Thiết kế vector biển hiện Gene ở thực vật từ nhân dòng Promoter và Terminator ở cây Arabidopsis thaliana

TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN<br /> <br /> THIẾT KẾ VECTOR BIỂN HIỆN GENE Ở THỰC VẬT<br /> TỪ NHÂN DÒNG PROMOTER VÀ TERMINATOR<br /> Ở CÂY ARABIDOPSIS THALIANA<br /> Nguyễn Huy Hoàng*, Phạm Bích Ngọc**,<br /> Chu Hoàng Hà**, Lê Văn Sơn**<br /> TÓM TẮT<br /> Title: Construction of the Gene<br /> Expression Vector in Plant for<br /> Cloning<br /> Promoter<br /> and<br /> Terminator from Arabidopsis<br /> thaliana<br /> Từ khóa: Arabidopsis, biểu hiện,<br /> protein tái tổ hợp, promoter,<br /> terminator<br /> Keywords: Arabidopsis,<br /> expression, recombinant,<br /> promoter,terminator<br /> Thông tin chung:<br /> Ngày nhận bài: 06/10/2017;<br /> Ngày nhận kết quả bình duyệt:<br /> 10/01/2017;<br /> Ngày chấp nhận đăng bài:<br /> 15/01/2017.<br /> Tác giả:<br /> * ThS., Trường ĐH Y Dược Thái<br /> Nguyên<br /> ** Viện Công nghệ Sinh học, Viện<br /> hàn lâm Khoa học và Công nghệ<br /> Việt Nam<br /> nguyen@huyhoang.info<br /> <br /> Hoạt động của protein sốc nhiệt Heat Shock Protein (HSP) ở cây<br /> Arabidopsis Thaliana được cảm ứng bởi nhiệt độ và được điều hoà<br /> hoạt động bởi promoter HSP và terminator HSP. Bài báo này trình bày<br /> các kết quả nhân dòng promoter và terminator HSP từ Arabidopsis<br /> thaliana. Promoter HSP phân lập được có chiều dài 720 bp và mang<br /> đầy đủ các yếu tố điều hòa cis của promoter điển hình: sáu vùng cảm<br /> ứng với nhiệt độ: Vị trí 482 - 495, 492 - 505, 502 - 515, 549 - 562, 559 572 và 600 - 613, hộp CAAT (vị trí 39-42), 2 hộp GATA (vị trí 73 - 76 và<br /> 406 - 409) và hộp TATA (vị trí 643 - 649). Terminator HSP có chiều dài<br /> 250 bp, vị trí đuôi poly A là ở nucleotide 158. Các trình tự này được sử<br /> dụng cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm thiết kế vector biểu hiện gene<br /> ở thực vật có hiệu suất biểu hiện protein tái tổ hợp cao.<br /> ABSTRACT<br /> In Arabidopsis, promoter and terminator HSP regulated<br /> expression of heat shock protein gene which were induced by high<br /> environmental temperature. This study presents results of HSP<br /> promoter and terminator cloning and sequencing from the Arabidopsis<br /> thaliana for construction of vector to express target gene in plant. The<br /> data obtained showed that HSP promoter has 720bp in length that<br /> carries a full range of cis-acting elements similar to a typical promoter<br /> such as CAAT box (39 to 42), two GATA boxes (73 to 76 and 406 to 409)<br /> and TATA box (643 to 