Thu nhận kháng thể IgY có ái lực cao với độc tố vi nấm fumonisin sử dụng trong chẩn đoán miễn dịch

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016<br /> <br /> THU NHẬN KHÁNG THỂ IgY CÓ ÁI LỰC CAO VỚI ĐỘC TỐ<br /> VI NẤM FUMONISIN SỬ DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH<br /> Đỗ Như Bình*; Trần Thị Huyền Trang**<br /> Tạ Mai Trang**; Lê Quang Hòa**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: tạo kháng thể có ái lực cao với fumonisin B1 và B2 (FB1 và FB2), làm nguyên liệu<br /> khởi đầu cho phương pháp miễn dịch phát hiện nhanh các độc tố trên. Vật liệu và phương pháp:<br /> độc tố FB1 được gắn với Keyhole limpet hemocyanin (KLH) tạo thành phức hợp FB1-KLH để gây<br /> miễn dịch cho gà mái. Kháng thể IgY tạo ra được tách chiết, tinh sạch và kiểm tra độ đặc hiệu với<br /> FB1 và FB2 thông qua phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp. Kết quả: thời điểm thu trứng tốt nhất<br /> từ 9 - 14 ngày sau lần tiêm cuối cùng và quy trình tinh sạch cho chế phẩm IgY có độ tinh sạch<br /> cao. Giá trị IC50 của FB1 và FB2 đối với chế phẩm IgY trong phản ứng ELISA cạnh tranh xác định<br /> được lần lượt là 10 và 49 ng/ml. Kết luận: chế phẩm IgY được tạo ra trong nghiên cứu có khả<br /> năng sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất bộ kit nhanh phát hiện nhanh FB.<br /> * Từ khoá: Fumonisin; Kháng thể lòng đỏ trứng (IgY); ELISA.<br /> <br /> Obtaining High Affinity IgY Against Fumonisin with Potential Use<br /> in Immunodiagnostic<br /> Summary<br /> Objectives: To produce high affinity antibody against fumonisin (FB) FB1 and FB2, that can be<br /> used as materials for some immunologic methods in detection of toxin. Materials and methods: FB1Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate was made to generate immunogenicity in hen. Yolk<br /> immunoglobulin (IgY) antibody was purified by extraction and tested the specificity against FB1, FB2<br /> by indirect competitive ELISA. Results: The best time for egg collection was 9 - 14 days after the last<br /> immunisation and the extraction protocol obtains high purity IgY antibody. The IC50 value of IgY<br /> against FB1 and FB2 in the indirect competitive ELISA were 10 and 49 ng/ml, respectively.<br /> Conclusion: IgY can be used as materials for developing rapid test kit to detect FB.<br /> * Key words: Fumonisin; Yolk immunoglobulin (IgY); ELISA.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Độc tố fumonisin nhóm B (FB), thường<br /> tồn tại trong ngô cũng như các thực phẩm<br /> có nguồn gốc từ ngô, được sản sinh từ<br /> chủng nấm Fusarium moniliforme [1].<br /> Trong đó, FB1 và FB2 được coi là hai độc<br /> <br /> tố phổ biến, có độc tính cao nhất trong<br /> nhóm fumonisin, gây nhiều bệnh ở người<br /> và động vật như chứng nhũn não ở ngựa,<br /> chứng phù phổi ở lợn, có độc tính đối với<br /> gan thận ở nhiều loài khác và ung thư<br /> thực quản ở người [5, 7].