Thiết lập quy trình realtime PCR nhằm phát hiện kiểu gen HLA-B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp tại Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

4
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Viêm cột sống dính khớp (Ankylosing Spondylitis, AS) là tình trạng bệnh lý viêm tại các vị trí đốt sống và dính lại với nhau khiến các khớp xương kém linh động, lâu ngày các đốt sống này dính lại với nhau khiến tư thế đứng gập về phía trước. bài viết tập trung nghiên cứu quy trình multiplex realtime SYBR Green PCR phát hiện kiểu gen HLA-B27 giúp chẩn đoán bệnh lí viêm cột sống dính khớp.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thiết lập quy trình realtime PCR nhằm phát hiện kiểu gen HLA-B27 bệnh nhân viêm cột sống dính khớp tại Việt Nam

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học THIẾT LẬP QUY TRÌNH REALTIME PCR NHẰM PHÁT HIỆN KIỂU GEN HLA-B27 BỆNH NHÂN VIÊM CỘT SỐNG DÍNH KHỚP TẠI VIỆT NAM Lương Bắc An*, Lê Thái Khương*, Đỗ Thị Thanh Thủy*. TÓM TẮT Mở đầu: Viêm cột sống dính khớp (Ankylosing Spondylitis, AS) là tình trạng bệnh lý viêm tại các vị trí đốt sống và dính lại với nhau khiến các khớp xương kém linh động, lâu ngày các đốt sống này dính lại với nhau khiến tư thế đứng gập về phía trước. Bệnh do nhiều yếu tố tác động, như tuổi tác, giới tính và yếu tố di truyền. Tuy chỉ có 5% dân số mang kiểu gen HLA-B27, nhưng có đến 95% bệnh nhân AS có mang kiểu gen dương tính HLA- B27. Do đó, dấu ấn HLA-B27 có thể xem là dấu ấn di truyền cho bệnh lý AS. Nhiều giả thuyết về cơ chế gây bệnh AS, những biến đổi tại các vị trí nucleotide trên gen kháng nguyên bạch cầu người (HLA) quy định kiểu gen HLA-B27 được xem là tác động chính tới cơ chế gây bệnh. Hiện nay, viêm cột sống dính khớp chưa có thuốc điều trị đặc hiệu. Phương pháp điều trị chủ yếu là giảm đau và kháng viêm giúp giảm các triệu chứng bệnh lý. Để tăng khả năng điều trị hiệu quả cho bệnh nhân thì việc xác định được nguyên nhân gây bệnh là yếu tố quan trọng nhất. Vì vậy, đối với bệnh nhân xuất hiện triệu chứng nghi ngờ bệnh lý AS thì việc phát hiện kiểu gen HLA-B27 sẽ là một phương pháp giúp chẩn đoán bệnh sớm để có hướng phòng ngừa và điều trị kịp thời. Mục tiêu: Nghiên cứu quy trình multiplex realtime SYBR Green PCR phát hiện kiểu gen HLA-B27 giúp chẩn đoán bệnh lí viêm cột sống dính khớp. Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Thiết kế cặp mồi và thiết lập điều kiện phản ứng multiplex realtime PCR SYBR Green phát hiện kiểu gen HLA-B27. Giá trị của phương pháp được so sánh với bộ kít PG27 (Pharmigene, Đài Loan) trên 10 mẫu DNA dương và 10 mẫu DNA âm tính với kiểu gen HLA-B27. Kết quả: Thiết kế cặp mồi và thiết lập được điều kiện phản ứng multiplex realtime PCR SYBR Green phát hiện kiểu gen HLA-B27. Dựa vào 20 mẫu DNA, kết quả kiểu gen HLA-B27 xác định bằng phương pháp multiplex realtime PCR SYBR Green và bộ kít thương mại PG27 (Pharmigene, Đài Loan) có sự tương đồng là 100%. Kết luận: Nghiên cứu thiết lập được quy trình multiplex realtime PCR SYBR Green xác định kiểu gen HLA-B27. Phương pháp cho kết quả tương đồng với bộ kít thương mại của nước ngoài. Nghiên cứu được quy trình có nhiều ý nghĩa thực tiễn như hạn chế phụ thuộc vào các bộ kít nước ngoài, giảm