạch DNA plasmid phục vụ cho việc giải trình tự và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn. Kết quả cắt kiểm tra vector tái tổ hợp pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) bằng enzyme giới hạn BamHI cho thấy, các sản phẩm cắt đều có 2 băng; trong đó, 1 băng có kích thước khoảng 7738 bp Hình 5. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp có chứa vùng trình tự của 2 tổ hợp cấu trúc pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) bằng enzyme giới U6:GmNAC29_sgRNA(1,2), trùng với kích thước dự hạn BamHI đoán và 1 băng có kích thước khoảng 4039 bp có Chú thích: M, 1Kb plus ladder; 1-3, DNA chứa trình tự của gen Bar và Cas9 (Hình 5). Để đảm plasmid của các khuẩn lạc bảo sự chính xác, hai trong số ba khuẩn lạc đã được pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2). lựa chọn để giải trình tự kiểm tra lại. Kết quả cho Tiếp theo, cả 2 vector pICH47751 chứa các cấu thấy, vector pID chứa 2 tổ hợp cấu trúc trúc U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) được sử dụng để U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) có trình tự hoàn toàn N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 7
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ chính xác như trình bày ở bảng 3 và được sắp xếp 4. KẾT LUẬN như trong hình 6. Các kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, hệ thống vector CRISPR/Cas9 chứa tổ hợp các U6:sgRNA(1,2) cho chỉnh sửa có định hướng gen GmNAC29 đã được thiết kế thành công. Thành công của nghiên cứu này sẽ cung cấp hệ thống vector CRISPR/Cas9 cho chỉnh sửa gen đích GmNAC29 ở cây đậu tương nhằm tăng cường khả năng chống chịu hạn. LỜI CẢM ƠN Công trình nghiên cứu được thực hiện trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu bước đầu tạo cây đậu tương tăng cường khả năng chịu hạn bằng kỹ thuật CRISPR/Cas9” theo Quyết định số 617/QĐ-KHNN- KH ngày 31/7/2019 của Giám đốc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam về việc Phê duyệt danh mục Hình 6. Cấu trúc vector các nhiệm vụ thường xuyên Phòng Thí nghiệm pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) và tổ hợp cấu trúc Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật thực hiện từ các U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) cho chỉnh sửa gen năm 2019. Công trình nghiên cứu được đồng tài trợ GmNAC29 bởi Quỹ Nghiên cứu Quốc gia Hàn Quốc (Mã số Đề Chú thích: (a) Cấu trúc vector tài NRF 2020M3A9I4038352 pID:U6:GmNAC29_sgRNA(1,2). (b) Tổ hợp cấu trúc và 2020R1A6A1A03044344). chứa các sgRNA của GmNAC29. LB, biên trái; NOSp- BAR-NOST, chỉ thị gen bar kháng glufosinate; 2x35S- TÀI LIỆU THAM KHẢO hSpCas9-tNOS, Cas9 được điều khiển bởi promoter 1. Bao A., Burritt D. J., Chen H., Zhou X., Cao 35S; U6:GmNAC29_sgRNA(1,2), vị trí lần lượt của D., & Tran, L. P. 2019. The CRISPR/Cas9 system các sgRNA của GmNAC29 từ trái sang phải; RB, biên and its applications in crop genome editing. Crit Rev phải; pVS1, vùng bắt đầu sao chép; nptII, chỉ thị gen Biotechnol, 39(3): 321-336. nptII kháng kanamycin. 2. Basu S., Ramegowda V., Kumar A., Pereira Qua hình 6 cho thấy, vector binary pID có chứa A. (2016). Plant adaptation to drought stress. tổ hợp cấu trúc cho chỉnh sửa gen GmNAC29 ở cây F1000Res, 5: 1554. đậu tương được sắp xếp lần lượt từ vùng LB sang RB 3. Nguyễn Hữu Kiên, Nguyễn Văn Đồng gồm có: 1 vùng chứa đoạn gen Bar, 1 vùng chứa (2016). Yếu tố phiên mã NAC trong thực vật: vai trò Cas9 được điều khiển bằng promoter 2x35S, và 2 và tiềm năng ứng dụng. Hội thảo Quốc gia về Khoa sgRNA được điều khiển bởi promoter U6 riêng biệt, học cây trồng lần thứ hai, 2: 302-306. cùng với hệ thống chọn lọc đối với vi khuẩn là kháng 4. Nuruzzaman M., Sharoni A. M., Kikuchi S. sinh kanamycin và thực vật là glufosinate. Với kết (2013). Roles of NAC transcription factors in the quả này, cấu trúc vector binary pID có chứa hệ thống regulation of biotic and abiotic stress responses in CRISPR/Cas9 và các U6:GmNAC29_sgRNA(1,2) cho plants. Front. Microbiol, 4: 248. chỉnh sửa gen GmNAC29 ở cây đậu