Thiết kế vector mang gen OPHC2 phục vụ tạo cây chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu

Lê Văn Sơn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 90(02): 59 - 64<br /> <br /> THIẾT KẾ VECTOR MANG GEN OPHC2 PHỤC VỤ TẠO CÂY CHUYỂN GEN<br /> PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU<br /> Lê Văn Sơn1, Nguyễn Vũ Thanh Thanh2*, Nguyễn Mạnh Cƣờng2<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> Viện Công nghệ sinh học<br /> Trường Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Organophosphorus (OP) là một chất có nhiều trong các loại thuốc trừ sâu hiện đang đƣợc dùng rộng<br /> rãi trên thị trƣờng và nó gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng. Enzyme organophosphorus hydrolase<br /> (OPHC2) của một số loài vi khuẩn có khả năng phân hủy chất OP. Một số công trình nghiên cƣ́u đã sƣ̉<br /> dụng gen mã hóa enzyme OPHC2 để biến nạp, biểu hiện trong cây thuốc lá và tạo ra cây chuyển gen<br /> kháng đƣợc thuốc trừ sâu methyl parathion(Mep)-một loại OP. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày<br /> kết quả tối ƣu trình tự gen OPHC2 biểu hiện trong thực vật và thiết kế vector chuyển gen mang cấu<br /> trúc 35S-OPHC2opt-cmyc-KDEL-NOS (pBIN121/OPHC2). Vector này đã chuyển vào chủng vi<br /> khuẩn A. tumefaciens CV58 và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Đây là cơ sở để tạo cây<br /> chuyển gen mang gen OPHC2 để phân hủy thuốc trừ sâu Mep tồn dƣ trong môi trƣờng.<br /> Từ khóa: Agrobacterium, OPHC2, Organophosphorus hydrolase, vector chuyển gen.<br /> <br /> MỞ ĐẦU*<br /> Việc sử dụng tràn lan thuốc bảo vệ thực vật<br /> trong sản xuất nông nghiệp đang là một trong<br /> những nhân tố gây ô nhiễm môi trƣờng đất ở<br /> nhiều khu vực sản xuất nông nghiệp ảnh<br /> hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con<br /> ngƣời và cây trồng (Wauchope, 1978;<br /> Kawahigashi, 2009). Nhiều nghiên cứu đã<br /> cho thấy việc sử dụng cây trồng để loại bỏ các<br /> chất ô nhiễm từ môi trƣờng đất và nƣớc mang<br /> lại rất nhiều ƣu điểm so với các phƣơng pháp<br /> xử lý truyền thống. Các chất ô nhiễm thƣờng<br /> đƣợc hấp thụ vào cây thông qua rễ và lá và<br /> đƣợc chuyển hóa thành các chất không có hại<br /> và tích lũy trong mô của cây (Salt et al., 1998)<br /> hoặc cây trồng tiết ra các loại enzyme giúp<br /> phân hủy chất ô nhiễm trong môi trƣờng đất.<br /> Organophosphorus (OP) là một chất có trong<br /> thuốc trƣ̀ sâu hiện đang đƣợc dùng rộng rãi trên<br /> thị trƣờng nông nghiệp (Singh et al ., 2006;<br /> Karpouzas et al., 2006) và đang làm ô nhiễm<br /> môi trƣờn g nghiêm trọng (Kawahara et al .,<br /> 2005; Konstantinou et al., 2006; Pagliuca et al.,<br /> 2006; Bondarenko et al ., 2004; Qian et al .,<br /> 2006). Enzyme organophosphorus hydrolase<br /> (OPH) của một số loài vi khuẩn có khả năng<br /> phân hủy chất OP (Wu et al., 2004; Amaya*<br /> <br /> Tel: 0912 664 126; Email: thanhthanhdhkhtn@gmail.com<br /> <br /> Chavez et al., 2006). Đã có một số nghiên cƣ́u<br /> sƣ̉ dụng gen mã hóa enzyme OPH để biến nạp<br /> và biểu hiện trong cây thuốc lá . Kết quả phân<br /> tích cho thấy, cây thuốc lá chuyển gen đã sản<br /> xuất ra enzyme OPH trong môi trƣờng nuôi<br /> cấy. Cây chuyển gen kháng đƣợc thuốc trƣ̀ sâu<br /> methyl parathion (Mep)-một loại OP (Wang et<br /> al., 2008).