giá thành xét nghiệm, đáp ứng được nhu cầu làm xét nghiệm di truyền sinh học phân tử tại Việt Nam hiện nay. Từ khóa: HLA-B27, multiplex realtime SYBR Green PCR, Ankylosing Spondylitis. ABTRACTS. IDENTIFICATION OF HLA-B27 GENOTYPE IN VIETNAMESE ANKYLOSING SPONDYLITIS PATENTS BY USING REALTIME PCR. Luong Bac An, Le Thai Khuong, Do Thi Thanh Thuy * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 22 - No 2- 2018: 64 - 72 Introduction: Ankylosing spondylitis (AS) is an inflammatory condition in the vertebrae that make the joints less flexible, these vertebrae later stick together making the standing posture bent forward. There are many factors such as age, gender, and genetic factors that affect this disease. Although the prevalence of HLA-B27 in * Trung tâm Y Sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: CN. Lương Bắc An ĐT: 0933.908.241 Email: luongbacan1991@gmail.com 65
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 worldwide population is 5%, HLA-B27 appears in 95% of patients with ankylosing spondylitis. Thus, the HLA- B27 genotype may be a genetic marker for AS. Many theories have indicated the mechanism of AS, in which the nucleotide changes in the human leukocyte antigen (HLA) gene such as predominantly HLA-B27, to be the main causative agent for AS. At present, the joint spondylosis has no specific drug treatment. The main treatments are pain relief and anti-inflammatory which help reduce the pathological symptoms. The important thing is that determine the main cause of disease, so as improve effective treatment. Hence, identification of HLA-B27genotype of patients with suspected AS disease symptoms can be concluded early and has the essential therapies. Objective: To study the multiplex real-time SYBR Green PCR approach for detecting the HLA-B27 genotype in DNA obtained from patients with Ankylosing spondylitis. Methods: A cross-sectional descriptive study that used the DNA samples that is suspected to AS disease submitted to the Center for Molecular Biology for genotyping HLA-B27. Results of the method were compared with the commercial available PG27 kit (Pharm gene, Taiwan) on 10 positive and 10 negative DNA samples for the HLA-B27 gene. Results: Successfully designed primers and optimized the approach to screen HLA-B27 using multiplex real-time SYBR Green PCR. HLA-B27 genotyping results showed 100% with those obtained from the PG27 kit (Pharmigene, Taiwan). Conclusion: The successful optimization of the HLA-B27 genotype detection approach by real-time multiplex SYBR Green PCR enables it to be utilized in routine clinical practice effectively, limits dependence on using foreign detection kits, reduces the cost of testing, and meets the needs for molecular biology testing in Vietnam. Key words: HLA-B27, multiplex real-time SYBR Green PCR, AS. ĐẶT VẤN ĐỀ tính HLA-B27(7). Đặt ra giả thuyết là kiểu gen HLA-B27 có liên quan chặt chẽ với bệnh AS. Viêm cột sống dính khớp là tình trạng Trạng thái alen đồng hợp hay dị hợp của HLA- bệnh lý viêm tại các vị trí đốt sống và dính lại B27 gây ra mức độ nặng nhẹ của bệnh lý vẫn với nhau khiến các khớp xương kém linh còn nhiều tranh cãi. Nghiên cứu của Jaakkola động, lâu ngày các đốt sống này dính