THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÂY TRỒNG

Chia sẻ: Hoang Thuy | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

136
lượt xem 21
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chuyển gen bar kháng thuốc diệt cỏ glufosinate trên cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Các giống đậu xanh được sử dụng trong thí nghiệm là giống TN 182 của Công ty TNHH-TM Trang Nông, giống HL 89-E3 của Công ty cổ phần giống cây trồng Nha Hố.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÂY TRỒNG

1 I H C NÔNG LÂM TP. H CHÍ MINH VI N CÔNG NGH SINH H C & MÔI TRƯ NG TH C HÀNH CÔNG NGH SINH H C CÂY TR NG THÁNG 12/2007 Lưu hành n i b
2 N I DUNG TH C HÀNH Chuy n gen bar kháng thu c di t c glufosinate trên cây u xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) b ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens - Các gi ng u xanh ư c s d ng trong thí nghi m là gi ng TN 182 c a Công ty TNHH-TM Trang Nông, gi ng HL 89-E3 c a Công ty c ph n gi ng cây tr ng Nha H. - Vi khu n Agrobacterium tumefaciens ch ng EHA101pIB-GUS do Hans-Jörg Jacobsen thi t k , mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc, plasmid này mang gen gusA, gen nptII và gen bar v i promoter là CaMV 35S và terminator là nos poly–A. Hình 1. Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc
3 PH N 1. KH TRÙNG H T, CHU N B MÔI TRƯ NG I. V t l i u a. Kh trùng h t - M u h t. - D ng c c y mô: pince, dao c y, èn c n. Hóa ch t kh trùng: C n 70o, c n 96 o, Javel, kháng sinh Tetracilin. - - Nư c c t ti t trùng b. Chu n b môi trư ng * Môi trư ng ti n nuôi c y (pre-culture medium): t o i u ki n cho mô thích nghi v i môi trư ng nuôi c y. * Môi trư ng (inoculation medium): môi trư ng t o i u ki n cho vi khu n xâm nh p vào mô th c v t. * Môi trư ng ng nuôi c y (co-culture medium): môi trư ng thu n l i cho s phát tri n c a mô và vi khu n. II. Cách ti n hành a. Kh trùng h t theo quy trình sau ây - R a h t b ng nư c ti t trùng 3 l n (m i l n 5 phút). - R a h t b ng c n 960 3 l n, (m i l n 5 phút). - R a b ng nư c ti t trùng 1 l n. - R a b ng nư c javel m c 3 l n, (m i l n 10 phút). - R a b ng nư c c t ti t trùng 1 l n. - R a h t b ng kháng sinh 500mg/l Tetraciclin trong 5 phút. - R a b ng nư c ti t trùng 1 l n. - Ngâm h t b ng nư c ti t trùng trong 1 gi . - Ngâm h t qua êm. b. Chu n b môi trư ng • Môi trư ng ti n nuôi c y (pre-culture medium) Môi trư ng B5 (l ng) + 1 mg/l BA Thành ph n môi trư ng B5 Thành ph n N ng (g/l)
4 KNO3 25 (NH4)2SO4 1.34 CaCl2.2H2O 1.5 MgSO4.7H2O 2.5 NaH2PO4.H2O 1.5 MnSO4*H2O 1 H3BO3 0.3 ZnSO4*7H2O 0.2 NaMoO4*2H2O 0.025 CuSO4*5H2O 0.0025 CoCl2*6H2O 0.0025 * Môi trư ng (inoculation medium): B5, 20g/l glucose, 2 g/l MES, pH 5.5 - 5.6. * Môi trư ng ng nuôi c y (co-culture medium) - B5 - 2 g/l MES (Morpholino – ethan – sulfonic acid) - 0.5 g/l KNO3 - 0.87 g/l CaCl2 - 0.5 g/l MgCl2 * 7H2O - 0.8 g/l glutamine - 10 mg/l gluthatione - 2.2 mg/l TDZ (Thidiazuron) - 10 g/l sucrose - 10 g/l glucose - 4 g/l agar - pH 5.2 - Acetosyringone (0; 50; 100 µM) (b sung sau khi h p kh trùng)