tương đã được 5. Puranik S., Sahu P. P., Srivastava P. S., thiết kế thành công. Kỹ thuật chỉnh sửa gen bằng Prasad M. (2012). NAC proteins: regulation and role công nghệ CRISPR/Cas9 được biết tới là một công in stress tolerance. Trends Plant Sci, 17: 369–381. cụ hữu ích trong nghiên cứu chức năng cụ thể của 6. Ohbayashi I., Sugiyama M. (2018). Plant một gen, gần đây hơn kỹ thuật này cũng đã được ứng nucleolar stress response, a new face in the NAC- dụng trong nghiên cứu chỉnh sửa các gen liên quan dependent cellular stress responses. Front. Plant Sci, tới các đặc tính chống chịu với các điều kiện môi 8: 2247. trường bất lợi khác nhau trên một số đối tượng cây 7. Singh D., Yadav N. S., Tiwari V., Agarwal P. trồng quan trọng (Bao et al., 2019). K., Jha B. (2016). A SNARE-like superfamily protein 8 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SbSLSP from the halophyte salicornia brachiata JUNGBRUNNEN1 enhances drought tolerance in confers salt and drought tolerance by maintaining tomato. Plant Biotechnol. J, 16: 354–366. membrane stability, K(+)/Na(+) ratio, and 11. Valliyodan B., Ye H., Song L., Murphy M., antioxidant machinery. Front. Plant Sci, 7: 737. Shannon J. G., Nguyen H. T. (2017). Genetic 8. Song L., Prince S., Valliyodan B., Joshi T., diversity and genomic strategies for improving Maldonado dos Santos J. V., Wang J., Lin L., Wan J., drought and waterlogging tolerance in soybeans. J. Wang Y., Xu D., Nguyen H. T. (2016). Genome-wide Exp. Bot, 68: 1835–1849. transcriptome analysis of soybean primary root 12. Wang F., Chen H. W., Li Q. T., Wei W., Li under varying water-deficit conditions. BMC W., Zhang W. K., Ma B., Bi Y. D., Lai Y. C., Liu X. L., Genomics, 17: 57. Man W. Q., Zhang J. S., Chen S. Y. (2015). 9. Tak H., Negi S., Ganapathi T. R. (2017). GmWRKY27 interacts with GmMYB174 to reduce Banana NAC transcription factor MusaNAC042 is expression of GmNAC29 for stress tolerance in positively associated with drought and salinity soybean plants. The Plant Journal, 83(2): 224-236. tolerance. Protoplasma, 254: 803–816. 13. Werner S., Engler C., Weber E., Gruetzner 10. Thirumalaikumar V. P., Devkar V., Mehterov R., Marillonnet S. (2012). Fast track assembly of N., Ali S., Ozgur R., Turkan I., Mueller-Roeber B., multigene constructs using Golden Gate cloning and Balazadeh S. (2017). NAC transcription factor the MoClo system. Bioeng Bugs, 3(1): 38-43. CONSTRUCTION OF THE CRISPR/Cas9 VECTOR SYSTEM FOR EDITING GmNAC29 GENE RELATED TO DROUGHT TOLERANCE IN SOYBEAN Nguyen Huu Kien1,a, Vu Van Tien1,2,a, Le Thi Mai Huong1, Nguyen Trung Anh1, Dinh Thi Mai Thu1, Nguyen Thi Hoa1, Tong Thi Huong1, Dinh Thi Thu Ngan1, Pham Xuan Hoi1, Jae-Yean Kim2* , Nguyen Van Dong1* 1 National Key Laboratory for Plant Cell Biotechnology, Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences, Hanoi, Vietnam 2 Division of Applied Life Science (BK21 program), Plant Molecular Biology and Biotechnology Research Center, Gyeongsang National University, Republic of Korea. a Equally contributed * Email: kimjaeyean@gmail.com and dongjircas@yahoo.com Summary Soybean (Glycine max L.) is one of the most highly valuable legumes planted in many regions around the world. However, soybean is considered one of the most drought susceptible plants. The NAC transcription factors have been well-known to be involved in regulation of plant response and tolerance to drought. GmNAC29 was shown to act as a negative regulator in plant response to abiotic stresses, including drought. Thus, in this study, we conducted to construct the CRISPR/Cas9 gene-editing vector system carrying sgRNAs of GmNAC29. The result will provide a CRISPR/Cas9-mediated mutagenic system for the GmNAC29 gene related to drought tolerance in soybean plants. Keywords: CRISPR/Cas9, drought stress, NAC, PCR, soybean. Người phản biện: TS. Nguyễn Xuân Thắng Ngày nhận bài: 13/7/2020 Ngày thông qua phản biện: 13/8/2020 Ngày duyệt đăng: 20/8/2020 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 1 - TH¸NG 12/2020 9