lại với trên dân số Phần Lan đưa ra một kết luận: nhau khiến tư thế đứng gập về phía trước. bệnh nhân mang kiểu gen HLA-B27 đồng hợp Ngoài ra, xương lồng ngực bị ảnh hưởng cũng có nguy cơ bị viêm cột sống dính khớp thể nhẹ gây khó khăn trong quá trình hô hấp. Bệnh lý hơn so với người mang kiểu gen dị hợp. Đồng viêm cột sống dính khớp thường ảnh hưởng ở thời, dân số mang kiểu gen HLA-B27 có khả nam nhiều hơn ở nữ theo tỉ lệ 2:1(2). Hiện nay, năng khởi phát bệnh AS sớm hơn những bệnh lý viêm cột sống dính khớp chưa có người không mang kiểu gen HLA-B27. Tuy thuốc điều trị đặc hiệu. Phương pháp điều trị nhiên, cơ chế gây bệnh của alen HLA-B27 vẫn chủ yếu là giảm đau và kháng viêm giúp giảm chưa rõ ràng. Ngoài ra, vấn đề chẩn đoán bệnh các triệu chứng bệnh lý, phục hồi chức năng hệ lý AS gặp nhiều khó khăn do giai đoạn sớm xương khớp. Viêm cột sống dính khớp có rất bệnh thường không biểu hiện triệu chứng lâm nhiều dạng, phụ thuộc vào giới tính, độ tuổi, sàng rõ ràng. Các triệu chứng biểu hiện rõ khi chủng tộc. Các biến thể nucleotide trên gen bệnh đã tiến triển đến giai đoạn nặng; do đó, kháng nguyên bạch cầu người (HLA), trong đó gây khó khăn trong quá trình điều trị và phục chủ yếu là HLA-B27, được xem là tác động hồi chức năng của hệ xương khớp, ảnh hưởng chính tới cơ chế gây bệnh AS. Tuy chỉ có 5% đời sống sinh hoạt của bệnh nhân. Chính vì dân số mang kiểu gen HLA-B27, nhưng có đến vậy, xét nghiệm phát hiện kiểu gen HLA-B27 95% bệnh nhân AS có mang kiểu gen dương 66
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học có thể giúp bác sĩ có thêm thông tin kết luận phát hiện kiểu gen HLA-B27 sử dụng thuốc bệnh viêm cột sống dính khớp mà không phải nhuộm SYBR Green. Tuy nhiên, giá thành cho các bệnh lí viêm khác; với đối tượng bệnh các bộ kít này khá cao, chưa phù hợp với điều nhân nghi ngờ viêm cột sống dính khớp có thể kiện kinh tế hiện nay tại Việt Nam. Do đó, chúng kiểm tra kiểu gen HLA-B27 để kịp thời đưa ra tôi thiết lập một quy trình phát hiện kiểu gen phương pháp điều trị, tránh tình trạng bệnh lý HLA-B27 bằng phản ứng realtime PCR sử dụng chuyển biến nặng, gây ra các biến chứng thuốc nhuộm SYBR Green. Việc phát triển bộ kít nghiêm trọng. mới sẽ giúp giảm giá thành xét nghiệm cũng HLA-B27 nằm trên nhiễm sắc thể 6 và có như chủ động hơn trong việc chuẩn bị kit để làm hơn 105 subtypes khác nhau và đang ngày xét nghiệm. Chính vì vậy, chúng tôi thiết lập quy càng được khám phá thêm(3). Trong đó, trình realtime PCR nhằm phát hiện kiểu gen subtype B2702 đến B2705 là có liên hệ tới bệnh HLA-B27 ở bệnh nhân viêm cột sống dính khớp lí AS. Phần lớn các subtype HLA-B27 chỉ khác tại Việt Nam. nhau tại một vài vị trí amino acid. Kiểu gen ĐỐITƯỢNG- PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU. HLA-B27 phân bố phụ thuộc vào chủng tộc Thiết kế nghiên cứu người trên thế giới. Theo ghi nhận ở bệnh nhân AS, kiểu gen B2705 có ở người Da trắng Mô tả cắt ngang. (86%-90%) trong khi đó kiểu gen B2704 hầu Phương pháp nghiên cứu như không xuất hiện. Ngược lại, ở người châu Đối tượng nghiên cứu Á thì kiểu gen B2704 lại chiếm phần lớn bệnh Nghiên cứu này được thực hiện trên mẫu nhân AS (62%-94%) và kiểu gen B2705 hầu DNA của bệnh nhân được chẩn đoán nghi ngờ như rất ít (2-6%)(4). Kiểu gen B2706 và B2709 chủ yếu thấy ở người bình thường và không viêm cột sống dính khớp. Kết quả kiểu gen HLA- liên quan tới AS(4). B27 các mẫu DNA được phát hiện bằng bằng bộ Có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử nhằm kít PG 27 Detection kit (Pharmigen, Đài Loan); xác định kiểu gen HLA-B27. Thông thường, kiểu bộ kít được thương mại hoá trên thế giới và có gen HLA-B27 có thể phát hiện bằng phương chứng nhận áp dụng trong chẩn đoán. Chúng pháp giải trình tự vùng gen exon 2 và 3 của gen tôi chọn ra 10 mẫu DNA âm tính HLA-B27 và 10 HLAB, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi mẫu dương tính HLA-B27. Nghiên cứu thực hiện nhiều thao tác, đắt tiền, không thích hợp làm xét tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y nghiệm nhanh. Phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho kiểu gen HLA-B27 có thể phát Dược Thành phố. Hồ Chí Minh. Mẫu DNA được hiện nhanh kết quả, nhưng sản phẩm PCR cần bảo quản tại -30oC. được tiến hành điện di trên gel agarose để đọc Thiết kế mồi kết quả, do đó nguy cơ ngoại nhiễm tăng và đòi Mồi được thiết kế nhận diện vị trí xác định hỏi nhiều bước thí nghiệm. Ngoài ra, một số kiểu gen HLA-B27 trên vùng exon 2 và 3 của phương pháp cho phép đọc kết quả trực tiếp từ quá trình phản ứng (realtime PCR) như sử dụng gen HLA-B. Các vị trí này được rất nhiều bài các đoạn do Taqman probe giúp xác định hiệu báo trên thế giới sử dụng để thiết kế phản ứng quả kiểu gen HLA-B27; tuy nhiên, giá thành cho nhận diện kiểu gen HLA-B27 . Gen chứng (10,11) đoạn dò cao. Thuốc nhuộm SYBR Green là một nội được chúng tôi sử dụng là gen G6PD giải pháp thay thế hiệu quả cho các đoạn do (NG_009015). Phản ứng multiplex PCR gồm 2 probe, giá thành cũng tương đối hợp lý. Hiện cặp mồi: cặp mồi gen chứng nội G6PD và cặp trên thế giới cũng có nhiều hãng sản xuất kit mồi nhận diện kiểu gen HLA-B27. Tên và trình 67
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 tự các cặp mồi được liệt kê chi tiết trong bảng 1. Bảng 1. Trình tự mồi phát hiện kiểu gen HLA-B27 và gen chứng nội. STT mồi Tên mồi Trình tự (5’-3’) Kích thước PCR (bp) 1 B27a GTGGGCTACGTGGACGACACGCT 150 2 B27b GTCAGTCTGTGCCTTGGCCTTGC 3 AN-G6PD-F CATCTTCCACCAGCAGTGCAAGC 178 4 AN-G6PD-R CCACACTGCTCCTTCTCTGTAGG Phản ứng multiplex PCR bước này. Nhiệt độ melting curve: 98oC trong Thành phần của phản ứng multiplex PCR 15 giây, nhiệt độ từ 65oC trong 15 giây sau tăng gồm cặp mồi phát hiện kiểu gen HLA-B27 và cặp dần lên 98oC trong vòng 20 phút. Cuối cùng là mồi chứng nội. Phản ứng PCR với tổng thể tích bước 98oC trong 15 giây. 15µl gồm các thành phần (bảng 2). Bảng 3. Thành phần phản ứng multiplex realtime Bảng 2. Thành phần phản ứng multiplex PCR SYBR Green PCR Thể tích Nồng độ Thể tích Nồng độ Thành phần Thành phần (µl) phản ứng (µl) phản ứng SYBR Green 2X 7,5 1X 10X buffer PCR 1.5 1X Primer B27a (10µM) 0,2 133 nM dNTPs 250nm 1.2 20 nM Primer B27b (10µM) 0,2 133 nM Primer B27a (10µM) 0,375 250 nM Primer AN-G6PD-F (10µM) 0,4 267 nM Primer B27b (10µM) 0,375 250 nM Primer AN-G6PD-R (10µM) 0,4 267 nM Primer AN-G6PD-F (10µM) 0,75 500 nM DNA 1,5 50-100 ng Primer AN-G6PD-R (10µM) 0,75 500 nM H2O 4,8 Vừa đủ 15ul Taq Takara HS 0,1 DNA 1,5 50-100 ng KẾT QUẢ H2O 8,45 Vừa