<br /> Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả<br /> tổng hợp gen mã hóa enzyme OPHC2<br /> (OPHC2opt) đƣợc tối ƣu biểu hiện trong thực<br /> vật và thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc<br /> gen OPHC2opt. Đây là cơ sở cho tạo cây<br /> chuyển gen phân hủy thuốc trừ sâu Mep tồn dƣ<br /> trong môi trƣờng hiện nay.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Vật liệu<br /> Gen OPHC2 và mồi (primer) đặt từ hãng<br /> Epochlifescience (Mỹ) tổng hợp.<br /> Chủng E.coli DH5α, Agrobacterium CV58 và<br /> vector pBI121 do phòng Công nghệ tế bàoViện Công nghệ sinh học cung cấp.<br /> Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> Tách DNA, plasmid và tinh sạch đƣợc thực<br /> hiện dựa theo phƣơng pháp của Sambrook<br /> (1989) hoặc kít tách plasmid của QIAGEN<br /> Thu đoạn DNA mong muốn từ gel agarose<br /> với kít thôi gel QIAquick (QIAGEN).<br /> 59<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Lê Văn Sơn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Các phƣơng pháp trong sinh học phân tử nhƣ<br /> cắt bằng enzyme cắt giới hạn, ghép nối gen<br /> đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của<br /> Sambrook (2001).<br /> Biến nạp plasmid vào trong E.coli dựa theo<br /> phƣơng pháp biến nạp bằng sốc nhiệt (Cohen,<br /> 1972), vào Agrobacterium bằng phƣơng pháp<br /> xung điện.<br /> <br /> 90(02): 59 - 64<br /> <br /> Trình tự DNA đƣợc xác định trên máy đọc<br /> trình tự tự động ABI PRIMS® 3100 Avant<br /> Genetic Analyzer bằng cách sử dụng bộ hoá<br /> chất sinh chuẩn BigDye® Terminor v3.1<br /> Cycle Sequencing -Viện Công nghệ Sinh học.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Tối ƣu và tổng hợp gen OPHC2 biểu hiện<br /> trong thực vật:<br /> <br /> Hình 1. So sánh trình tự gen OPHC2 của P.pseudoalcaligenes (OPHC2) và OPHC2 đã sửa đổi<br /> (OPHC2opt)<br /> <br /> 60<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Lê Văn Sơn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 90(02): 59 - 64<br /> <br /> MAAPAQQKTQVPGYYRMALGDFEVTALYDGYVDLPASLLKGIDDKDLQSLLARMFVASEKGVQTAVNAYL<br /> INTGDNLVLI<br /> DTGAAQCFGPTLGVVQTNLKASGYQPEQVDTVLLTHLHPDHACGLVNADGSPAYPNATVEVPQAEAEFWLD<br /> EATMAKAPE<br /> GMQGMFKMAQQAVAPYAKMNKLKPYKTEGELLPGVSLVASPGHTPGHTSYLFKSGGQSLLVWGDILLNHA<br /> VQFAKPEVVF<br /> EFDVDSDQARQSRQRILAEAATDKLWVAGAHLPFPGLGHVRKEAQGYAWVPVEFSPIRSDR.<br /> <br /> Hình 2. Trình tự amino acid của protein OPHC2<br /> <br /> Mỗi amino acid đƣợc mã hóa bởi các bộ ba<br /> nucleotide khác nhau. Mức độ biểu hiện của<br /> mỗi bộ ba trong từng đối tƣợng, từng loài rất<br /> khác nhau. Cùng một amino acid, có những<br /> bộ ba biểu hiện trong vi khuẩn mức độ cao<br /> nhƣng trong thực vật lại biểu hiện ở mức độ<br /> thấp và ngƣợc lại (Kawabe và Miyashita,<br /> 2003; Streatfield, 2007). Do vậy, để biểu hiện<br /> protein cao trong cây trồng cần phải tối ƣu mã<br /> bộ ba phù hợp. Mức biểu hiện protein cao là<br /> vấn đề đƣợc nhiều công trình nghiên cứu, ứng<br /> dụng và cho kết quả tốt (Fennoy và cs, 1993;<br /> Laguía-Becher và cs, 2010; Jabeen và cs,<br /> 2010). Dựa vào trình tự của gen OPHC2 (kích<br /> thƣớc 906 bp) phân lập từ chủng<br /> Pseudomonas pseudoalcaligenes trên NCBI<br /> với mã số AJ605330, chúng tôi đã thiết kế<br /> mồi để nhân gen OPHC2, trình tự gen<br /> OPHC2 đƣợc sửa đổi để biểu hiện tối ƣu<br /> trong thực vật (hình 1).