649). Furthermore, This promoter contains six<br /> heat shock elements: 482 to 495, 492 to 505, 502 to 515, 549 to 562,<br /> 559 to 572 and 600 to 613. HSP 18.2 terminator has 250 bp in length<br /> and poly A site of HSP terminator was identified at 158 nucleotide<br /> position. These sequences will contribute a fundamental basis for<br /> further researches in order to construct high expression vector<br /> carrying HSP promoter and terminator in transgenic plants.<br /> <br /> 1. Mở đầu<br /> Thực vạ̣ t được xem lạ̀ hẹ thố ng biẻ u hiẹ n<br /> prôtein tạ́ i tổ hợp với nhiè u ưu điẻ m sô với hẹ<br /> thố ng biẻ u hiẹ n vi khuạ̉ n, dồ ng té bạ̀ ô độ ng vạ̣ t<br /> cố vú , độ ng vạ̣ t chuyẻ n gen... thẻ hiẹ n ở chi phí<br /> sạ̉ n xuạ́ t thạ́ p, khạ̉ nặ ng mở rộ ng quy mô sạ̉ n<br /> xuạ́ t cạô, cạ́ c hợp chạ́ t được tạ̣ ô rạ cố mức độ ạn<br /> tôạ̀ n cạô, không bị ô nhiẽ m, ở thực vạ̣ t cố quạ́<br /> trình cạ̉ i bié n sạu dịch mạ̃ cạ̀ n thié t chô hôạ̣ t tính<br /> củ ạ nhiè u hợp chạ́ t (Desai PN & Shrivastava N &<br /> <br /> Padh H, 2010, tr. 427-435). Sử dụ ng thực vạ̣ t như<br /> nhạ̀ mạ́ y sinh hộ c đẻ sạ̉ n xuạ́ t cạ́ c hợp chạ́ t cạ̀ n<br /> thié t chô côn người lạ̀ mộ t xu hướng phạ́ t triẻ n<br /> tiè m nặ ng củ ạ công nghẹ sinh hộ c. Cạ́ c hợp chạ́ t<br /> được sạ̉ n xuạ́ t trông thực vạ̣ t như prôtein tạ́ i tổ<br /> hợp, vạccine, cạ́ c hợp chạ́ t thứ cạ́ p, enzyme,<br /> hormone v.v... (Sharma AK & Sharma MK, 2009,<br /> tr. 811-832). Tuy nhien, hẹ thố ng biẻ u hiẹ n thực<br /> vạ̣ t có một nhược điểm lạ̀ mức độ biẻ u hiẹ n củ ạ<br /> Số 02 (03/2017)<br /> <br /> 26<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN<br /> <br /> gene thạ́ p, mức độ tích lũ y củ ạ sạ̉ n phạ̉ m đích thực vạ̣ t vạ̀ virus chô thạ́ y terminạtôr củ ạ thực<br /> không cao, do vạ̣ y cạ́ c nghien cứu hiẹ n nay phải vạ̣ t gồ m bạ yé u tố chính: Yé u tố ngược dồ ng xạ<br /> tạ̣ p chung làm tặ ng mức độ biẻ u hiẹ n củ ạ prôtein (FUEs-Fạr Upstreạm Element), yé u tố ngược<br /> tạ́ i tổ hợp (Streatfield SJ, 2007, tr. 2-15).<br /> dồ ng gạ̀ n (NUEs-Neạr Upstreạm Elements) vạ̀ vị<br /> Sự biẻ u hiẹ n củ ạ gene đích trông hẹ thố ng trí pôlyạdenyl hố ạ.<br /> thực vạ̣ t phụ thuộ c vạ̀ ô rất nhiè u yé u tố trông<br /> Trông bạ̀ i bạ́ ô nạ̀ y, chú ng tôi trình bạ̀ y ké t<br /> đố cố hai yếu tố quang trọng là promoter (gene quạ̉ nhạn dồ ng prômôter vạ̀ terminạtôr HSP từ<br /> khởi độ ng) vạ̀ terminạtôr (yé u tố ké t thú c). cạy Arabidopsis nhạ̀ m tạ̣ ô nguồ n nguyen liẹ u<br /> Prômôter lạ̀ mộ t trình tự nucleôtide phíạ đạ̀ u 5’ thié t ké cạ́ c vectôr tặ ng cường biẻ u hiẹ n<br /> củ ạ điẻ m khởi đạ̀ u phien mạ̃ , đố ng vại trồ then prôtein tạ́ i tổ hợp trông thực vạ̣ t.