đủ 15 µl Kết quả thiết kế mồi Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực Cặp mồi được chúng tôi thiết kế bằng phần hiện trên máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, mềm CLC Main Workbench 5.5; vị trí Đức). Chu kì nhiệt: khởi đầu tại 98oC trong 3 nucleotide thay đổi quy định kiểu gen HLA- phút; tiếp theo với 40 chu kì lặp lại các bước B27. Cặp mồi của chúng tôi được thiết kế và 98oC: 10 giây, nhiệt độ lai tương ứng là: 58, 60, và chỉnh sửa một số vị trí nucleotide quy định 62oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây; tiếp theo kiểu gen HLA-B27, đặc biệt là tại vị trí với bước nhiệt 72oC trong 3 phút. Sản phẩm c.167A>T tương ứng với đầu 3’ của mồi xuôi được giữ ở 4oC sau khi chương trình PCR kết B27a và vị trí c.272A>G tương ứng với vị trí thúc. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên đầu 3’ của mồi ngược B27b; kích thước khuếch thạch agarose 2% có thuốc nhuộm GelRed và đại là 150bp. Do có sự khác biệt về nucleotide quan sát với hệ thống chụp ảnh điện di GelDoc- tại đầu 3’ của mỗi mồi nên khi mẫu DNA ItTM (UVP, Mỹ). không thuộc kiểu gen HLA-B27 thì sẽ không Qui trình multiplex realtime SYBR Green PCR xuất hiện sản phẩm PCR. Các vị trí nucleotide Thành phần của phản ứng được thực hiện trên cũng được nhiều công bố trên thế giới sử trong bảng 3. Chu trình luân nhiệt và đọc tín dụng là điểm thiết kế mồi phát hiện kiểu gen hiệu huỳnh quang được thực hiện trong hệ này(10,11). Ngoài ra, để nâng cao độ tin cậy của thống máy Mastercycler epgradients realplex phản ứng PCR, chúng tôi thiết kế thêm cặp (Eppendorf, Đức). Chu kì nhiệt: khởi đầu tại mồi AN-G6PD-F/R làm chứng nội chạy trong 95oC trong 1 phút; tiếp theo với 35 chu kì lặp cùng 1 phản ứng; kích thước khuếch đại là lại các bước: 95oC trong 15 giây, 60oC trong 30 178bp. giây, ghi nhận tín hiệu huỳnh quang ngay sau 68
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Kết quả multiplex PCR HLA-B27. Kết quả từ hình 1 cho thấy, tại giếng Phản ứng multiplex PCR đồng thời cặp mồi chứng âm (giếng 5) không xuất hiện sản phẩm, phát hiện kiểu gen HLA-B27 và cặp mồi cho gen phản ứng PCR không bị nhiễm. G6PD làm chứng nội trên mẫu DNA dương tính L12345 300 200 75 Hình 1. Kết quả điện di multiplex PCR Giếng L: thang chuẩn; giếng 1: nhiệt độ lai 58oC; giếng 2: nhiệt độ lai 60oC; giếng 3: nhiệt độ lai 62oC; giếng 4: mẫu DNA âm HLA-B27; giếng 5: mẫu âm H2O. o o 87,1 C 88,8 C 69
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Hình 2. Điểm chảy mẫu DNA dương tính HLA-B27 Hình 3. Điểm chảy mẫu DNA âm tính HLA-B27 Các giếng 1,2 và 3 lần lượt đại diện cho các hưởng lẫn nhau và ảnh hưởng tới kết quả PCR. mức nhiệt độ lai là 58, 60 và 62oC với mẫu DNA Hiệu chỉnh nồng độ mồi dựa vào độ sáng của dương tính với HLA-B27. Kết quả hình điện di vạch điện di và 2 vạch sản phẩm phải có độ đậm cho thấy, tại nhiệt độ 58oC (giếng 1) và 60oC nhạt tương đương nhau. Tránh trường hợp (giếng 2) đều xuất hiện đồng thời 2 vạch gồm chiều hướng phản ứng nghiêng về khuếch đại chứng nội (kích thước 178bp) và alen HLA-B27 gen chứng nội, làm ức chế phản ứng của cặp mồi (kích thước 150 bp) đúng với kích thước quan phát hiện kiểu gen HLA-B27, xuất hiện âm tính tâm. Còn tại nhiệt độ 62oC (giếng 3), chỉ xuất