<br /> Amino acid của OPHC2 opt có kích thƣớc và<br /> trình tự không thay đổi với enzyme OPHC2<br /> của P.pseudoalcaligenes (hình 2).<br /> Trình tự gen bị thay đổi nhằm tăng khả năng<br /> biểu hiện trong cây trồng, song trình tự<br /> protein OPHC2 vẫn giữ nguyên nhƣ ban đầu,<br /> do vậy hoạt tính protein không thay đổi, tính<br /> chất phân hủy chất OP vẫn đƣợc giữ nguyên.<br /> Khi OPHC2opt biểu hiện trong hệ thống tế<br /> bào thực vật, để giúp cho protein đƣợc hoàn<br /> thiện cấu trúc, hoạt tính, chúng tôi bổ sung<br /> thêm một peptid tín hiệu KDEL và một đoạn<br /> nhận biết c-myc (hình 4).<br /> Để đảm bảo sự chính xác trình tự gen tối ƣu,<br /> OPHC2opt đã đƣợc tổng hợp nhân tạo bởi<br /> Công ty Epochlifescience (Mỹ). Cấu trúc này<br /> đã đƣợc ghép trong vector tách dòng<br /> pBluescript II SK(-).<br /> <br /> Sau khi nhận đƣợc pBluescript II SK(-)<br /> /OPHC2opt, chúng tôi đã tiến hành biến nạp<br /> và nhân trong E.coli, sau đó kiểm tra cắt thử<br /> vector bằng enzyme BamHI/SacI. Kết quả thu<br /> đƣợc có 2 đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1<br /> kb và 3 kb, tƣơng ứng với kích thƣớc của gen<br /> OPHC2opt và vector pBluescript II SK(-)<br /> (hình 3).<br /> <br /> Hình 3. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt<br /> pBluescript II SK(-)/OPHC2opt bằng BamHI/SacI<br /> <br /> M: thang DNA chuẩn 1 kb; 1-2: sản phẩm<br /> cắt vector pBluescriptIISK(-)/OPHC2opt<br /> Gen OPHC2opt cũng đã đƣợc kiểm tra lại<br /> trình tự, kết quả thu đƣợc giống với cấu trúc<br /> đã thiết kế, trình tự gen đã đƣợc tối ƣu mã bộ<br /> ba theo yêu cầu ban đầu. Đây là cơ sở cho<br /> thiết kế vector chuyển gen.<br /> Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã<br /> hóa cho OPHC2opt<br /> Để thiết kế vector chuyển gen, plasmid<br /> pBluescriptII SK(-)/OPHC2opt đƣợc cắt đồng<br /> thời bằng 2 enzyme BamHI/SacI. Cấu trúc<br /> OPHC2opt-cmyc-KDEL thu đƣợc có kích<br /> thƣớc khoảng 1,0 kb (hình 4). Đồng thời<br /> vector chuyển gen pBI121 có chứa promoter<br /> 35S cũng đƣợc cắt bởi 2 enzyme tƣơng ứng<br /> 61<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Lê Văn Sơn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> BamHI/SacI. Cấu trúc OPHC2opt-cmycKDEL và vector pBI121 mở vòng đƣợc thu<br /> lại và tinh sạch khỏi agarose. Sau đó 2 sản<br /> phẩm đƣợc ghép nối vào nhau bằng enzyme<br /> T4 ligase.<br /> <br /> Hình 4. Cấu trúc gen chuyển trong vector pBI121<br /> <br /> 90(02): 59 - 64<br /> <br /> KDEL và vector pBI121. Nhƣ vậy, cấu trúc<br /> OPHC2opt-cmyc-KDEL đã đƣợc thiết kế<br /> thành công vào vector chuyển gen pBI121.<br /> Tạo chủng Agrobacterium mang vector<br /> pBI121/OPHC2opt<br /> Vector pBI121/OPHC2opt đã đƣợc chuyển<br /> vào chủng Agrobacterium CV58 bàng<br /> phƣơng pháp xung điện và đƣợc chọn lọc trên<br /> môi trƣờng chứa kháng sinh Rifamicine và<br /> Kanamicine.<br /> <br /> Sản phẩm lai này đƣợc biến nạp vào E.coli<br /> DH5 và đƣợc chọn lọc dòng biến nạp bằng<br /> kháng sinh Kanamicine.