<br /> chố t trông viẹ c biẻ u hiẹ n gen đích, giú p xạ́ c định<br /> 2. Vật liệu và phương pháp<br /> vè thời giạn, vị trí vạ̀ mức độ biẻ u hiẹ n củ ạ gen<br /> Vật liệu<br /> đích (Desai PN & Shrivastava N & Padh H, 2010,<br /> Cạy Arabidopsis thaliana kiẻ u dạ̣ i (Côl 0),<br /> tr. 427 - 435). Prômôter cố cạ́ u trú c rạ́ t phức tạ̣ p<br /> vectôr<br /> nhạn dồ ng pBT, chủ ng vi khuạ̉ n nhạn<br /> vạ̀ chứạ nhiè u yé u tố đặ̣ c trưng thạm giạ điè u<br /> dồ<br /> ng<br /> E.côli<br /> DH5α, hố ạ chạ́ t, thié t bị sử dụ ng<br /> hồ ạ sự biẻ u hiẹ n gen ở mức phien mạ̃ (Lê Thị<br /> trông<br /> phạ<br /> n<br /> tích sinh hộ c phạn tử dô Phồ ng<br /> Thu Hiền & Trần Thị Phương Liên & Nông Văn<br /> Cô<br /> ng<br /> nghe<br /> ̣<br /> té<br /> bạ̀ ô thực vạ̣ t, Viẹ n Công nghẹ<br /> Hải, 2007, tr.1-18). Cạ́ c yé u tố cis quạn trộ ng<br /> nhạ́ t củ ạ prômôter gồ m hộ p TATA, GAGA vạ̀ Sinh hộ c, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ<br /> CCAAT đạ̉ m bạ̉ ô chô quạ́ trình phien mạ̃ diẽ n rạ Việt Nam cung cạ́ p.<br /> Phương pháp<br /> chuạ̉ n xạ́ c. Prômôter số c nhiẹ t HSP khởi độ ng<br /> phien mạ̃ củ a gene HSP ở cạy Arabidopsis, hôạ̣ t<br /> Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để phân lập<br /> độ ng củ ạ prômôter nạ̀ y được cạ̉ m ứng bởi nhiẹ t promoter và terminator HSP.<br /> độ . Theo nghiên cứu của các tác giả Lee KT và cs<br /> Sử dụ ng phạ̀ n mè m Biôedit (Hall TA, 1999,<br /> (2007, tr.1047 - 1053), Moriwaki M và cs (1999, tr. 95-98) vạ̀ cạ́ c trình tự nucleôtide tren ngạn<br /> tr.92 - 95) đạ̃ sử dụ ng prômôter nạ̀ y đẻ “nghiên hạ̀ ng gen quố c té NCBI đẻ thié t ké cặ̣ p mồ i đặ̣ c<br /> cứu phản ứng sốc nhiệt trên cây thuốc lá chuyển hiẹ u chô phạn đôạ̣ n gen quạn tạm. Đẻ thuạ̣ n lợi<br /> gen cho thấy hoạt động của gen β-glucuronidase cho viẹ c thié t ké vectôr chuyẻ n gen sạu nạ̀ y,<br /> được tăng cường khi cây gặp điều kiện sốc chú ng tôi gạ́ n them vị trí cạ́ t củ ạ enzym giới hạ̣ n<br /> nhiệt”. Sự biẻ u hiẹ n củ ạ gene đích cũ ng phụ HindIII tren mồ i xuôi vạ̀ BạmHI tren mồ i ngược<br /> thuộ c vạ̀ ô trình tự đạ̀ u 3’ không dịch mạ̃ vạ̀ ở đạ̀ u 5’ củ ạ cặ̣ p mồ i nhạn phạn đôạ̣ n prômôter<br /> terminator. Theo các tác giả Carswell S và cs HSP (pHSP). Tương tự, vị trí cạ́ t củ ạ enzym giới<br /> (1989, tr.4248 - 4258), Ingelbrecht IL và cs hạ̣ n SạcI vạ̀ EcôRI được gạ́ n vạ̀ ô mồ i xuôi vạ̀ mồ i<br /> (1989, tr.671 - 680) thì “các terminator khác ngược ở đạ̀ u 5’ củ ạ cặ̣ p mồ i nhạn phạn đôạ̣ n<br /> nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến mức độ biểu hiện terminạtôr HSP (tHSP) (Bạ̉ ng 1).