giả. Sau nhiều kết quả điều chỉnh nồng độ mồi hiện duy nhất vạch gen chứng nội. Nhiệt độ lai (không trình bày dữ liệu) chúng tôi đưa ra được 60oC (giếng 2) cho sản phẩm thể hiện vạch sáng nồng độ cặp mồi AN-G6PD-F/R cao hơn 2 lần rõ và đều giữa 2 vạch; do đó, nhiệt độ lai này là nồng độ cặp mồi B27a/b là thích hợp nhất (bảng điều kiện thích hợp nhất cho phản ứng 2). multiplex PCR. Chúng tôi lựa chọn nhiệt độ lai Kết quả realtime PCR 60oC cho mẫu DNA không mang kiểu gen HLA- Phản ứng multiplex realtime PCR sử dụng B27 (giếng 4); kết quả là chỉ xuất hiện duy nhất SYBR Green là thuốc nhuộm, kết quả realtime vạch gen chứng nội. Chứng tỏ, cặp mồi được PCR phải phân tích thông qua đường cong nóng chúng tôi thiết kế đã hoạt động hiệu quả, có khả chảy của sản phẩm khuếch đại (melting curve). năng nhận diện được chính xác kiểu gen HLA- Về nguyên tắc, nhiệt độ điểm chảy phụ thuộc B27. vào chiều dài sản phẩm khuếch đại và thành Ngoài ra, nồng độ mồi tham gia trong phản phần % GC trong chuỗi trình tự được khuếch ứng đóng vai trò quan trọng. Nồng độ mồi giữa đại. gen chứng nội G6PD và alen HLA-B27 có thể ảnh 70
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Phân tích biểu đồ đường cong nóng chảy cho thành phần %GC trong trình tự khuếch đại là thấy, đối với phản ứng sử dụng DNA dương 65,3%; tương đương với điểm nóng chảy là tính HLA-B27 (hình 2), cặp mồi B27a/b cho sản 88,8oC. phẩm khuếch đại có kích thước là 150 bp và Hình 4. Các mẫu DNA dương tính HLA-B27 71
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 87,1oC Hình 5. Các mẫu DNA âm tính HLA-B27 Cặp mồi AN-G6PD-F/R cho sản phẩm chứng nội. Kết luận, cặp mồi chứng nội hoạt khuếch đại có kích thước là 178 bp và thành động tốt, cặp mồi B27a/b không bắt nhầm vào vị phần %GC trong trình tự khuếch đại là 58,4%; trí khác trong bộ gen người và phân biệt được tương đương có điểm nóng chạy tại 87,1oC. Kết chính xác kiểu gen HLA-B27. quả phân tích đường cong chảy xuất hiện 2 đỉnh Khi thực hiện chạy đồng thời 10 mẫu DNA sóng tương ứng với 2 điểm nhiệt độ tương ứng. được xác định kiểu gen HLA-B27 dương tính Tuy 2 điểm nóng chảy gần nhau (chênh lệch bằng bộ kít PG27 (Pharmigene, Đài Loan), kết khoảng 2oC), kết quả hình đường cong chảy vẫn quả phân tích đường cong nóng chảy cho kết cho 2 đỉnh sóng rõ ràng. Do chiến lược thiết kế quả gồm nhiều đỉnh sóng khác nhau chồng lên mồi chưa thật chặt chẽ, các cặp mồi chứng nội và nhau tại nhiệt độ 88,8oC và 87,1oC (hình 4). alen B27 được thiết kế cho kích thước sản phẩm Ngược lại, 10 mẫu DNA âm tính về kiểu gen khuếch đại gần bằng nhau (150 bp và 178 bp) HLA-B27 thì các đỉnh sóng sẽ hội tụ tại một đỉnh dẫn tới kết quả 2 điểm nóng chảy gần nhau, gây duy nhất tại nhiệt độ 87,1oC (hình 5). Do đó, kiểu khó khăn trong phân tích kết quả. Trong những gen HLA-B27 được xác định bằng phương pháp nghiên cứu tiếp theo, cần chú ý vấn đề chiều dài multiplex realtime PCR SYBR Green và bộ kít đoạn khuếch đại để các đỉnh sóng tách biệt nhau PG27 (Pharmigene, Đài Loan) cho kết quả tương rõ hơn. Kết luận, cặp mồi chứng nội và alen đồng 100%. HLA-B27 đồng thời hoạt động tốt. BÀN LUẬN Tương tự, đối với mẫu sử dụng DNA âm Phản ứng realtime PCR của chúng tôi thiết tính với kiểu gen HLA-B27 (hình 3). Kết quả chỉ kế dưới dạng multiplex kết hợp mồi chứng nội xuất hiện duy nhất 1 đỉnh chảy duy nhất tại và mồi phát hiện kiểu gen HLA-B27, điều đó 87,1oC ứng với sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi giúp tránh trường hợp âm tính giả do thao tác 72
