Tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc tủy răng người

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012<br /> <br /> TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI<br /> Trần Lê Bảo Hà*, Đoàn Nguyên Vũ*, Tô Minh Quân*, Nguyễn Thị Nhật Uyên*, Lê Thị Ngọc<br /> Hương*, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ*, Phan Kim Ngọc*, Nguyễn Thị Thư**, Đặng Vũ Ngọc Mai**,<br /> Hoàng Đạo Bảo Trâm**, Hoàng Tử Hùng**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện tủy răng là mô có chứa tế bào gốc. Tế bào gốc tủy<br /> răng là một nguồn tế bào dễ thu nhận vì không xâm lấn, có tiềm năng tăng sinh và biệt hóa cao, có thể được<br /> lưu trữ trong nhiều năm, tương tác tốt với nhiều loại vật liệu sinh học.<br /> Đối tượng và phương pháp: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thu nhận và khử trùng<br /> mô tủy răng người. Sau đó, tế bào tủy răng được phân lập và nuôi cấy. Sự hiện diện của quần thể tế bào<br /> gốc trong hỗn hợp tế bào sau nuôi cấy được xác định bằng phương pháp khảo sát sự tăng sinh và kỹ thuật<br /> Flow cytometry. Đồng thời, ngà răng cũng được sử dụng làm khung nâng đỡ cho tế bào gốc tủy răng.<br /> Kết quả: Kết quả cho thấy, chúng tôi đã thu nhận và nuôi cấy thành công tế bào gốc tủy răng người.<br /> Quần thể tế bào sau nuôi cấy biểu hiện các marker là CD13, CD44, CD90, CD105, CD166. Tế bào gốc tủy<br /> răng có khả năng tăng sinh trên bề mặt ngà đã xử lí bằng hóa chất.<br /> Kết luận: Với những kết quả đã đạt được, tế bào gốc tủy răng hứa hẹn sẽ là nguyên liệu quan trọng<br /> cho những nghiên cứu trong kỹ nghệ mô cũng như trong lĩnh vực nha khoa tái tạo.<br /> Từ khóa: Bề mặt ngà, nuôi cấy sơ cấp, flow cytometry, tế bào gốc, tủy răng người.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> APPLIED POTENTIAL OF HUMAN DENTAL PULP STEM CELLS<br /> Tran Le Bao Ha, Doan Nguyen Vu, To Minh Quan, Nguyen Thi Nhat Uyen, Le Thi Ngoc Huong,<br /> Nguyen Thi Ngoc My, Phan Kim Ngoc, Nguyen Thi Thu, Dang Vu Ngoc Mai,<br /> Hoang Dao Bao Tram, Hoang Tu Hung * Y hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 – No.1 – 2012: 10 - 17<br /> Background: Recently, scientists have found that dental pulp tissue contains stem cells. Dental pulp<br /> stem cells as a source of cells are easy to obtain for non-invasive, has the highly potential to grow and<br /> differentiate, can be stored for many years, interact well with many types of biomaterials.<br /> Materials and method: In this research, we performed the experiments to collect and disinfect human<br /> dental pulp tissue. Then, dental pulp cells are isolated and cultured. The presence of stem cell populations<br /> in cultured cells is determined by proliferation assay and Flow cytometry. Simultaneously, dentin was<br /> used as a scaffold for the dental pulp stem cells.<br /> Results: Results shown that we are successful in collection and culture of human dental pulp stem<br /> cells. Populations of cultured cells are positive for expression of CD13, CD44, CD90, CD105, CD166<br /> markers. Dental pulp stem cells can proliferate on chemically treated dentin surface.<br /> Conclusion: With the results achieved, dental pulp stem cells promises to be an important material for<br /> research in tissue engineering as well as in dental regeneration.