<br /> Các dòng biến nạp đƣợc kiểm tra bằng cách<br /> tách chiết plasmid, sau đó PCR với cặp mồi<br /> đặc hiệu OPHC2-F/OPHC2-R và cắt bởi<br /> enzyme hạn chế BamHI/SacI (hình 3).<br /> <br /> Hình 6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ chủng<br /> Agrobacterium đã biến nạp pBI121/OPHC2opt<br /> <br /> M: thang DNA chuẩn 1 kb; +: đối chứng<br /> dương (plasmid pBI121/OPHC2opt); -: đối<br /> chứng âm (nước); 1-4: các dòng<br /> Agrobacterium biến nạp<br /> <br /> Hình 5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (A) và<br /> cắt vector tái tổ hợp pBI121/OPHC2opt (B)<br /> <br /> M: thang DNA chuẩn 1 kb;<br /> 1-2 (A): sản phẩm PCR nhân gen<br /> OPHC2opt với cặp mồi đặc hiệu<br /> 1-2 (B): sản phẩm cắt các dòng vector<br /> tái tổ hợp pBI121/OPHC2opt bằng enzyme<br /> giới hạn<br /> Hình 5 cho thấy sản phẩm PCR có kích thƣớc<br /> khoảng 1,0 kb tƣơng đƣơng với kích thƣớc<br /> cấu trúc gen OPHC2opt-cmyc-KDEL. Trên<br /> hình ảnh điện di cắt vector tái tổ hợp bằng<br /> enzyme giới hạn chúng tôi thu đƣợc có 2<br /> băng kích thƣớc khoảng 1,0 kb và 12 kb<br /> tƣơng ứng với cấu trúc OPHC2opt-cmyc-<br /> <br /> Các khuẩn lạc mang vector chuyển gen đƣợc<br /> kiểm tra bằng PCR bằng cặp mồi đặc hiệu<br /> OPHC2-F/OPHC2-R. Điện di sản phẩm PCR<br /> cho thấy, vi khuẩn Agrobacterium đã mang<br /> vector tái tổ hợp (hình 6). Kết quả này cho<br /> thấy, chúng tôi đã biến nạp thành công vector<br /> pBI121/OPHC2opt vào Agrobacterium.<br /> KẾT LUẬN<br /> Dựa trên trình tự gen mã hóa enzyme OPHC2<br /> của P.pseudoalcaligenes, chúng tôi đã tối ƣu<br /> mã biểu hiện trong thực vật và tổng hợp đƣợc<br /> gen OPHC2opt. Cấu trúc gen OPHC2optcmyc-KDEL đã đƣợc thiết kế vào vector<br /> chuyển gen pBI121. Đây là nguồn vật liệu để<br /> sử dụng chuyển gen vào thực vật, nhằm nâng<br /> cao khả năng phân hủy thuốc trừ sâu Mep gây<br /> ô nhiễm môi trƣờng.<br /> <br /> 62<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Lê Văn Sơn và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện trong<br /> khuôn khổ đề tài cấp Viện Công nghệ sinh<br /> học “Nghiên cứu phương pháp tạo cây xoan<br /> ta (Melia azedarach Lin) chuyển gen OPHC2<br /> nhằm ứng dụng trong xử lý ô nhiễm thuốc<br /> bảo vệ thực vật”. Các thí nghiệm được tiến<br /> hành có sử dụng trang thiết bị của Phòng Thí<br /> nghiệm trọng điểm về công nghệ gen, Viện<br /> Công nghệ sinh học.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Amaya-Chavez A, Martınez-Tabche L,<br /> Lopez-Lopez E, Galar-Martınez M (2006) Methyl<br /> parathion toxicity to and removal efficiency<br /> byTypha latifolia in water and artificial sediments,<br /> Chemosphere 63: 1124–1129.<br /> [2]. Bondarenko S, Gan J, Haver DL, Kabashima<br /> JN<br /> (2004)<br /> Persistence<br /> of<br /> selected<br /> organophosphate and carbamate insecticides in<br /> waters from a coastal watershed, Environ. Toxicol.<br /> Chem. 23: 2649–2654.<br /> [3]. Do Xuan Dong, Bui Van Thang, Ho Van<br /> Giang, Nong Van Hai, Chu Hoang Ha (2008) An<br /> efficient protocol for plant regeneration of persian<br /> lilac tree (Melia azedarach L.) via somatic<br /> embryogenesis<br /> induction.<br /> Journal<br /> of<br /> Biotechnology 6(2): 1-6.