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học kỹ thuật hoặc chất lượng hoá chất sử dụng trong chỉ gồm 2 chuỗi nặng của HLA-B27 mà không có phản ứng, tiết kiệm được chi phí hoá chất. sự tham gia của ß2M. Cấu trúc homodimer của Kháng nguyên bạch cầu người (HLA)-B27 là HLA-B27 bám vào các thụ thể đặc biệt trên tế phân tử phức hợp phù hợp mô chính lớp 1 bào NK, tế bào lympho T. Quá trình trình diện (MHC-I) được mã hoá trên NST6p. Kháng này cho thấy homodimer HLA-B27 đóng vai trò nguyên này tồn tại trong nhiều loại tế bào và như một kháng nguyên gây ra bệnh tự miễn(5).. biểu hiện mạnh ở các tế bào trình diện kháng Giả thuyết HLA-B27 gấp cuộn sai, cho thấy nguyên. Sau khi được dịch mã và gấp cuộn tạo bệnh lí AS xuất phát từ sự tích luỹ các peptide cấu trúc bậc 3, chuỗi nặng của HLA-B27 hình HLA-B27 gấp cuộn bất thường trong mạng lưới thành phức hợp heterotrimeric với ß2 nội chất (ER), gây ra các phản ứng viêm(6). microglobulin (ß2m) và các chuỗi peptide nội Bệnh lý AS còn ghi nhận do các tác nhân bào có nguồn gốc từ các protein tự thân hoặc từ khác là vi khuẩn hoặc vi rút gây ra như: vi rút hoặc vi khuẩn. Với cấu trúc này giúp tế Salmonella, Shiella và Cladimydia. Do cấu trúc của bào có thể trình diện các kháng nguyên ngoại lai. HLA-B27 bị bất thường dẫn tới hoạt động trình Mối quan hệ giữa kiểu gen HLA-B27 với diện kháng nguyên không hiệu quả cho tế bào T. viêm cột sống dính khớp được mô tả lần đầu Vì vậy, các tác nhân không được các tế bào T tiêu tiên vào năm 1973 về alen HLA và bệnh lí viêm diệt triệt để, từ đó kích hoạt phản ứng viêm nhiễm(8). Tuy nhiên, cơ chế gây bệnh vẫn chưa khớp(12). Tuy nhiên, cơ chế của phản ứng trên được giải thích rõ ràng. Nhiều bằng chứng chỉ vẫn chưa được hiệu rõ. ra rằng sự khác nhau giữa các subtype HLA- Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế mồi B27 ảnh hưởng khác nhau tới bệnh AS. phát hiện kiểu gen HLA-B27 dựa trên sự khác Khoảng hơn 105 kiểu subtype HLA-B27 được biệt về các vị trí nucleotide thay đổi dẫn tới thay báo cáo và con số này vẫn tiếp tục gia tăng. đổi về amino acid trong chuỗi peptide. Cụ thể là Hầu hết các subtype chỉ khác biệt ở một vài trên chuỗi trình tự kiểu gen HLA-B2704, đây là amino acid, nhưng lại thay đổi rất lớn khả một kiểu gen HLA-B27 rất phổ biến đối với dân năng bám lên phân tử peptides, dẫn tới thay cư ở khu vực Trung Quốc và Đông Nam Á(4, 3). đổi chức năng của thụ thể HLA. Những kiểu Ngoài ra, vị trí nucleotide cũng được nhiều công gen phổ biến nhất có liên quan tới bệnh AS là bố trên thế giới dựa vào để thiết kế mồi cho mục HLA-B2705, B2704, B2702 và B2707, trong khi đích phát hiện kiểu gen HLA-B27(10,11). Tối ưu hoá đó kiểu gen B2706 và B2709 rất phổ biến tại thành công được quy trình realtime PCR phát Nam Á lại không có liên hệ với bệnh AS(1). hiện kiểu gen HLA-B27 góp phần nâng cao tiền Có rất nhiều giả thuyết về vai trò của kiểu gen đề chăm sóc sức khoẻ cho bệnh nhân, hạn chế HLA-B27 trong cơ chế phân tử gây bệnh AS. phụ thuộc