<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Như Bình (binhvef2006@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/04/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/05/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 27/05/2016<br /> <br /> 29<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016<br /> <br /> Hiện nay, phương pháp chuẩn để phát<br /> hiện và định lượng FB1, FB2 trong các<br /> mẫu thực phẩm đều dựa trên kỹ thuật sắc<br /> ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương<br /> pháp này yêu cầu cao về thiết bị cũng<br /> như trình độ kỹ thuật viên, do vậy không<br /> thích hợp với các phép phân tích sàng lọc<br /> tại hiện trường. Gần đây, nhờ ứng dụng<br /> kỹ thuật sắc ký miễn dịch dưới dạng que<br /> thử với hợp phần quan trọng nhất trong<br /> que thử phát hiện FB là kháng thể [4] việc<br /> phát hiện độc tố vi nấm nói chung và FB<br /> nói riêng đã được đơn giản hóa. Mục tiêu<br /> của nghiên cứu: Sản xuất kháng thể IgY<br /> kháng FB1 bằng cách gây đáp ứng miễn<br /> dịch ở gà. IgY được vận chuyển qua lòng<br /> đỏ trứng, do vậy có thể tinh sạch với số<br /> lượng lớn từ trứng gà bằng phương pháp<br /> kết tủa đơn giản, chi phí thấp [2, 3].<br /> <br /> các cầu nối glutaraldehyde dư chưa gắn<br /> được với FB1 sẽ cho tác dụng với 6,5 mg<br /> L-lysine (Sigma) với điều kiện có khuấy<br /> trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau quá<br /> trình thẩm tích loại FB1 tự do, sản phẩm<br /> cuối cùng tạo ra là cộng hợp KLH-FB1.<br /> Cộng hợp BSA-FB1 được chế tạo để làm<br /> đối chứng dương cho quy trình.<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> 02 gà mái đang thời kỳ đẻ trứng được<br /> tiêm gây đáp ứng miễn dịch với liều<br /> 0,2 mg cộng hợp KLH-FB1 trong tổng thể<br /> tích 1 ml chứa 50% tá chất FCA (Freund’s<br /> complete adjuvant) ở ngày đầu tiên. Sau<br /> 10 ngày (ngày thứ 10), tiêm nhắc lại gà<br /> lần thứ nhất với liều 0,1 mg cộng hợp<br /> KLH-FB1 trong tổng thể tích 1 ml chứa<br /> 50% tá chất FIA (Freund’s incomplete<br /> adjuvant). 10 ngày tiếp theo (ngày thứ<br /> 20), tiêm nhắc lại gà lần thứ hai với liều<br /> lượng tương tự như lần tiêm nhắc lại thứ<br /> nhất. Trứng gà không tiêm cũng như<br /> trứng gà tiêm KLH-FB1 ở các thời điểm<br /> sau khi tiêm thu lại để tinh sạch kháng thể<br /> IgY nhằm kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA.<br /> <br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> Gà siêu trứng Ai Cập, số lượng 03 con<br /> do Trang trại Gà giống Thụy Phương<br /> (Long Biên, Hà Nội) cung cấp. Hóa chất<br /> sử dụng gồm: độc tố FB1 (Santa Cruz<br /> Biotechnology), FB2 (Sigma), kháng thể<br /> chuột đơn dòng kháng FB1 (Biotez), các<br /> cộng hợp phát hiện gắn HRP kháng KLH<br /> (Gallus Immunotech) và kháng IgY (Santa<br /> Cruz Biotechnology) cùng những hóa<br /> chất khác (Hãng Thermo Scientific, Sigma<br /> và Promega).<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Chế tạo cộng hợp KLH-FB1 và BSAFB1:<br /> Để tạo liên kết giữa FB1 với KLH,<br /> chúng tôi sử dụng glutaraldehyde để nối<br /> gốc -NH2 của KLH và FB1. Cuối cùng,<br /> 30<br /> <br /> * Kiểm tra hiệu quả tạo cộng hợp KLHFB1:<br /> Cộng hợp KLH-FB1 được đặc tính hóa<br /> thông qua kỹ thuật ELISA kẹp đôi. Đo các<br /> giá trị mật độ quang (OD) ở bước sóng<br /> 450 nm và 630 nm bằng máy đọc khay vi<br /> thể (Synergy HT, BioTek). Hiệu số của<br /> các giá trị OD450nm và OD630nm thể hiện<br /> lượng cộng hợp KLH-FB1 có trong mẫu.