<br /> Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia-thành phố Hồ Chí Minh<br /> Đại học Y Dược, thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS.Trần Lê Bảo Hà ĐT: 0988575507<br /> Email: tlbha@hcmus.edu.vn<br /> *<br /> <br /> **<br /> <br /> 10<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Keywords: dentin surface, primary culture, flow cytometry, stem cells, human dental pulp.<br /> DMEM/F12 (Sigma) bổ sung 10% FBS (huyết<br /> MỞ ĐẦU<br /> thanh thai bò-Gibco), 2mM L-glutamin,<br /> Trên thế giới, tế bào gốc tủy răng đã được<br /> 100U/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin.<br /> nuôi cấy thành công chỉ trong vài năm gần<br /> Xác định tính gốc của tế bào tủy răng<br /> đây và có khả năng ứng dụng rất cao. Đến<br /> người<br /> nay, đã có rất nhiều nghiên cứu về việc phân<br /> lập tế bào tủy răng của nhiều loài khác nhau.<br /> Đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt<br /> Các nghiên cứu này đã chứng minh tế bào gốc<br /> chai nuôi cấy<br /> tủy răng có khả năng tăng sinh cao và biệt<br /> Các tế bào được cấy chuyền sang đĩa 96<br /> hóa thành dạng tế bào khoáng hóa trong môi<br /> giếng với mật độ 104 tế bào/cm2. Mật độ tế bào<br /> trường thích hợp (Nakashima, 1991;<br /> được xác định mỗi ngày bằng buồng đếm tế<br /> Nakashima et al., 1994; Kettunen et al., 1998;<br /> bào cùng với thuốc nhuộm trypan blue.<br /> Buchaille et al., 2000; Yokose et al., 2000). Các<br /> Phương pháp Flow cytometry<br /> tế bào tủy răng được xác định là có biểu hiện<br /> Các tế bào ở lần cấy chuyền thứ tư được<br /> một số marker của tế bào gốc như STRO-1<br /> thu nhận bằng trypsin/EDTA 0,25%, điều<br /> (Shi, Gronthos, 2003; Shi et al., 2005), CD146<br /> chỉnh mật độ tế bào đạt 106 tế bào/ml. Huyền<br /> (Gronthos et al., 2003; Miura et al., 2004) và<br /> phù tế bào trong 1ml Facs Flow và nhuộm với<br /> Oct4 (Huang et al., 2006). Bên cạnh những<br /> 10µl kháng thể trong 30 phút ở nhiệt độ<br /> nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào gốc<br /> phòng (CD13-PE, CD44-PE, CD90-FITC,<br /> tủy răng, các khung nâng đỡ ba chiều như<br /> CD105-PE, CD166-PE, CD34-FITC, CD45-FITC,<br /> alginate, collagen, polymer, sứ… cũng được<br /> BD Sciences, San Jose, CA). Làm lạnh mẫu<br /> phát triển nhằm ứng dụng trong nha khoa tái<br /> trong 15 phút ở 40C. Tiến hành đánh giá<br /> tạo (Kumabe et al., 2006; Zhang et al., 2006;<br /> marker tế bào bằng máy FACS Calibur sử<br /> Young et al., 2002; Gronthos et al., 2002). Trong<br /> dụng phần mềm Cell Quest Pro.<br /> đó, khung nâng đỡ ngà răng được chứng<br /> Khảo sát sự tăng sinh của tế bào gốc tủy<br /> minh có khả năng cảm ứng tế bào gốc tủy<br /> răng người trên khung nâng đỡ ngà răng<br /> răng biệt hóa thành nguyên bào ngà (Huang et<br /> al., 2006).<br /> Khung nâng đỡ ngà răng được tạo ra từ<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> răng khôn người. Bề mặt của những khung<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> <br /> nâng đỡ ngà sẽ được xử lý lần lượt với các<br /> <br /> Răng cối nhỏ và răng khôn còn nguyên<br /> vẹn, không bị sâu thối tủy của người tình<br /> nguyện được thu từ Khoa Răng Hàm Mặt,<br /> Trường Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí<br /> Minh và Khoa Nội Nha, Bệnh viện Răng Hàm<br /> Mặt Thành phố Hồ Chí Minh. Răng được<br /> chứa trong lọ có dung dịch bảo quản.<br /> <br /> Phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào<br /> tủy răng<br /> Sau khi tách khỏi răng, mẫu tủy được cắt<br /> thành những mảnh nhỏ (2x2x1 mm) và được<br /> nuôi trong đĩa 35mm (Nunc) với môi trường<br /> <br /> hóa chất citric axit 19% trong 1 phút, EDTA<br /> 17% trong 10 phút để loại bỏ lớp mùn ngà.