vào các bộ kít nước ngoài, giảm giá Trong đó, giả thuyết trình diện peptides tự thân thành sản phẩm, đáp ứng được nhu cầu làm xét gây viêm khớp, các đoạn peptides HLA-B27 được nghiệm di truyền sinh học phân tử tại Việt Nam trình diện với tế bào T-CD8+ do cấu hình gấp hiện nay. cuộn của HLA-B27 giống với cấu trúc peptide từ KẾT LUẬN vi khuẩn, điều này không xảy ra với các phân tử Chúng tôi đã thiết kế cặp mồi phát hiện HLA khác. Các tế bào T sẽ gây chết tế bào, hình đúng kiểu gen HLA-B27 và cặp mồi gen chứng thành nên tình trạng viêm mạn tính(9). nội G6PD. Chúng tôi thiết lập được điều kiện Giả thuyết về cấu trúc homodimer HLA-B27 phản ứng multiplex realtime PCR SYBR Green trình diện trên bề mặt tế bào cho rằng 2 chuỗi nhằm phát hiện kiểu gen HLA-B27. Sự tương nặng của HLA-B27 đồng thời trình diện trên bề đồng về xác định kiểu gen HLA-B27 giữa mặt tế bào. Sự hình thành cấu trúc homodimer 73
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 2 * 2018 phương pháp multiplex realtime PCR SYBR 7. Reveille JD and Arnett FC (2005). Spondyloarthritis: update on pathogenesis and management. Am J Med, 118(6), 592–603. Green và bộ kít PG27 (Pharmigene, Đài Loan) 8. Schlosstein L, Terasaki PI, Bluestone R, et al (1973). High là 100%. association of an HL-A antigen, W27, with ankylosing spondylitis. N Engl J Med, 288(14), 704–706. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 9. Smith JA, Märker-Hermann E, and Colbert RA (2006). 1. Ball EJ and Khan MA (2001). HLA-B27 polymorphism. Joint Pathogenesis of ankylosing spondylitis: current concepts. Best Bone Spine, 68(5), 378–382. Pract Res Clin Rheumatol, 20(3), 571–591. 2. Feldtkeller E, Khan M, Van Der Heijde D, et al (2003). Age at 10. Sylvain K, Aurélie H, Marc M, et al (2004). Rapid screening for disease onset and diagnosis delay in HLA-B27 negative vs. HLA-B27 by a TaqMan-PCR assay using sequence-specific positive patients with ankylosing spondylitis. Rheumatol Int, primers and a minor groove binder probe, a novel type of 23(2), 61–66 TaqManTM probe. J Immunol Methods, 287(1), 179–186. 3. Khan MA (2013). Polymorphism of HLA-B27: 105 subtypes 11. Vanvi D, Raja P and Trivedi S (2012). Optimization of In- currently known. Curr Rheumatol Rep, 15(10), 362. House PCR-SSP Technique for HLA B27 detection in 4. Khan MA, Mathieu A, Sorrentino R, et al (2007). The saurashtra patients. International Journal of Modern Engineering pathogenetic role of HLA-B27 and its subtypes. Autoimmun Research (IJMER), 2(3), 996-1000. Rev, 6(3), 183–189. 12. Virtala M, Kirveskari J and Granfors K (1997). HLA-B27 5. Kollnberger S, Bird L, Sun M.-Y, et al (2002). Cell-surface modulates the survival of Salmonella enteritidis in transfected expression and immune receptor recognition of HLA–B27 L cells, possibly by impaired nitric oxide production. Infect homodimers. Arthritis Rheumatol, 46(11), 2972–2982. Immun, 65(10), 4236–4242. 6. Mear JP, Schreiber KL, Münz C, et al (1999). Misfolding of HLA-B27 as a result of its B pocket suggests a novel Ngày nhận bài báo: 13/11/2017 mechanism for its role in susceptibility to Ngày phản biện nhận xét bài báo: 14/11/2017 spondyloarthropathies. J Immunol, 163(12), 6665–6670. Ngày bài báo được đăng: 10/03/2018 74