<br /> của gene”. Cạ́ c thẻ độ t bié n gene củ ạ nhiè u lôạ̀ i<br /> Bảng 1. Trình tự nucleôtide dùng để thiết kế cặp mồi, trình tự nucleotide của cặp mồi và kích<br /> thước lý thuyết đôạn gene promoter và terminator HSP sẽ thu được<br /> Đoạn gene<br /> Promoter<br /> HSP<br /> <br /> Terminator<br /> HSP<br /> <br /> Kí hiệu<br /> pHSP_F<br /> pHSP_R<br /> tHSP_F<br /> tHSP_R<br /> <br /> Trình tự nucleotide sử<br /> dụng<br /> <br /> Trình tự cặp mồi đặc hiệu<br /> <br /> 5’aagcttATGGTCATTTCT<br /> CP002688.1, AB006705.2, TCTGGTTCAAG 3’<br /> X17295.1<br /> 5’cctaggTGTTCGTTGCTT<br /> TTCGGGGAGACT 3’<br /> 5’gagctcATATGAAGATG<br /> Theô trình tự củạ AAGATGAAA 3’<br /> Nagaya S et al (2009)<br /> 5’gaattcCTTATCTTTAAT<br /> CATATTCC 3’<br /> <br /> Kích thước<br /> gene (bp)<br /> 732 bp (*)<br /> <br /> 262 bp (*)<br /> <br /> (*). Kích thước bao gồm cả trình tự nucleotide của enzyme cắt giới hạn. Tách chiết và tinh sạch<br /> DNA tổng số từ lá Arabidopsis<br /> Số 02 (03/2017)<br /> <br /> 27<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN<br /> <br /> DNA genôme tạ́ ch từ cạ́ c mạ̃ u lạ́<br /> Arạbidôpsis theô phương phạ́ p CTAB. Xạ́ c<br /> định độ tinh sạ̣ ch vạ̀ nồ ng độ DNA tổ ng số<br /> bạ̀ ng mạ́ y Nạnôdrôp lite (Thermô scientific).<br /> Phân lập promoter và terminator HSP<br /> bằng kỹ thuật PCR<br /> Prômôter vạ̀ terminạtôr HSP đượ c phạn<br /> lạ̣ p từ DNA tổ ng số tạ́ ch từ lạ́ Arạbidôpsis<br /> bạ̀ ng kỹ thuạ̣ t PCR với cặ̣ p mồ i đặ̣ c hiẹ u.<br /> Thạ̀ nh phạ̀ n phạ̉ n ứ ng bạô gồ m: Mạster Mix<br /> 2X: 12,5μl, mồ i xuô i (50 ng/μl): 1μl; mồ i<br /> ngượ c (50ng/μl): 1μl, DNA (50ng/μl ): 1μl vạ̀<br /> nướ c deiôn vô trù ng: 9,5μl. Phạ̉ n ứ ng PCR<br /> đượ c thực hiẹ n tre n mạ́ y Veriti 96 well<br /> thermạl cycler (AB Applied Biôsystems,<br /> Thermô scientific) vớ i: 94 0C (3 phú t); 30 chu<br /> kỳ : 940C (30 giạ y), 540C (1 phú t), 720C (45<br /> giạy); 720C (10 phú t). Sạ̉ n phạ̉ m PCR đượ c<br /> kiẻ m trạ bạ̀ ng phương phạ́ p điẹ n di tre n gel<br /> agarose 0,8% (w/v).<br /> Nhân dòng và xác định trình tự<br /> nucleotide của promoter và terminator HSP<br /> Sạ̉ n phạ̉ m phạ̉ n ứ ng PCR được tinh sạ̣ ch<br /> bạ̀ ng bộ kit AccuPrep® Gel Purificạtiôn<br /> (Biôneer, Hạ̀ n Quố c). Sạu đố , prômôter vạ̀<br /> terminạtôr HSP đượ c ghé p nố i vạ̀ ô vectôr<br /> nhạ n dồ ng pBT. Vectôr nhạ n dồ ng pBT-pHSP<br /> hoặ̣ c pBT-tHSP được bié n nạ̣ p vạ̀ ô vi khuạ̉ n<br /> E. côli chủ ng DH5α bạ̀ ng phương phạ́ p số c<br /> nhiẹ t, sạu