<br /> Hiệu quả của phương pháp xử lý bề mặt<br /> khung nâng đỡ ngà được đánh giá bằng kính<br /> hiển vi điện tử quét. Khung nâng đỡ ngà răng<br /> được đặt trong đĩa 96 giếng với môi trường<br /> nuôi cấy. Sau đó, các tế bào gốc tủy răng ở lần<br /> cấy chuyền thứ tư được cấy lên bề mặt ngà<br /> với mật độ 104 tế bào/cm2. Sự tăng sinh của tế<br /> bào được xác định bằng phương pháp MTT ở<br /> các ngày nuôi cấy thứ 2, 4, 6, 8, 10.<br /> <br /> 11<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Xử lý số liệu<br /> Số liệu thu nhận được xử lý theo chương<br /> trình Statgraphic 7.0 của Trường Đại học<br /> Michigan (Mỹ).<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Kết quả nuôi sơ cấp mô tuỷ răng<br /> Vào ngày nuôi cấy thứ 7, bắt đầu xuất<br /> hiện các tế bào trải; các tế bào có nhiều hình<br /> dạng khác nhau như dạng hình thoi, dạng kéo<br /> dài, dạng hình sao, dạng giống tế bào nội<br /> mô… Trong những ngày nuôi cấy sau đó, các<br /> dạng tế bào dần dần thu hẹp lại; dạng tế bào<br /> chiếm ưu thế là dạng tế bào trải rộng, nhân<br /> lớn hình oval và có nhiều đuôi bào tương.<br /> Ngày thứ 21, các tế bào bắt đầu hợp dòng, trải<br /> thành một lớp đơn phủ kín bề mặt đĩa nuôi,<br /> đây là thời điểm thích hợp để thu nhận tế bào<br /> (Hình 1).<br /> <br /> Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào<br /> trên bề mặt chai nuôi cấy<br /> <br /> ngày 6, đạt cao nhất vào ngày 6, sau đó giảm<br /> nhanh đến ngày 9.<br /> <br /> Kết quả xác định marker tế bào gốc<br /> Các tế bào tủy răng nuôi cấy ở thế hệ thứ<br /> tư được đánh giá sự biểu hiện marker bề mặt<br /> bằng Flow cytometry. Kết quả cho thấy, các tế<br /> bào ứng viên dương tính mạnh với các marker<br /> CD13 (99,97%), CD44 (99,84%), CD90 (97,34%),<br /> CD105 (91,95%), CD166 (98,18%) và âm tính<br /> với các marker CD34 (0,42%), CD45 (0,08%)<br /> (Hình 2).<br /> <br /> Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào<br /> gốc tủy răng người trên bề mặt ngà<br /> Kết quả đánh giá hiệu quả xử lý bề mặt ngà<br /> Dựa vào kết quả chụp kính hiển vi điện tử<br /> quét, chúng tôi nhận thấy rằng bề mặt ngà<br /> chưa xử lý bị bao phủ hoàn toàn bởi lớp mùn<br /> ngà nhưng khi được xử lý thì lớp mùn ngà đã<br /> được loại bỏ hoàn toàn và để lộ ra các ống<br /> ngà trên bề mặt (Hình 3).<br /> <br /> Đồ thị 1 cho thấy sau khi được cấy<br /> chuyền, tế bào tăng sinh mạnh từ ngày 2 đến<br /> <br /> A<br /> <br /> C<br /> <br /> 12<br /> <br /> B<br /> <br /> D<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 4<br /> <br /> 2<br /> <br /> Số tế bào (x 10 tế bào/cm )<br /> <br /> Hình 1. Tế bào mọc lan ra từ mảnh mô sau các ngày nuôi cấy. A. Mảnh mô tủy răng trong đĩa nuôi<br /> (100X); B. Tế bào tủy răng sau 7 ngày nuôi cấy (100X); C. Tế bào tủy răng sau 15 ngày nuôi cấy (100X);<br /> D. Tế bào tủy răng sau 21 ngày nuôi cấy (100X).<br /> <br /> Thời gian<br /> <br /> 13<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Số 1 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Đồ thị 1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng người nuôi cấy.<br /> <br /> Hình 2. Kết quả phân tích Flow cytometry của tế bào tủy răng ứng viên.<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 3. Hình chụp bề mặt ngà răng bằng kính hiển vi điện tử quét. A. Bề mặt ngà răng chưa xử lý<br /> (1000X); B. Bề mặt ngà răng đã xử lý (2000X).<br /> <br /> Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào gốc tủy răng người trên khung nâng đỡ ngà răng<br /> 14<br /> <br />