<br /> * Tiêm cộng hợp gây miễn dịch trên gà<br /> mái:<br /> <br /> * Tinh sạch IgY từ trứng gà:<br /> Tách kháng thể IgY trong trứng gà thu<br /> được ở các thời điểm tiêm khác nhau<br /> theo phương pháp kết tủa PEG (Polson<br /> và CS, 1985) [6]. Sau đó, hòa tan kết tủa<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016<br /> <br /> thu được trong 3 ml PBS và đổi đệm<br /> bằng cột 100 kDa (Ultracell, Millipore) với<br /> PBS để thu nhận chế phẩm IgY tinh sạch,<br /> định lượng bằng cách đo OD ở bước<br /> sóng 280 nm và kiểm tra độ tinh sạch<br /> bằng điện di SDS-PAGE (12%).<br /> * Xác định thời điểm thu trứng có hiệu<br /> giá kháng thể IgY cao nhất với FB1:<br /> Tiến hành kỹ thuật ELISA gián tiếp để<br /> tìm ra thời điểm thu trứng cho hiệu giá<br /> kháng thể IgY cao nhất với FB1. Cường<br /> độ màu càng mạnh, lượng IgY kháng FB1<br /> có trong mẫu càng nhiều.<br /> * Xác định khả năng phản ứng của chế<br /> phẩm IgY với FB1 và FB2:<br /> <br /> Hình 1: Hiệu quả phản ứng của cộng hợp<br /> KLH-FB1 với kháng thể đơn dòng chuột<br /> kháng FB1.<br /> (Giá trị OD được tính bằng hiệu số<br /> OD450nm và OD630nm, biểu diễn bằng giá trị<br /> trung bình ± độ lệch chuẩn)<br /> <br /> Xác định khả năng phản ứng của chế<br /> phẩm IgY với FB1 và FB2 bằng kỹ thuật<br /> ELISA cạnh tranh. Cho ủ lượng IgY lần<br /> lượt với 0, 1, 10, 100 và 1.000 ng FB1<br /> hoặc FB2 trong 30 phút ở 37oC trước khi<br /> cho vào giếng. Để đánh giá khả năng<br /> phản ứng của chế phẩm IgY thu nhận<br /> được với FB1 và FB2, tiến hành xác định<br /> các giá trị IC50 của FB1 và FB2 (nồng độ<br /> FB1 và FB2 ức chế 50% phản ứng của<br /> IgY với BSA-FB1 trong ELISA cạnh<br /> tranh). Tính giá trị này theo hàm hồi quy<br /> logistic dựa trên mối liên quan giữa giá trị<br /> log của lượng FB1 và FB2 với giá trị OD.<br /> <br /> Khi lượng cộng hợp KLH-FB1 đạt<br /> 1 ng/giếng, tương ứng với nồng độ 10<br /> ng/ml, giá trị OD thu được bắt đầu có sự<br /> sai khác có ý nghĩa so với mẫu kiểm<br /> chứng. Kết quả này phù hợp với nghiên<br /> cứu về hiệu quả cộng hợp của FB1 với<br /> protein mang đã được công bố với lượng<br /> cộng hợp cho kết quả dương tính trong<br /> phép thử ELISA nằm trong khoảng từ 1 300 ng/giếng [7, 8]. Từ đây, có thể nhận<br /> thấy đã tạo thành công cộng hợp KLHFB1 và có thể sử dụng cộng hợp này để<br /> gây đáp ứng miễn dịch cho gà.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> 2. Đánh giá độ tinh sạch của kháng<br /> thể IgY bằng SDS-PAGE.<br /> <br /> 1. Đặc tính hóa cộng hợp KLH-FB1<br /> bằng ELISA kẹp đôi.<br /> Cộng hợp KLH-FB1 chế tạo trong<br /> nghiên cứu này trước khi tiêm gây miễn<br /> dịch trên gà được kiểm tra hoạt tính bằng<br /> phản ứng với kháng thể đơn dòng kháng<br /> FB1.<br /> <br /> Sau quá trình tinh sạch bằng phương<br /> pháp kết tủa với PEG và siêu lọc với cột<br /> 100 kDa, lượng IgY thu được từ một quả<br /> trứng đạt 40 - 50 mg (căn cứ theo kết quả<br /> đo OD ở bước sóng 280 nm, không trình<br /> bày trong bài báo). Đánh giá độ tinh sạch<br /> của các chế phẩm IgY bằng phương<br /> pháp điện di biến tính SDS-PAGE.<br /> 31<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016<br /> <br /> Hình 2: Điện di SDS-PAGE (12%) kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể IgY sau các<br /> bước của quy trình tinh sạch.<br /> (M: Marker protein Gangnam Stain; 1: 10 µg kháng thể IgY sau khi kết tủa với PEG;<br /> 2,3,4: 3, 10, 30 µg kháng thể IgY sau siêu lọc với cột 100 kDa).