đố cạ́ y trạ̉ i tre n môi trường chộ n<br /> lộ c LB cố bổ sung khạ́ ng sinh cạrbenicillin<br /> 50mg/l, IPTG 100μM vạ̀ X-gal 40mg/l. Sạu đó<br /> nuôi quạ đêm ở 370C. Cạ́ c khuạ̉ n lạ̣ c số ng số t<br /> tre n mô i trườ ng chộ n lộ c đượ c nuô i lạ́ c<br /> trông 4ml mô i trườ ng LB lổ ng bổ sung khạ́ ng<br /> sinh quạ đe m ở 370C. Tạ́ ch chié t plạsmid<br /> bạ̀ ng bộ kit QIAprep Spin Miniprep vạ̀ kiẻ m<br /> trạ sự cố mặ̣ t củ ạ prômôter vạ̀ terminạtôr<br /> HSP trông vectôr bạ̀ ng phạ̉ n ứng cạ́ t enzym<br /> giới hạ̣ n. Trình tự nucleôtide củ ạ prômôter<br /> vạ̀ terminạtôr HSP được xạ́ c định bạ̀ ng mạ́ y<br /> giạ̉ i trình tự ABI PRISM® 3100 Avạnt<br /> Genetic Anạlyzer tạ̣ i phồ ng Thí nghiẹ m trộ ng<br /> điẻ m vạ̀ Cô ng nghẹ gene, Viẹ n Công nghẹ<br /> Sinh hộ c, Viẹ n Hạ̀ n lạ m Khoa học và Công<br /> nghệ Viẹ t Nam.<br /> <br /> Phân tích trình tự nucleotide<br /> promoter và terminator HSP<br /> <br /> của<br /> <br /> Phạ n tích mứ c độ tương đồ ng củ ạ<br /> prômôter vạ̀ terminạtôr HSP nhạ n dồ ng<br /> đượ c vớ i trình tự nucleôtide củ ạ prômôter<br /> vạ̀ terminạtôr HSP đạ̃ cô ng bố bạ̀ ng chương<br /> trình BLAST củ ạ NCBI, xạ́ c định vù ng tạ́ c<br /> độ ng cis (hộ p TATA, hộ p CAAT, hộ p GATA)<br /> củ ạ prômôter HSP thô ng quạ cơ sở dữ liẹ u<br /> phạ n tích chuye n dụ ng vè prômôter thự c vạ̣ t.<br /> 3. Kết quả và thảo luận<br /> Phân lập và nhân dòng promoter HSP từ<br /> Arabidopsis<br /> Ké t quạ̉ phạ n lạ̣ p prômôter HSP từ DNA<br /> cạy Arabidopsis bạ̀ ng kỹ thuạ̣ t PCR vạ̀ phạ̉ n<br /> ứ ng cạ́ t kiẻ m trạ sạ̉ n phạ̉ m plạsmid tạ́ i tổ<br /> hợ p mạng gene đượ c thẻ hiẹ n ở Hình 1A vạ̀<br /> Hình 1B. Phạ n tích chô thạ́ y, tre n Hình 1A<br /> xuạ́ t hiẹ n mộ t bặ ng đặ̣ c hiẹ u cố kích thướ c<br /> khôạ̉ ng 732 bp, tương đương vớ i kích thướ c<br /> lý thuyé t củ ạ phạ n đôạ̣ n prômôter HSP theô<br /> thié t ké lý thuyé t, tre n Hình 1B, cạ̉ đườ ng<br /> chạ̣ y số 1 vạ̀ 2 đè u gồ m 2 bặ ng rỗ né t, cố kích<br /> thướ c lạ̀ n lượ t lạ̀ 732 bp vạ̀ 2700 bp tương<br /> đương vớ i kích thướ c lý thuyé t củ ạ<br /> prômôter HSP vạ̀ vectôr tạ́ ch dồ ng pBT.<br /> <br /> Hình 1. (A) Ké t quạ̉ điẹ n di sạ̉ n phạ̉ m PCR<br /> phạn đôạ̣ n gen pHSP bạ̀ ng cặ̣ p mồ i đặ̣ c hiẹ u từ<br /> cạy Arabidopsis tren gel agarose 0,8% (w/v),<br /> (B) Ké t quạ̉ điện di sạ̉ n phạ̉ m cạ́ t bạ̀ ng enzym<br /> cạ́ t giới hạ̣ n đôạ̣ n pHSP từ vectôr nhạn dồ ng<br /> pBT tren gel agarose 0,8% (w/v), M: Thang<br /> DNA chuạ̉ n DNA chuạ̉ n 1 kb (Fermentạs).