<br /> [4]. Fennoy SL,Julia Bailey-Serres (1993)<br /> Synonymous codon usage in Zea mays L. nuclear<br /> genes is varied by levels of C and G-ending<br /> codons. Nucleic Acid Res 21(23): 5294-5300<br /> [5]. Jabeen R, Khan M, Zafar Y, Anjum T (2010)<br /> Codon optimization of cry1Ab gene for hyper<br /> expression in plant organelles. Mol Biol Rep<br /> 37:1011–1017<br /> [6]. Karpouzas DG, Singh BK (2006) Microbial<br /> degradation of organophosphorus xenobiotics:<br /> metabolic pathways and molecular basis,<br /> Adv.Microb. Physiol. 51: 119–185.<br /> [7]. Kawabe A, Miyashita NT (2003) Patterns of<br /> codon usage bias in three dicot and four monocot<br /> plant species. Genes Genet Syst 78: 343-352<br /> [8]. Kawahara J, Horikoshi R, Yamaguchi T,<br /> Kumagai K, Yanagisawa Y (2005) Air pollution<br /> and young children’s inhalation exposure to<br /> organophosphorus pesticide in an agricultural<br /> <br /> 90(02): 59 - 64<br /> <br /> community in Japan, Environ. Int. 31: 1123–1132.<br /> [9]. Konstantinou IK, Hela DG,<br /> Albanis TA<br /> (2006) The status of pesticide pollution in surface<br /> waters (rivers and lakes) of Greece. Part I. Review<br /> on occurrence and levels, Environ. Pollut. 141:<br /> 555–570.<br /> [10]. Laguía-Becher M, Valentina M, Mauricio<br /> K, Corigliano M, Yacono ML, Goldman A,<br /> Clemente M (2010) Effect of codon optimization<br /> and subcellular targeting on Toxoplasma gondii<br /> antigen SAG1 expression in tobacco leaves to use<br /> in subcutaneous and oral immunization in mice.<br /> BMC Biotechnology 10:52<br /> [11]. Pagliuca G, Serraino A, Gazzotti T, Zironi<br /> E,<br /> Borsari<br /> A,<br /> Rosmini<br /> R<br /> (2006)<br /> Organophosphorus pesticides residues in Italian<br /> raw milk, J. Dairy Res. 73: 340–344.<br /> [12]. Qian L, He Y, Hu Y (2006) Determination<br /> of organophosphorus pesticide residues in<br /> vegetables by electrokinetic sequential injection<br /> analysis, Spectrosc. Lett. 39: 581–592.<br /> [13]. Salt DE, Blaylock M, Kumar NP,<br /> Dushenkov V, Ensley BD, Chet I, Raskin I (1995)<br /> Phytoremediation: a novel strategy for the removal<br /> of toxic metals from the environment using plants.<br /> Biotechnology (N Y). 13:468-474.<br /> [14]. Salt DE, Smith RD, Raskin I (1998)<br /> Phytoremediation. Annu Rev Plant Physiol Plant<br /> Mol Biol. 49:643-668.<br /> [15]. Singh BK,<br /> Walker A (2006) Microbial<br /> degradation of organophosphorus compounds,<br /> FEMS Microbiol. Rev. 30: 428–471.<br /> [16]. Streatfield SJ (2007) Approaches to achieve<br /> high-level heterologous protein production in<br /> plants. Plant Biotechnol J 5:2-15.<br /> [17]. Wang X, Wu N, Guo J, Chu X, Tian J, Yao<br /> B, Fan Y (2008) Phytodegradation of<br /> organophosphorus compounds by transgenic<br /> plants expressing a bacterial organophosphorus<br /> hydrolase. BBRC 365: 453–458.<br /> [18]. Wauchope RD (1978) The pesticide content<br /> of surface water draining from agricultural fields A review. J Environ Qual. 7:459-465.<br /> [19]. Wu NF, Deng MJ, Chu XY, Liang GY, Yao<br /> Y, Fan YL (2004) Isolation, purification and<br /> characterization of a new organophos-phorus<br /> hydrolase OPHC2, Chin. Sci. Bull. 49: 268–272.<br /> <br /> 63<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br />