5 PH N 2. GIEO H T I. V t l i u - H t ã kh trùng và ngâm qua êm. - D ng c nuôi c y mô: pince, dao c y, èn c n, … - ĩa petri (h p nh a) ch a môi trư ng agar. II. Cách ti n hành Lo i b l p v ngoài (seed coat) c a h t u xanh và t h t vào môi trư ng agar (10 g/l). Hình 2. Hình thái c a th c v t 1 lá m m và 2 lá m m
6 PH N 3. TÁCH TR DƯ I LÁ M M (hypocotyl) và TĂNG SINH VI KHU N I. V t l i u - H t gi ng ã n y m n. - D ng c nuôi c y mô: pince, dao c y, èn c n, … - ĩa petri (h p nh a) ch a môi trư ng agar. - ĩa petri ch a môi trư ng ti n nuôi c y. - Fancol 15ml. - Môi trư ng LB. II. Cách ti n hành C t tr dư i lá m m t i i m m t lá m m (cotyledonary node) b ng cách lo i b tr trên lá m m (epicotyl) và r m m (radicle). Sau ó t các tr dư i lá m m (kích thư c trung bình 0,5 – 0,6 cm) trong ĩa petri ch a môi trư ng ti n nuôi c y (pre- culture medium) trong i u ki n chi u sáng. Nhân sinh kh i vi khu n Agrobacterium tumefaciens trong môi trư ng LB trên 280C, qua êm. máy l c v i v n t c 150 vòng/phút,
7 PH N 4. NG NUÔI C Y TR DƯ I LÁ M M VÀ VI KHU N I. V t l i u - Tr dư i lá m m. - Vi khu n. - D ng c nuôi c y mô: pince, dao c y, èn c n, … - ĩa petri (h p nh a) ch a môi trư ng agar. - ĩa petri ch a môi trư ng ng nuôi c y. - Fancol 15ml. II. Cách ti n hành a. Thu sinh kh i vi khu n - o OD (optical density) vi khu n bư c sóng 600nm (blank b ng môi trư ng LB). Khi giá tr OD 0,6 – 1 thì ti n hành chuy n gen (1 OD tương ương kho ng 3 x 109 bacteria/ml). 3000rpm trong 10 phút, 240C. - Ly tâm trong ng fancol 15ml - Thu t a, hòa tan trong môi trư ng . b. ng nuôi c y - Cho tr dư i lá m m (t o v t thương/không t o v t thương) vào môi trư ng trong th i gian t 10’ – 30’ (tùy theo nghi m th c). - Sau th i gian , c y m u vào môi trư ng ng nuôi c y ch a các n ng Acetosyringone khác nhau, trong th i gian 3 ngày (Xem b ng dư i ây) B trí thí nghi m Th i gian 10’ 20’ 30’ Không t o v t thương 30 30 30 30 30 30 30 30 30 ( m u) T ov t 30 30 30 30 30 30 30 30 30 thương (m u) Acetosyringone 0 50 100 0 50 100 0 50 100 (µM)
8 PH N 5. NHU M VÀ QUAN SÁT M U I. V t l i u - D ng c c y mô - Nư c c t - Phosphate buffer - Equilibration buffer II. Cách ti n hành - Sau 3 ngày ng nuôi c y, các tr m m ư c r a b ng nư c c t ti t trùng cho s ch vi khu n, c t b nh ng ph n d p nát, ch tr m m ra làm ôi và vi phosphate - buffer trong 5 phút. 370C qua - Lo i b phosphate buffer, tr m m b ng Equilibration buffer êm. - L y tr m m ra soi dư i kính hi n vi quan sát màu xanh chàm (s n ph m ph n ng c a enzyme β–glucuronidase v i X-gluc). Hình 3. Ph n ng t o ra s n ph m 5,5’-dibromo-4,4’-dicloro-indigo có màu xanh.
9 PH L C 1. Thành ph n môi trư ng LB (Lauria Broth) (Sambrook et al. , 1989) - 10 g/l tryptone - 5 g/l yeast extract - 8 g/l NaCl - pH 7.2 2. Phosphate buffer 0,1 M NaH2PO4 10ml stock/100ml 0,1 M Na2HPO4 10ml stock/100ml 10 mM EDTA 2ml stock/100ml 0.5mM K-ferrocyanide (K4[Fe(CN)6] 10ml stock/100ml 0.5mM K-ferricyanide (K3[Fe(CN)6] 10ml stock/100ml 2% formaldehyde 0,1 % Trition X-100 i u ch nh pH 7.0 b ng KOH; b o qu n trong t i 4oC 3. Equilibration Buffer (b o qu n trong t i, 4oC) Phosphate – Buffer 100ml 1 mg / ml x-Gluc (hòa tan trong DMSO)