<br /> Số 02 (03/2017)<br /> <br /> 28<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN<br /> <br /> Phân lập và nhân dòng termiator HSP từ<br /> Arabidopsis<br /> <br /> So sánh trình tự nucleotide và phân tích<br /> các yếu tố cis đặc trưng của promoter HSP<br /> <br /> Ké t quạ̉ phạ n lạ̣ p terminạtôr HSP từ<br /> DNA cạ y Arabidopsis bạ̀ ng kỹ thuạ̣ t PCR vạ̀<br /> phạ̉ n ứ ng cạ́ t kiẻ m trạ sạ̉ n phạ̉ m plạsmid tạ́ i<br /> tổ hợ p mạng phạ n đôạ̣ n gene đượ c thẻ hiẹ n<br /> ở Hình 2A vạ̀ Hình 2B. Tre n Hình 2A, xuạ́ t<br /> hiẹ n mộ t bặ ng đặ̣ c hiẹ u cố kích thước<br /> khôạ̉ ng 262 bp, tương đương vớ i kích thướ c<br /> củ ạ terminạtôr HSP thié t ké lý thuyé t. Tre n<br /> Hình 2B, ở đườ ng chạ̣ y số 1, 2 đè u xuạ́ t hiẹ n<br /> hại bặ ng cố kích thướ c lạ̀ n lượ t lạ̀ 262bp vạ̀<br /> 2705bp, kích thướ c nạ̀ y tương ứ ng vớ i kích<br /> thướ c củ ạ terminạtôr HSP và kích thước củ ạ<br /> vectôr tạ́ ch dồ ng pBT.<br /> <br /> Ké t quạ̉ xạ́ c định trình tự nucleôtide chô<br /> thạ́ y, prômôter HSP được nhạn dồ ng từ<br /> Arạbidôpsis cố kích thước tương ứng 720 bp<br /> (không tính trình tự củ ạ enzym cạ́ t giới hạ̣ n lạ̀<br /> 12 nucleôtide), tương ứng với kích thước dự<br /> tính khi thié t ké mồ i. Ngôạ̀ i rạ, đạ̀ u 5’ vạ̀ 3’ củ ạ<br /> đôạ̣ n prômôter HSP đạ̃ phạn lạ̣ p cố mạng trình<br /> tự nhạ̣ n bié t củ ạ cặ̣ p enzyme HindIII (ạạgctt)<br /> vạ̀ BạmHI (ggạtcc). Sô sạ́ nh trình tự nucleôtide<br /> củ ạ prômôter HSP 18.2 với cạ́ c trình tự đạ̃<br /> được công bố với cạ́ c trình tự prômôter HSP<br /> tren ngạn hạ̀ ng gen quố c té bạ̀ ng công cụ<br /> BLAST, chú ng tôi thu được ké t quạ̉ trình bạ̀ y<br /> tren Bạ̉ ng 2.<br /> Bảng 2: Trình tự prômôter HSP<br /> <br /> Hình 2. (A) Kết quả điện di sản phẩm<br /> PCR phân đôạn gen tHSP 18.2 bằng cặp mồi<br /> đặc hiệu từ cây Arabidopsis trên gel agarose<br /> 0,8% (w/v), (B) Kết quả di sản phẩm cắt<br /> bằng enzym cắt giới hạn phân đôạn tHSP từ<br /> vector nhân dòng pBT trên gel agarose 0,8%<br /> (w/v), M: Thang DNA chuẩn 1kb<br /> (Fermentas).<br /> Từ cạ́ c ké t quạ̉ này, khạ̉ ng định chú ng<br /> tô i đạ̃ phạ n lạ̣ p vạ̀ nhạ n dồ ng thành công<br /> promoter HSP vạ̀ terminạtôr HSP từ cạ y<br /> Arabidopsis. Đẻ khạ̉ ng định chạ́ c chạ́ n<br /> prômôter vạ̀ terminạtôr nạ̀ y, chú ng tô i tié n<br /> hạ̀ nh sô sạ́ nh trình tự vạ̀ xạ́ c định cạ́ c yé u tố<br /> đặ̣ c trưng.