<br /> Ngoài các băng ở vị trí 65 kDa, tương<br /> ứng với tiểu phần lớn của IgY và 25 kDa,<br /> tương ứng với tiểu phần nhỏ của IgY, chế<br /> phẩm IgY sau khi kết tủa với PEG vẫn<br /> chứa hai protein tạp có kích thước<br /> khoảng 40 và 45 kDa. Tuy nhiên, sau khi<br /> siêu lọc qua cột 100 kDa, loại bỏ hoàn<br /> toàn được protein tạp nhiễm này. Ngay<br /> cả khi điện di 30 µg chế phẩm IgY cũng<br /> không quan sát được các băng nhiễm tạp<br /> này. Như vậy, quy trình tinh sạch kết hợp<br /> kỹ thuật siêu lọc và kết tủa với PEG cho<br /> <br /> phép tạo ra chế phẩm IgY có độ tinh sạch<br /> cao.<br /> 3. Lựa chọn thời điểm thu trứng cho<br /> hiệu giá kháng thể cao nhất.<br /> IgY từ trứng gà không tiêm, trứng gà<br /> tiêm PBS và tá chất FCA/FIA, cũng như<br /> trứng gà thu ở các thời điểm khác nhau<br /> sau khi tiêm cộng hợp gây đáp ứng miễn<br /> dịch đã được tinh sạch và kiểm tra khả<br /> năng phản ứng cộng hợp BSA-FB1 thông<br /> qua kỹ thuật ELISA gián tiếp.<br /> <br /> Hình 3: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY.<br /> 32<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016<br /> <br /> Kết quả thử nghiệm cho thấy IgY thu<br /> được từ trứng gà không tiêm cũng như<br /> trứng gà tiêm PBS và tá chất FCA/FIA<br /> không phản ứng với BSA-FB1. Chứng tỏ<br /> trước khi tiêm cộng hợp, gà không có đáp<br /> ứng miễn dịch với FB1, cũng như PBS và<br /> các thành phần tá dược không gây đáp<br /> ứng miễn dịch trên gà tạo IgY có phản<br /> ứng với FB1. Trong khi đó, gà được tiêm<br /> cộng hợp KLH-FB1, kể từ ngày thứ 23<br /> sau tiêm, trong trứng bắt đầu tạo IgY có<br /> phản ứng với FB1. Hiệu giá kháng thể đối<br /> với FB1 đạt mức cao nhất trong khoảng<br /> 29 - 34 ngày sau tiêm, hay 9 - 14 ngày<br /> sau lần tiêm cuối cùng. Như vậy, với quy<br /> trình gây đáp ứng miễn dịch gồm 3 lần<br /> tiêm, khoảng cách giữa các lần tiêm 10<br /> ngày, lượng cộng hợp KLH-FB1 sử dụng<br /> <br /> A<br /> <br /> là 0,2 và 0,1 mg, hiệu giá kháng thể đạt<br /> cao nhất ở thời điểm 9 - 14 ngày sau lần<br /> tiêm cuối, phù hợp với nghiên cứu của<br /> Schade và CS [7] ít nhất cần phải có 2 lần<br /> tiêm kháng nguyên để gây tính đáp ứng<br /> miễn dịch trên gà, kháng thể tinh sạch từ<br /> lòng đỏ trứng, nên kiểm tra 14 ngày sau<br /> lần tiêm cuối cùng xem còn tính đáp ứng<br /> miễn dịch hay không?.<br /> 4. Xác định khả năng phản ứng của<br /> chế phẩm IgY với FB1 và FB2.<br /> Để đánh giá khả năng phản ứng của<br /> chế phẩm IgY thu nhận được với FB1 và<br /> FB2, chúng tôi tiến hành xác định các giá<br /> trị IC50 của FB1 và FB2 (nồng độ FB1 và<br /> FB2 ức chế 50% phản ứng của IgY với<br /> BSA-FB1 trong ELISA cạnh tranh).<br /> <br /> B<br /> Hình 4: Khả năng phản ứng của IgY với FB1 và FB2.<br /> A. IgY và FB1<br /> B. IgY và FB2<br /> <br /> Ngay ở nồng độ thử nghiệm nhỏ nhất<br /> (10 ng/ml) (tương ứng với lượng độc tố<br /> FB1 và FB2 đưa vào giếng 1 ng), các giá<br /> trị OD thu được giảm mạnh so với mẫu<br /> kiểm chứng. Khi nồng độ FB1 và FB2 đạt<br /> mức 1 µg/ml, giá trị OD hầu như không<br /> giảm nữa, mặc dù nồng độ tăng lên đến<br /> 10 µg/ml. Giá trị IC50 của FB1 xác định<br /> <br /> được là 10 ng/ml, trong khi đó IC50 của<br /> FB2 là 49 ng/ml.<br /> So với nghiên cứu của Marcel và CS<br /> [5], các giá trị IC50 của FB1 với 14 dòng<br /> kháng thể chuột đơn dòng nằm trong<br /> khoảng 300 - 670 ng/ml. Như vậy, có thể<br /> nhận thấy ái lực của chế phẩm IgY tạo ra<br /> trong nghiên cứu này cao hơn nhiều lần<br /> 33<br /> <br />