<br /> <br /> Mã số<br /> <br /> Tên gene đã công<br /> bố<br /> <br /> Mức độ<br /> so sánh<br /> <br /> Mức độ<br /> tương<br /> đồng<br /> <br /> X1729<br /> 5.1<br /> <br /> Arabidopsis<br /> HSP18.2 gene for<br /> 18.2kDa heat shock<br /> protein<br /> <br /> 100%<br /> <br /> 100%<br /> <br /> AB006<br /> 705.2<br /> <br /> Arabidopsis thaliana<br /> genomic<br /> DNA,<br /> chromosome 5, P1<br /> clone: MTH12<br /> <br /> 100%<br /> <br /> 100%<br /> <br /> CP002<br /> 688.1<br /> <br /> Arabidopsis<br /> thaliana<br /> chromosome<br /> 5,<br /> complete sequence<br /> <br /> 100%<br /> <br /> 100%<br /> <br /> Qua bạ̉ ng 2 cố thẻ thạ́ y, trì nh tự<br /> prômôter HSP đượ c nhạ n dồ ng cố mứ c độ<br /> tương đồ ng nucleôtide vớ i trì nh tự<br /> prômôter HSP đạ̃ đượ c cô ng bố tre n ngạ n<br /> hạ̀ ng Gene. Tié p tụ c phạ n tích cạ́ c yé u tố<br /> điè u hồ ạ cis củ ạ prômôter HSP phạ n lạ̣ p<br /> đượ c bạ̀ ng cạ́ ch dù ng cơ sở dữ liẹ u phạ n<br /> tích chuye n dụ ng PLACE (Plạnt Cis-ạcting<br /> Regulạtôry DNA Elements). Ké t quạ̉ phạ n<br /> tích đượ c thẻ hiẹ n ở Hì nh 3.<br /> <br /> Số 02 (03/2017)<br /> <br /> 29<br /> <br /> TẠP CHÍ KHOA HỌC YERSIN<br /> <br /> Hình 3. Phân tích trình tự nucleotide promoter HSP từ Arabidopsis<br /> Phạn tích Hình 3 chô thạ́ y, prômôter HSP<br /> thu được cố mạng đạ̀ y đủ trình tự cis củ ạ mộ t<br /> prômôter điẻ n hình gồ m: Hộ p CAAT (vị trí<br /> 39→42), 2 hộ p GATA (vị trí 73→76 vạ̀<br /> 406→409) vạ̀ hộ p TATA (vị trí 643→649 bp).<br /> Tié p tụ c phạn tích, sô sạ́ nh trình tự prômôter<br /> HSP thu được với trình tự đạ̃ công bố tren<br /> Ngạn hạ̀ ng Gen Quố c té , đạ̃ xạ́ c định được<br /> prômôter HSP thu được cố đủ sạ́ u yé u tố cạ̉ m<br /> ứng với nhiẹ t độ (Heat shock elements: HSE):<br /> Từ vị trí 482→495, 492→505, 502→515,<br /> 549→562, 559→572 vạ̀ 600→613 (tương ứng<br /> với cạ́ c vị trí: -238→-225, -228→-215, -218→205, -171→-158, -161→-148 vạ̀ -120→-107<br /> theô chiè u 5’). Ké t quạ̉ nạ̀ y khạ̉ ng định trình tự<br /> prômôter HSP phạn lạ̣ p được chính lạ̀<br /> <br /> promoter HSP từ cạy Arabidopsis. Ngôạ̀ i rạ,<br /> đạ̀ u 5’ vạ̀ 3’ củ ạ đôạ̣ n prômôter HSP đạ̃ phạn<br /> lạ̣ p cố mạng trình tự nhạ̣ n bié t củ ạ cặ̣ p enzyme<br /> cắt giới hạn HindIII (ạạgctt) vạ̀ BạmHI (ggạtcc).<br /> So sánh trình tự nucleotide và phân tích<br /> các yếu tố đặc trưng của terminator HSP<br /> Ké t quạ̉ phạn tích trình tự nucleôtide củ ạ<br /> đôạ̣ n gene terminạtôr HSP chô thạ́ y đôạ̣ n gene<br /> nạ̀ y chứạ 250bp, cố độ tương đồ ng 100% với<br /> trình tự terminạtôr HSP đạ̃ công bố củ ạ Nạgạyạ<br /> S vạ̀ cs (2010, tr.328 - 532). Tren trình tự<br /> terminạtôr HSP nạ̀ y gồ m tôạ̀ n bộ đạ̀ u 3’UTR vạ̀<br /> pôly A site, vị trí củ ạ pôly A site lạ̀ từ<br /> nucleôdite 158 (Hình 4).<br /> <br /> Hình 4. Phân tích trình tự nucleotide terminator HSP từ Arabidopsis<br /> Số 02 (03/2017)<br /> <br /> 30<br /> <br />